このプロトコルは、患者サンプルに病原性抗体が含まれているかどうかを特定できるため、重要です。この技術の主な利点は、他の方法では容易に識別できない表面抗原と細胞内抗原の反応性を区別する能力にあります。培養海馬ニューロンは、新しい抗体を同定するために使用されます。
これらの新しい抗体の同定は、最終的に患者の転帰を改善するための特異的単剤療法の開始を可能にする。この技術は、ニューロン表面タンパク質に向けられた病原性抗体に関連する疾患の全分野に拡張することができるので重要である。細かい湾曲した鉗子で胚の頭を保持し、45度の角度で一対の細かいまっすぐな鉗子で軌道を突き刺します。
次に、細かい湾曲した鉗子を解放します。手術用はさみの助けを借りて、後頭骨から前頭骨まで皮膚と頭蓋骨を解剖します。次に、一対の細かい湾曲した鉗子で脳を取り除き、冬眠とB27で6センチの皿に集めます。
すべての胚から脳が回収されたら、細いまっすぐな鉗子を使用して終脳を矢状に分離します。次に、冬眠液とB27の滴を円を描くように1センチメートルの距離に置いて10センチの皿を準備し、1滴あたり1つの終脳を置き、1.25倍の倍率で解剖スコープを通して視覚化します。顕微鏡下で作業しながら、視床を慎重に取り除き、髄膜をはがして海馬をよりよく視覚化します。
次に、精密スプリングハサミで海馬を解剖します。そして、冬眠とB27を入れた3.5センチの皿に入れ、2つを入れます。手順を繰り返して、すべての海馬を収集します。
海馬の酵素解離のために、海馬を含む50ミリリットルのチューブに1ミリリットルの2.5%トリプシンを加える。チューブ内の容量をHBSSで5ミリリットルにした後、チューブを摂氏37度の水浴中で15分間インキュベートします。トリプシンをさらに希釈するには、10ミリリットルの予熱したHBSSを加え、チューブを摂氏37度に5分間設定した水浴に戻します。
次に、1000マイクロリットルのマイクロピペットを使用して、粘液塊として現れる海馬を50ミリリットルのチューブに移します。そして、実証されているように、組織を6ミリリットルの予熱HBSSで5分間インキュベートします。組織を機械的に解離するには、海馬塊を円錐形の底部を有する2ミリリットルのチューブに移す。
1ミリリットルの予熱されたDMEM培地を加えた後、穏やかに上下に吸引することにより、1000マイクロリットルのマイクロピペットでペレットを均質化します。気泡が発生しないように、混合物が半透明になるまで、先端がチューブの円錐形の底に接触した状態で、事前にプルされたガラスピペットで上下の吸引を10〜20回繰り返します。交差した振とう運動で3.5センチメートルの皿に均等に分配する前に、細胞を数えます。
完了したら、皿を5%のインキュベーターに入れます二酸化炭素。in vitro細胞の蛍光免疫染色を14日間行うには、抗NMDAR抗体を含むサンプルをカバースリップに加え、摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。1時間後、サンプルを4%ホルムアルデヒドとPBSで固定溶液として室温で5分間処理します。
次いで、サンプル推力をPBSでそれぞれ5分間洗浄し、続いて二次抗体ヤギ抗ヒトAlexa Fluor 488を1〜1000希釈で加え、室温で1時間行った。次に、サンプルが入ったカバースリップを液体封入剤でマウントし、残っている液体を吸引します。蛍光イメージングでニューロンを視覚化します。
カルシウムイメージングには、カバースリップで増殖したin vitro細胞を14〜18日間使用します。イメージングの前に、pAAV2 CAG GCaMP 5Gをコードするウイルスベクターで細胞をミリリットルあたり10〜10番目のゲノムコピーの2.5倍で5〜7日間処理します。イメージングの1日前に、細胞を患者サンプルと一緒に24時間インキュベートします。
撮影日に、セットアップを準備し、顕微鏡セルチャンバーを摂氏37度に設定します。レーンを蒸留水で満たし、5%二酸化炭素を注入して細胞の生理学的状態を維持します。細胞を細胞外生理液で覆った後、それらを顕微鏡細胞室に移す。
10マイクロモルのNBQXを追加してAMPAおよびKA受容体をブロックし、NMDA受容体応答を視覚化します。100ミリ秒ごとに記録されたフレームで4分間の動画を取得します。取得を開始した直後に、皿に刺激溶液を追加します。
刺激に際し、Image J.It などの処理ソフトウェアを用いてコントロールおよび患者の脳脊髄液またはCSFサンプルと共にインキュベートした培養物から経時的に蛍光シグナルを抽出し、in vitroで1日1日に細胞が均一に分布し、細胞体の周りに発達するラメラおよび小神経突起が伸長し始めた状態でプレートに接着していることが観察された。数日間の培養後、神経突起は短い距離を伸ばし、細胞は有意な分極を示した。神経回路網は成長し続け、複雑になりました。
18日目に、ニューロンは成熟し、相互接続され、ニューロンネットワークを構築しました。代表的な蛍光画像は、選択マーカーを用いて18日目の成熟ニューロンを示す。患者サンプルとの培養物のインキュベーションは、ニューロンの表面に存在するNMDA受容体を認識する自己抗体を含むため、強い蛍光シグナルを生成しました。
対照的に、対照サンプルは、ニューロン培養物に投与されたときに蛍光シグナルを産生しなかった。NMDAの適用は、細胞内緑色蛍光の変化によって示されるように蛍光強度を増加させた。刺激装置を適用した場合、対照CSF試料で処理したニューロンは、患者CSF試料で処理した細胞よりも高い蛍光強度の差を示した。
海馬の特性識別と解剖は、培養物の純度を決定します。細胞が凝集することは、特にイメージング目的で培養物を使用する場合に重要な要素である。さらに、培養海馬ニューロンは、免疫沈降法および質量分析技術と組み合わせることで、新規抗体とその標的抗原を同定するために使用できます。
この技術により、抗体媒介性疾患の新しいカテゴリーの特性評価が可能になりました。したがって、ナノ免疫学の新分野の研究に不可欠です。
