Name: production of high-titer recombinant newcastle disease virus from allantoic fluid
Uploaded: 2022-05-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid at JoVE.com

J.G.E.Y, Ontario Veteriner Koleji Doktora Bursu ve Ontario Yüksek Lisans Bursu aldı. Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından SKW'ye (hibe #304737) ve LS'ye (hibe #401127) Keşif Hibeleri tarafından finanse edilmiştir.

Hayvanların kullanımını içeren tüm çalışmalar, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'ne uygun olarak Guelph Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm çalışmalar, mezojenik NDV'nin Risk Grubu 2 Patojeni olduğu Kanada'daki bir Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL2) laboratuvarında gerçekleştirilir. NDV'nin amplifikasyonu ve saflaştırılmasında yer alan tüm adımlar, güvenlik ve sterilite amacıyla bir Tip IIA biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.
<p class="jove_title"...

<ol>
	<li>Kim, S. H., Samal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+development+of+human+and+veterinary+vaccines.">Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines.</a> Viruses. 8 (7), (2016).</li><li>Kortekaas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rift+Valley+fever+virus+immunity+provided+by+a+paramyxovirus+vaccine+vector.">Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector.</a> Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).</li><li>Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+paramyxoviruses:+mechanism+of+action,+preclinical+and+clinical+studies.">Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies.</a> Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).</li><li>Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+(NDV):+brief+history+of+its+oncolytic+strains.">Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.</a> Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).</li><li>Matuszewska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+vascular+normalization+with+an+oncolytic+virus+enhances+immunotherapy+in+a+preclinical+model+of+advanced-stage+ovarian+cancer.">Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer.</a> Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).</li><li>McAusland, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+vanadyl+sulfate+with+Newcastle+disease+virus+potentiates+rapid+innate+immune-mediated+regression+with+curative+potential+in+murine+cancer+models.">Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).</li><li>Warner, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+vaccination+with+a+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccine+protects+hamsters+from+SARS-CoV-2+infection+and+disease.">Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease.</a> iScience. 24 (11), 103219 (2021).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+(NDV)+expressing+the+spike+protein+of+SARS-CoV-2+as+a+live+virus+vaccine+candidate.">Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate.</a> EBioMedicine. 62, (2020).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Newcastle+disease+virus+(NDV)+expressing+a+membrane-anchored+spike+as+a+cost-effective+inactivated+SARS-CoV-2+vaccine.">A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine.</a> Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).</li><li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Newcastle+disease+virus+mediated+dendritic+cell+activation+and+cross-priming+tumor-specific+immune+responses+ex+vivo.">Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo.</a> International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).</li><li>Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newcastle+disease+virus+at+the+forefront+of+cancer+immunotherapy.">Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy.</a> Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).</li><li>Ricca, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-existing+immunity+to+oncolytic+virus+potentiates+its+immunotherapeutic+efficacy.">Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy.</a> Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).</li><li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+oncolytic+virotherapy+overcomes+systemic+tumor+resistance+to+immune+checkpoint+blockade+immunotherapy.">Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).</li><li>Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+therapy+resistance:+an+update+on+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+improvements+of+cancer+therapy.">Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy.</a> Biomedicines. 7 (3), (2019).</li><li>Santry, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+high-titer+Newcastle+disease+virus+for+use+in+preclinical+mouse+models+of+cancer.">Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).</li><li>Cassel, W. A., Murray, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-year+follow-up+on+stage+II+malignant+melanoma+patients+treated+postsurgically+with+Newcastle+disease+virus+oncolysate.">A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate.</a> Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).</li><li>Plitt, T., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+therapy+with+Newcastle+disease+virus:+rationale+for+new+immunotherapeutic+combinations.">Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations.</a> Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).</li><li>Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Newcastle+disease+virus+by+Vero+cells+grown+on+cytodex+1+microcarriers+in+a+2-litre+stirred+tank+bioreactor.">Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2010, (2010).</li><li>Blom, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+chromatographic+reduction+of+ovalbumin+for+egg-based+influenza+virus+purification.">Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification.</a> Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).</li><li>Hegde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture-based+influenza+vaccines:+A+necessary+and+indispensable+investment+for+the+future.">Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).</li><li>Fulber, J. P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+development+for+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccines+in+serum-free+vero+cell+suspension+cultures.">Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures.</a> Vaccines. 9 (11), 1335 (2021).</li><li>Ungerechts, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+oncolytic+viruses+into+the+clinic:+clinical-grade+production,+purification,+and+characterization+of+diverse+oncolytic+viruses.">Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 3, 16018 (2016).</li><li>Ayllon, J., Garc&#237;a-Sastre, A., Mart&#237;nez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+recombinant+Newcastle+disease+virus+from+cDNA.">Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830 (2013).</li><li>Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P+and+M+gene+junction+is+the+optimal+insertion+site+in+Newcastle+disease+virus+vaccine+vector+for+foreign+gene+expression.">P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression.</a> The Journal of General Virology. 96, 40-45 (2015).</li><li>van Vloten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+high-titer+OrfV+for+preclinical+studies+in+vaccinology+and+cancer+therapy.">Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 23, 434-447 (2021).</li><li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+50%+endpoint+titer+using+a+simple+formula.">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85 (2016).</li><li>Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Ulster+strain+Newcastle+disease+virus+hemagglutinin-neuraminidase+reveals+auto-inhibitory+interactions+associated+with+low+virulence.">Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence.</a> PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).</li><li>Sheets, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion+on+adventitious+agents+testing+for+vaccines:+Why+do+we+worry+so+much+about+adventitious+agents+in+vaccines.">Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines.</a> Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).</li><li>Chung, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+allergies.">Vaccine allergies.</a> Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50 (2014).</li><li>Schirrmacher, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifty+years+of+clinical+application+of+Newcastle+disease+virus:+time+to+celebrate.">Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate.</a> Biomedicines. 4 (3), (2016).</li><li>Ajamian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL5+persists+in+RSV+stocks+following+sucrose-gradient+purification.">CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).</li><li>Axis-Shield. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells. , (2020).</li><li>Mita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiproinflammatory+effects+of+iodixanol+(OptiPrep)-based+density+gradient+purification+on+human+islet+preparations.">Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations.</a> Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).</li><li>Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+respiratory+syncytial+virus+by+ultracentrifugation+in+iodixanol+density+gradient.">Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient.</a> Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+purification+of+Citrus+yellow+vein+clearing+virus+by+sucrose+cushion+ultracentrifugation.">A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation.</a> Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).</li><li>Zhao, H., Peeters, B. P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector:+Effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication.">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).</li><li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modification+of+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy.">Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy.</a> Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).</li><li>Chen, T. -. F., Jang, J. -. W., Miller, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STABLE+AND+FILTERABLE+ENVELOPED+VIRUS+FORMULATIONS+STABILE+UND+FILTERBARE+EINGEH&#220;LLTE+VIRUSFORMULIERUNGEN+FORMULATIONS+DE+VIRUS+ENVELOPP&#201;S+FILTRABLES+ET+STABLES+(84).">STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEH&#220;LLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPP&#201;S FILTRABLES ET STABLES (84).</a> EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , 1-14 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+amino+acid+sequence+diversity+at+the+F+protein+cleavage+site+of+Newcastle+disease+virus+in+fusogenic+activity.">Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity.</a> PLOS ONE. 12 (9), 0183923 (2017).</li></ol>

Preklinik çalışmalarda terapötik ajanlar olarak kullanılan virüsler, in vivo15 uygulandığında toksisiteyi önlemek için yüksek oranda saflaştırılmalıdır. Maceracı ajanlar veya kirleticiler uzaklaştırılmazsa, bu viral ajanın terapötik etkisini reddeden ciddi advers reaksiyonlara yol açabilir28. NDV embriyonlanmış tavuk yumurtasında üretildiğinden, preklinik veya klinik modellerde in vivo kullanılmadan önce çıkarılması gerek...

Avian Orthoavulavirus-1 olarak da bilinen Newcastle Hastalığı Virüsü, hem onkolitik bir virüs hem de viral vektörlü bir aşı 1,2,3,4,5,6,7 olarak kullanılma potansiyeline sahip zarflı bir kuş paramiksovirüsüdür. Son zamanlarda, SARS-CoV-2'nin başak proteinini ifade etmek için tasarlanan NDV, fare ve hamster meydan okuma modelleri 7,8,9'da etkili bir burun içi aşı olarak karakterize edilmiştir. Bir kanser immünoterapisi olarak kullanıldığında, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin, özellikle doğal öldürücü hücrelerin, tip I interferon üretiminin ve antitümöre özgü T hücrelerinin10,11,12,13 üretilmesinin işe alınmasıyla sonuçlanır. Bu güçlü immünostimülatör özelliklere ek olarak, NDV güçlü bir güvenlik profiline ve iyi kurulmuş bir ters genetik sisteme sahiptir14,15. Bu arzu edilen özellikler, çok sayıda klinik öncesi ve insan klinik çalışmasında NDV'nin değerlendirilmesini sağlamıştır (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Bu son derece umut verici, bağışıklık uyarıcı viral vektörü daha da ilerletmek için, in vivo olarak güvenle uygulanabilen yüksek titreli, ultra saf NDV'nin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı yöntemlere ihtiyaç vardır.
NDV bir kuş paramiksovirüsü olduğundan, embriyonlanmış tavuk yumurtasında en sık çoğaltılır. NDV'yi yaymak için hücre bazlı sistemler mevcut olsa da, çoğu embriyonlanmış tavuk yumurtasında elde edilene benzer titreler üretememiştir18. Bununla birlikte, yumurta bazlı üretimin uzun olması ve kolayca ölçeklendirilememesi, büyük miktarlarda SPF tavuk yumurtası tedarik edilmesinin sorunlu olabileceği ve yumurta alerjenleri ile kontaminasyon potansiyelinin bulunması da dahil olmak üzere yumurtalarda NDV üretmenin bazı dezavantajları vardır13,18,19,20 . Son zamanlarda, bir grup, serumsuz ortamda süspansiyonda yetiştirilen Vero hücrelerinin, NDV'nin saflaştırma21'den önce yumurtalarda elde edilenlerle karşılaştırılabilir titrelere replikasyonunu destekleyebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, bu, virüsü Vero hücrelerine adapte etmek için virüsün seri geçişini gerektiriyordu ve NDV'yi süspansiyon Vero hücrelerinden arındırmak için bir yöntemin optimizasyonu hala gereklidir21.
Daha önce de vurgulandığı gibi, yüksek titreli, in vivo dereceli virüsü arındırmak için kullanılan yöntemler, soru22'deki virüse bağlı olarak değişir. Rekombinant NDV'nin üretimi için iyi kurulmuş bir ters genetik sistemi mevcuttur. Bir cDNA klonu, yardımcı plazmidler ve T7 RNA polimerazı eksprese eden bir yardımcı virüsün kullanımını içeren bu süreç, daha önceayrıntılı olarak 15,23 olarak tanımlanmıştır. Bu protokol lentojenik veya mezojenik NDV'ye uygulanabilir. Bu protokolde tanımlanan virüs, viral P ve M genleri arasına yerleştirilen denizanası Aequorea victoria'dan gelen yeşil floresan proteinini (GFP) bireysel bir transkripsiyon birimi olarak kodlayan rekombinant bir mezojenik NDV'dir, çünkü bu daha önce yabancı transgen yerleştirme24 için en uygun yer olarak tanımlanmıştır.
Kapalı yöntemler, NDV'nin saflaştırılmasını, 100 ila 500 nm arasında değişen boyutuna ve yoğunluğuna15 göre özetlemektedir. Bu, yumurtaların alındığı andan itibaren son bir titreye sahip olmaya kadar yaklaşık 3 hafta içinde in vivo dereceli, yüksek titreli NDV stoklarının üretilmesine izin vermiştir. Teğetsel akış filtrasyonu, derinlik filtrasyonu ve yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme gibi yumurta bazlı virüslerin büyük ölçekli üretiminde sıklıkla kullanılan teknikler tanımlanmıştır ve bu yöntemlerin daha büyük ölçekli üretime çevrilmesini sağlar. NDV'nin saflaştırılması için daha önce tarif edilen teknikler, virüs stabilize edici bir tamponun dahil edilmesi, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme sırasında iyodiksantal kullanımı ve in vivo-grade kalite15'i sağlamak için çeşitli kalite kontrol önlemlerinin tanımlanması ile geliştirilmiştir. Bu, 0,8 ila 1,0 L allantoik sıvıdan 3 × 1010 PFU / mL'ye kadar ulaşan titrelere ulaşan in vivo dereceli NDV'nin saflaştırılmasına izin vermiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30042.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Slip-Tip Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Povidone Iodine Solution</td>
			<td>LORIS</td>
			<td>109-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14955240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G x 1 1/2 in Blunt Fill Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G x 1 1/2 in Precision Glide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 5/8 in Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>03446I-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde-PBS</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>J19943-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Tissue Culture Plate - Flat Bottom</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>A87-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-14 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B08861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach (5%)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>36-102-0599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad, unserrated tipped forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>09-753-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114405-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centramate Cassette Holder</td>
			<td>PALL</td>
			<td>CM018V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-259</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP101-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DF1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-12203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet Gel Recovery</td>
			<td>ClearH2O, INC</td>
			<td>72-01-1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital 1502 Sportsman Egg Incubator</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>1502W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Candler</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>A46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP82031GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, pH 8.0, 0.5 M in H2O</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Threaded Tee fittings, nylon, 1/8 in NPT(F)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06349-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>ZEISS AXIO</td>
			<td></td>
			<td>Not necessary if not performing IFA or if NDV does not encode a fluorescent protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry System Freezone 4.5</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GiBOX Gel Imager</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td>Imaging of Agarose Gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>G33-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Glucose Dulbecco&#39;s Modified Essential Medium</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Kit</td>
			<td>Berry Hill</td>
			<td>3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodixanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine Monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62929-100G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male and Female Luer-Lok a 1/8 in national pipe thread, NPT</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>41507-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-07522-20</td>
			<td>Peristaltic Pump with digital display</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy Load Pump Head for Precision Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>RK-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Silicon tubing (Platinum) L/S 16</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96420-16</td>
			<td>BioPharm Platinum-Cured Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC Pro 5 Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP950040025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td>SDS-PAGE cast and running appartus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Anti-NDV</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-11633</td>
			<td>Clone 6H12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>85124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K</td>
			<td>PALL</td>
			<td>OS100T02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OWL Easycast B1A Mini Gel Electrophoresis System</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X Solution</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(Ethylene Glycol) Average Mn 20,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81300-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowePac 300</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Model 1655050 - for Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA Amp Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RedSafe</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>50999562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-a-lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength), 10,000 MWCO 0.5-3 mL</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>66380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (Pellets)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>S318-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific pathogen free eggs</td>
			<td>CFIA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Supplier will vary depending on location</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supracap 50 Depth Filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>SC050V100P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sw41Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used in protocol step 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SX4750 Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SxX4750 Adaptor for Concial-Bottom Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>359472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15524-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-Wall Ultraclear centrifuge tubes (9/16 in x 3 1/2 in)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Screw Clamp</td>
			<td>PALL</td>
			<td>88216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Utility Pressure Gauges</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>68355-06</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of high-titer recombinant newcastle disease virus from allantoic fluid

Kuş ortoavulavirüs serotip-1 olarak da bilinen Newcastle hastalığı virüsü (NDV), hem onkolitik bir virüs hem de viral vektörlü bir aşı olarak geliştirilmiş negatif anlamlı, tek sarmallı bir RNA virüsüdür. NDV, iyi kurulmuş ters genetik sistemi, güçlü immünostimülatör özellikleri ve mükemmel güvenlik profili nedeniyle çekici bir terapötik ve profilaktik ajandır. Onkolitik bir virüs veya viral vektörlü bir aşı olarak uygulandığında, NDV, bağışıklık sisteminin hem doğuştan gelen hem de adaptif kollarını aktive eden sağlam bir antitümör veya antijene özgü bağışıklık tepkisi ortaya çıkarır. 
Bu arzu edilen özellikler göz önüne alındığında, NDV çok sayıda klinik çalışmada değerlendirilmiştir ve en iyi çalışılmış onkolitik virüslerden biridir. Şu anda, NDV'yi içeren iki kayıtlı klinik çalışma vardır: biri SARS-CoV-2 (NCT04871737) için rekombinant NDV vektörlü bir aşıyı değerlendirirken, ikincisi bir antiPD-L1 antikoru (NCT04613492) olan Durvalumab ile kombinasyon halinde Interlökin-12'yi kodlayan bir rekombinant NDV'yi değerlendirmektedir. Bu son derece umut verici viral vektörün daha da ilerlemesini kolaylaştırmak için, yüksek titreli, in vivo dereceli, rekombinant NDV (rNDV) üretmek için basitleştirilmiş yöntemlere ihtiyaç vardır. 
Bu yazıda, belirtilen patojensiz (SPF) embriyonlanmış tavuk yumurtalarında rNDV'nin güçlendirilmesi ve rNDV'nin allantoik sıvıdan arındırılması için ayrıntılı bir prosedür açıklanmakta ve saflaştırma sırasında kaybı azaltmak için iyileştirmeler yapılmaktadır. Ayrıca, kirletici madde eksikliğini ve virüs bütünlüğünü doğrulamak için yapılması gereken önerilen kalite kontrol tahlillerinin açıklamaları da dahildir. Genel olarak, bu ayrıntılı prosedür, klinik öncesi çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek titreli, in vivo-grade, rekombinant, lentojenik ve mezojenik NDV'nin sentezini, saflaştırılmasını ve depolanmasını sağlar.

Allantoik sıvı hasadı Allantoik sıvı embriyonlanmış tavuk yumurtasından toplandığından, net ve şeffaf görünmelidir. Sıvı opak ve sarı görünüyorsa, bu kirleticilerin varlığını gösterir. Saflaştırma sırasında bu allantoik sıvının dahil edilmesi, basınç, virüsün kesilmesine ve bulaşıcı virüsün kaybına neden olacak şekilde hızla yükselip 10 psi'yi geçeceğinden, saflaştırma işlemini engelleyecektir. Kanlı görünen allantoik sıvı, yumurtaların çok fazl...

Watch this Scientific Journal Video about Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid at JoVE.com

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Burada, yüksek titreli rekombinant Newcastle hastalığı virüsünün üretimi, saflaştırılması ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak > 6 × 109 plak oluşturan birim / mL verir ve in vivo hayvan çalışmaları için uygun virüs miktarlarını sağlar. İn vivo güvenliği sağlamak için ek kalite kontrol testleri açıklanmaktadır.

Allantoik Sıvıdan Yüksek Titerli Rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Üretimi

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Bu protokol, Newcastle Hastalığı Virüsü üretmek için kullanılan teknikleri özetler, böylece farelere ve hamster ve koyun gibi diğer hayvanlara güvenli bir şekilde uygulanabilir. Teğetsel akış filtrasyonunun kullanılması, büyük başlangıç hacimlerinin yalnızca santrifüjleme proseslerini kullanan mevcut prosedürlere kıyasla daha verimli bir şekilde işlenmesini sağlar. Bu, birkaç karmaşık adımı içeren uzun bir prosedürdür, yani zaman yönetimi bir sorun olabilir.Tüm potansiyel duraklama adımlarını tanımlamanızı tavsiye ederim, böylece teknik uygun şekilde bölünebilir ve stresi en aza indirebilir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Alex olacak. Newcastle Hastalığı Virüsü veya NDV'nin saflaştırılması için, ilk olarak, 50 mililitre PBS çalıştırarak önceden ayarlanmış deneysel sistemi hazırlayın.Tüpte yaklaşık beş mililitre PBS kaldığında pompayı durdurun. Ardından, boruya bir ila üç mikromolar tutma derecesine sahip bir derinlik filtresi takın. Filtreyi havalandırmak için, derinlik filtresinin epik tarafındaki ikinci kapağı çıkarın ve ardından sistemden ilave 50 mililitre PBS çalıştırmaya başlayın.PBS, filtrenin üst kısmındaki havalandırma deliğinden akmaya başladığında, bağlantı noktasını kapatın ve PBS'yi hatlar boyunca akmaya devam edin. Bundan sonra atık kabı yeni bir steril toplama kabı ile değiştirin ve Allantoik Sıvıyı derinlik filtresinden geçirmeye başlayın. Daha sonra, teğetsel akış filtrasyonunu veya TFF sistemini açık bir onayda kurun ve makalede açıklandığı gibi çalıştırın.Rezervuarda yaklaşık beş mililitre sıvı kaldığında, pompayı duraklatın ve rezervuara derinlik filtrelenmiş Allantoik Sıvı ekleyin. Ardından pompa akışına devam edin. Virüsün kesilmesini önlemek için, sistemin basıncının inç kare başına 10 pound kuvvetini geçmemesini sağlamak önemlidir.İllüzyonu arttırmak için, peristaltik pompanın ve C-kelepçesinin hızının bir kombinasyonu kullanılmalıdır. Rezervuarda 150 ila 100 mililitre Allantoik Sıvı bırakılır, pompayı duraklatın ve 150 ila 200 mililitre ML tamponu ekleyerek tamponu değiştirin. Yine, rezervuarda beş ila 10 mililitre sıvı bırakıldığında pompayı duraklatın, ardından iki C kelepçesi kullanarak beli kapatın.Rezervuarı besleyen retented hattı ayırın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Ardından akışa devam edin ve rezervuar tankında birkaç damla sıvı kaldığında duraklatın. Ardından, C kelepçelerini atık hatlarından çıkarın ve geri çekilmiş besleme hattını rezervuar tankına yeniden takın.Bu arada, iyotiksanol yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemeye hazırlanmak için, önce 13.2 mililitrelik açık üst ince duvarlı ultra santrifüj tüpüne 0.5 mililitre% 40 iyodiksantal ekleyin. Daha sonra kolonu, 2.5 mililitre% 20 iyodiksanol ve% 10 iyodiksanol 2.5 mililitre art arda ilavelerle hazır hale getirin. Ultrasantrifüjlemeden önce, TFF sisteminden ima edilen altı ila 6,5 mililitre virüs çözeltisini, gradyanı bozmadan iyotiksanol kolonuna dikkatlice ekleyin.Ultra santrifüjlemeden sonra, tüpleri bir çift steril forseps ile çıkarın. Hedef bant %10 ile %20 gradyanlar arasında büyük bir bant olmalıdır. Ardından, bir imbik standı kullanarak tüpü bir beherin üstüne asın.Bundan sonra, beş mililitrelik bir şırıngaya 18 gauge'lik 1,5 inçlik bir iğne takın, ardından ultrasantrifüj tüpünün kenarını iğneyle delin ve pistonu yavaşça uzatarak hedef bandı çıkarın. Makalede açıklandığı gibi virüs çözeltisinden iyodiksanol çıkarıldıktan sonra, virüsü bir diyaliz kasetine dikkatlice enjekte etmek için bir şırınga kullanın. Virüs çözeltisini konsantre etmek için, diyaliz kasetini diyaliz tamponundan çıkarın ve küçük bir sızdırmaz plastik torbaya koyun.Daha sonra torbaya 15 ila 25 mililitre% 40 polietilen glikol ekleyin, böylece diyaliz kaseti tamamen suya batırılır. Diyalizden sonra diyaliz kasetini PBS ile kısa bir süre durulayın. Ardından, 18 gauge'lik 1,5 inçlik bir iğne ile donatılmış bir şırıngayı hava ile doldurun, şırıngayı diyaliz kasetine yerleştirin ve pistonu itin.Virüsü çıkarmak için aparatı verilen havanın hiçbirini çıkarmadan döndürün. Membrana yapışan artık virüsü yerinden çıkarmak için, zara zarar vermeden eldivenli parmaklarla dikkatlice masaj yapın. Yerinden çıkarma işlemini kolaylaştırmak için, diyaliz kasetindeki fazla havanın bir kısmını çıkarın.Kalite kontrol tahlilleri için, ilk olarak, 1,5 mililitrelik bir tüpte 990 mikrolitre PBS'ye 10 mikrolitre ekleyerek virüs çözeltisini 100 kez seyreltin. Ardından, önceki seyreltmenin 100 mikrolitresini 900 mikrolitre PBS'ye ekleyerek seri seyreltmeye devam edin. Enfeksiyon tahlilleri için, 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna her sanrıdan 20 mikrolitre ekleyin.Yeşil floresan proteininin sitopatik etkisini incelemeden veya dolaylı bir immünofloresan testi yapmadan önce, plakayı en az 48 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu protokol kullanılarak, viral proteinlerin sodyum do sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ile gösterildiği gibi yüksek saflıkta NDV elde edildi. Bu yöntemle saflaştırılan virüsün enfektivitesi, 96 kuyu plakasında yapılan %50 doku kültürü enfeksiyonu dozu veya TCID50 testi ile de doğrulanmıştır.TCID50, Spearman-Karber hesap makinesi kullanılarak her seyreltme için pozitif kuyu sayısından belirlendi. Enfeksiyon testi, lentojenik ve mezojenik NDV'nin DF bir hücreleri üzerindeki sitopatik etkileri arasındaki farkı 10 ve 24 saatlik inkübasyondan sonra farklı koşullar altında ortaya koymuştur. İmmüno-floransa testi, Vero hücrelerinin lentojenik NDV ile enfeksiyonunun incelenmesinde de etkiliydi.Deney sistemini hazırlarken, herhangi bir artık sodyum hidroksit virüsü inaktive edeceğinden hatların etkili bir şekilde astarlandığından emin olun. Ayrıca, membran bütünlüğünü korumak için de önemlidir, çünkü bundan ödün vermek virüs saflaştırmasını ve verimini önemli ölçüde bozacaktır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

Tedavi Oncolytic virusu modüle ana faktörleri tanımlamak için genom çapında RNAi tarama

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Kanser Araştırmaları

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Kombine Koşullu Knockdown ve Uyarlanmış Küre Oluşumu Çalışma Hasta Kaynaklı Mide Kanseri Kök Hücrelerin bir Stemness-Associated Gene Çalışma

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Leptomeningeal Hastalığın Doğrudan Hedefli Tedavisini Incelemek için Bir Murine Ommaya Xenograft Modeli

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...