2.8K Views
•
10:23 min
•
November 4th, 2022
DOI :
November 4th, 2022
•0:04
Introduction
0:59
Preparation of Microfluidic Organ Chip Devices
1:31
Seeding of viECs and Intermediate Mesoderm Cells into the Microfluidic Device
7:15
Podocyte Induction and Chip Maintenance
8:03
Results: Differentiation of viECs and Podocytes on Organ-On-A-Chip Device
9:35
Conclusion
Transcript
Den isogene glomeruluschip vil muliggøre patientspecifik sygdomsmodellering og nefrotoksicitetstest og avancerede præcisionsmedicinske applikationer. Glomerulært epitel og endotel er afledt af en enkelt population af humaninducerede pluripotente stamceller eller IPSC'er. IPSC'er har ubegrænset selvfornyelse og kan differentiere sig til næsten enhver celletype.
Denne teknik kan bruges til at vurdere patologiske cellulære fænotyper og sygdom. Den patientspecifikke organchip kan også fungere som en platform for lægemiddelscreening og mekanistiske undersøgelser. Denne model kan anvendes til udvikling af en krop på et chipsystem, der er tilpasset en bestemt patient.
Dette system har potentialet til at forudsige patientspecifikke reaktioner forud for klinisk test. Begynd med forsigtigt at tilføje 25 mikroliter kældermembranmatrix 2-opløsning til urinkanalen og 20 mikroliter i chipets kapillærkanal. Tag to sterile 15 ml koniske rørhætter og fyld dem med 500 mikroliter sterilt destilleret vand.
Læg hætten i petriskålen for at forhindre tørring, og læg låget på fadet. Inkuber det ved 37 grader Celsius natten over. Fortsæt med at opsuge mediet fra T75-kolber, der indeholder en 15-dages kultur af vaskulære endotelceller ved 90% sammenløb.
Tilsæt fem milliliter celleløsningsbuffer og inkuber ved 37 grader Celsius i fem til syv minutter. Overfør derefter cellerne til et 15 ml konisk rør og tilsæt fem milliliter DMEM / F-12. Centrifuge ved 200 gange G i fem minutter.
Fjern supernatanten og suspender cellerne i 300 mikroliter endotelvedligeholdelsesmedium. Tæl cellerne med et hæmocytometer for at opnå ca. 2 millioner celler. Brug en P200-barrierespids til at skylle både de øverste og nederste kanaler i den mikrofluidiske chip med 200 mikroliter DMEM/F-12, mens den samtidig suges ud af udløbets periferi.
Hold chippen fast med P200-barrierespidsen fastgjort til aspiratoren væk fra udløbet af den nederste kanal. Indsprøjt 20 mikroliter af den vaskulære endotelcellesuspension fast i chippens kapillærkanal og opsæt forsigtigt mediet fra udløbets periferi. Kontroller under mikroskopet for bobler eller en ujævn såtæthed.
Vend forsigtigt chippen om, så cellerne kan klæbe til den basale side af den fleksible PDMS-membran. Anbring chippen i holderpatronen, og tilsæt tre milliliter PBS i patronen for at forhindre membranen i at tørre. Inkuber chippen ved 37 grader Celsius i tre timer.
Kontroller den nederste kanal under mikroskopet for et sammenflydende lag af celler fastgjort til den fleksible PDMS-membran. Vask de ikke-vedhæftede celler ved at tilsætte 200 mikroliter endotelvedligeholdelsesmedium på indløbet af den nederste kanal, mens du suger fra periferien af kapillærkanaludløbet. Læg chippen tilbage i holderpatronen, og inkuber ved 37 grader Celsius natten over.
Den næste dag skylles forsigtigt kapillærkanalen med 200 mikroliter endotelvedligeholdelsesmedium. Skyl urinkanalen med 200 mikroliter DMEM/F-12 og slip 50 mikroliter DMEM/F-12 på indløbs- og udløbsportene. Fortsæt mellemliggende mesodermceller, udskift det mellemliggende mesoderminduktionsmedium fra hver brønd i 12-brøndpladen med en milliliter Trypsin EDTA og inkuberes ved 37 grader Celsius i fem minutter.
Skrab forsigtigt cellerne ved hjælp af en celleløfter og dissocier cellerne ved hjælp af pipettering. Tilsæt to milliliter Trypsin-neutraliseringsopløsning til hver brønd og overfør cellerne til et 50 ml konisk rør. Cellesuspensionens volumen fyldes til 50 ml med DMEM/F-12 og centrifugeres ved 200 gange G i fem minutter.
Aspirer supernatanten og resuspenderer cellerne i 500 mikroliter mellemliggende mesoderm induktionsmedium for at opnå ca. 3 millioner celler. Tæl cellerne med et hæmocytometer. Hold chippen og injicer 25 mikroliter cellesuspension fast i chippens urinkanal, mens mediet forsigtigt opsuges fra udløbets periferi.
Kontroller for bobler eller ujævn cellesåtæthed. Tilsæt tre milliliter PBS i chipholderpatronen og inkuber ved 37 grader Celsius i tre timer. Efter inkubation skylles begge kanaler med 200 mikroliter af deres respektive cellekulturmedium.
Fastgør tomme P200-barrierespidser i begge udløb af urin- og kapillærkanalerne. Pipetter 200 mikroliter endotelvedligeholdelsesmedium og injicer halvdelen af det i kapillærkanalindløbet. Slip pipettespidsen inde i indløbet, således at både kanalens indløb og udløb er fastgjort til pipettespidser fyldt med medium.
Gentag denne procedure for urinkanalindløbet med 200 mikroliter mellemliggende mesoderm vedligeholdelsesmedium. Inkuber chipsene med spidser indlejret ved 37 grader Celsius natten over. For at forbinde chipsene til organchipbioreaktoren skal du først fjerne P200-spidserne fra kanalerne.
Tilsæt dråber af respektive medier til indløbet og udløbet af urin- og kapillærkanalerne for at forhindre tørring. Tilsæt tre milliliter varmt podocytinduktionsmedium til urinindløbsreservoiret og tre milliliter varmt endotelvedligeholdelsesmedium til kapillærindløbsreservoiret. Tilsæt 300 mikroliter af de respektive medier til udløbsreservoirerne direkte over udløbsporten.
Skub bælgene på bakken og ind i organchipbioreaktoren. Brug drejeknappen til at vælge og starte primcyklussen i to minutter. Undersøg visuelt undersiden af bælgen for små dråber ved alle fire fluidiske porte.
For at opnå væske til væskekontakt mellem podens underside og mikrofluidiske chipporte skal du forsigtigt skubbe chipholderen ind i poden. Tryk forsigtigt chipholderfanen ind og op. Aspirer overskydende medium fra chippens overflade.
Indstil organchip bioreaktor strømningshastighed til 60 mikroliter i timen. Indstil den cykliske stamme til 10% ved 0,4 hertz. Brug drejeskiven på organchipbioreaktoren til at vælge reguleringscyklussen og køre i to timer.
Visuelt inspicere udløbsreservoirerne for en stigning i medieniveauet. Brug drejeskiven på organchipbioreaktoren til at vælge reguleringscyklussen. Efter dag 17 med kultur skal du dagligt aspirere mediet fra urinkanalens udløbsreservoirer diagonalt væk fra havnen, men hold noget medium i reservoiret.
Genopfyld urinkanalens indløbsreservoir med op til tre milliliter podocytinduktionsmedium hver anden dag i fem dage. Efter fem dage skal du opsuge mediet fra urinkanalen, men hold noget medium i reservoiret. Genopfyld urinkanalindløbsreservoiret dagligt med tre milliliter podocytvedligeholdelsesmedium.
På samme måde aspireres mediet fra kapillærkanaludløbet og genopfyldes indløbsreservoirerne dagligt med endotelvedligeholdelsesmedium. Ved hjælp af denne protokol blev humaninducerede pluripotente stamceller brugt til at udvikle en funktionel in vitro-model af glomerulus ved at formere vaskulære endotelceller og podocytter. På dag 21 efter podocytinduktion og vaskulær endotelformering udtrykte cellerne i chipsene afstamningsidentifikationsmarkører såsom Podocin og Nephrine for podocytter, VE Cadherin og PECAM-1 for vaskulære endotelceller.
Både podocyt- og vaskulære endotelcellelag udtrykte kollagen IV, som er det mest rigelige GBM-protein i nyreglomerulus. Glomeruluschipsene filtrerede selektivt små molekyler såsom inulin fra kapillæren ind i urinkanalen, samtidig med at store proteiner som albumin blev forhindret i at forlade kapillærkanalen, hvilket viste en selektiv molekylær filtreringsfunktion. Under endotelinduktion på dag fire til syv kan en stigning i celletallet resultere i et sekundært lag af celler, men oversåning kan forårsage aggregering, hvilket kan hindre differentiering.
Uventet væskekrydsstrøm mellem urin- og kapillærkanalerne kan observeres i tilfælde af utilstrækkelig binding af PDMS-chipkomponenterne, blokering i væskestrømningsvejen eller kompromitteret filtreringsbarriere. Ved såning af endotel og epitel og vedligeholdelse af chipsene fra dag 15 og fremefter er det vigtigt at visuelt inspicere for luftbobler i kanalerne ved hvert trin. I den isogene glomeruluschip kan klinisk relevante lægemiddelkandidater administreres for at teste deres terapeutiske potentiale eller toksicitetsniveauer.
Denne teknik åbner nu muligheder for at forstå det genetiske grundlag for menneskelig nyresygdom og udvikle personlig terapi.
Præsenteret her er en protokol til at konstruere et personligt organ-on-a-chip-system, der rekapitulerer strukturen og funktionen af den nyreglomerulære filtreringsbarriere ved at integrere genetisk matchede epitel- og vaskulære endotelceller differentieret fra humaninducerede pluripotente stamceller. Dette bioengineered system kan fremme nyrepræcisionsmedicin og relaterede applikationer.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved