Name: isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis at JoVE.com

129S4只老鼠是西奈山伊坎医学院Philippe Soriano博士的礼物。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）/美国国立牙科和颅面研究所（NIDCR）R01 DE027689和K02 DE028572至K.A.F.，F31 DE029976至M.A.R.和F31 DE029364至B.J.C.D.的资金支持。

所有涉及动物的程序均由科罗拉多大学安舒茨医学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并按照机构指南和法规进行。雌性129S4小鼠在1.5-6月龄下饲养在21-23°C的亚热中性温度下用于胚胎收获。该协议的工作流程示意图如图 1所示。有关本方案中使用的所有材料、设备、软件、试剂和动物的详细信息，请参阅材料 表 。
1. 收获E11.5?...

这里描述的方案允许研究人员以稳健和可重复的方式探测颅面发育过程中的关键磷酸化依赖性信号传导事件。该协议中有几个关键步骤可以确保正确收集数据和分析结果。无论是从小鼠面部过程和/或培养的腭间充质细胞中分离磷酸化蛋白，都必须快速有效地移动，同时在需要时将所有试剂和材料保持在冰上。冰的低温减慢了细胞中的代谢活性，从而保护磷酸化蛋白质免受磷酸酶活性...

哺乳动物颅面发育是一个复杂的形态学过程，在此期间，多个细胞群协调以产生额鼻骨骼。在小鼠中，该过程始于胚胎日（E）9.5，形成额鼻突出和成对的上颌骨和下颌过程，每个过程都包含迁移后颅神经嵴细胞。外侧和内侧鼻突起源于额鼻突出，伴有鼻坑的出现，最终融合形成鼻孔。此外，内侧鼻突和上颌突融合以产生上唇。同时，腭生成始于E11.5时从上颌过程的口腔侧形成不同的生长 - 次级腭架。随着时间的推移，腭架在舌头的两侧向下生长，上升到舌头上方的相反位置，并最终在中线融合形成连续的腭，将鼻腔和口腔分开E16.51。
这些在整个颅面发育过程中的形态变化是通过各种信号传导相互作用开始和维持的，其中通常包括激酶的蛋白质磷酸化。例如，细胞膜受体，例如转化生长因子（TGF）-β受体的亚家族，包括骨形态发生蛋白受体（BMPRs）和各种受体酪氨酸激酶（RTK）家族，在颅神经嵴细胞中的配体结合和激活时自磷酸化2，3，4.此外，G蛋白偶联的跨膜受体平滑在颅神经嵴细胞和颅面外胚层中磷酸化，声波刺猬（SHH）配体与Patched1受体结合，导致睫状膜处平滑积聚和SHH途径激活5。这种配体-受体相互作用可以通过颅面环境中的自分泌、旁分泌和/或并列子碱信号传导发生。例如，已知BMP6在软骨细胞分化6期间以自分泌方式发出信号，而成纤维细胞生长因子（FGF）8在咽弓外胚层中表达，并与以旁分泌方式在咽弓间充质中表达的RTK家族的FGF家族成员结合，以启动咽弓的图案化和生长7，8，9，10.此外，当跨膜Delta和/或锯齿状配体与邻近细胞上的跨膜Notch受体结合时，在颅面骨骼发育过程中，通过并列他克林信号传导在软骨细胞和成骨细胞中激活Notch信号传导，随后被切割和磷酸化11。然而，还有其他配体和受体对对颅面发育很重要，它们具有在自身分泌和旁分泌信号传导中起作用的灵活性。例如，在鼠牙形态发生期间，血小板衍生生长因子（PDGF）-AA配体已被证明以自分泌方式发出信号以激活牙釉质器官上皮12中的RTK PDGFRα。相反，在妊娠中期的鼠面部过程中，编码配体PDGF-AA和PDGF-CC的转录本在颅面外胚层中表达，而PDGFRα受体在潜在的颅神经嵴衍生的间充质中表达，导致旁分泌信号传导13，14，15，16，17.无论信号传导机制如何，这些受体磷酸化事件通常导致接合蛋白和/或信号分子的募集，这些分子经常自身被磷酸化以引发细胞内激酶级联反应，例如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径18，19。
然后，这些级联的末端细胞内效应子可以磷酸化一系列底物，例如转录因子，RNA结合，细胞骨架和细胞外基质蛋白。Runx220，Hand121，Dlx3 / 522，23，24，Gli1-325和Sox926 是颅面发育中磷酸化的转录因子之一。这种翻译后修饰（PTM）可以直接影响对替代PTM的敏感性，二聚化，稳定性，裂解和/或DNA结合亲和力，以及其他活性20，21，25，26。此外，RNA结合蛋白Srsf3在颅面发育的背景下被磷酸化，导致其核易位27。一般而言，RNA结合蛋白的磷酸化已被证明会影响其亚细胞定位，蛋白质 - 蛋白质相互作用，RNA结合和/或序列特异性28。此外，肌动肌肽的磷酸化可导致整个颅面发育过程中的细胞骨架重排29，30，并且细胞外基质蛋白的磷酸化，例如小的整合素结合配体N-连接的糖蛋白，有助于骨骼发育过程中的生物矿化31。通过上述和许多其他例子，很明显，在颅面发育过程中，蛋白质磷酸化具有广泛的意义。添加额外的调节水平，蛋白质磷酸化通过磷酸酶进一步调节，其通过去除磷酸基团来抵消激酶。
受体和效应分子水平上的这些磷酸化事件对于信号通路的传播至关重要，并最终导致细胞核中基因表达的变化，驱动特定的细胞活动，如迁移，增殖，存活和分化，从而导致哺乳动物面部的适当形成。鉴于蛋白质与激酶和磷酸酶相互作用的背景特异性，PTMs的变化及其对细胞活性的影响，在生理相关环境中研究这些参数以完全了解磷酸化事件对颅面发育的贡献至关重要。这里提供了研究蛋白质磷酸化并因此在哺乳动物颅面发育过程中信号通路激活的两种情况的示例：小鼠面部过程，特别是E11.5上颌过程，以及来自E13.5次级腭架的培养小鼠胚胎腭间充质细胞 - 主要32 和永生化33.在E11.5中，上颌突处于与外侧和内侧鼻突1融合的过程中，从而代表了小鼠颅面发育过程中的关键时间点。此外，这里选择了上颌骨过程和来自腭架的细胞，因为后者的结构是前者的衍生物，从而为研究人员提供了在相关背景下 在体内 和 体外 询问蛋白质磷酸化的机会。然而，该协议也适用于替代面部过程和发育时间点。
研究磷酸化蛋白质的一个关键问题是，在蛋白质分离过程中，它们很容易被丰富的环境磷酸酶去磷酸化。为了克服这一障碍，讨论了允许分离磷酸化蛋白质的标准实验室方法的适应性和修改。此外，还提供了对磷酸化蛋白质进行正确分析和定量的最佳实践。这些技术，特别是与药理学抑制剂和/或小鼠遗传模型结合使用，可用于更深入地了解颅面发育过程中活跃的各种信号通路的动力学和作用。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block for mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>chemiluminescence imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, air jacket</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting board, 11 x 13 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09 002 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UVP95003001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z604062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for SDS-PAGE</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular ice pan, maxi 9 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350649020000000</td>
			<td>dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11 676 341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02 215 414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9358182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 6 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 12 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, polypropylene, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 5.75&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 9&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pouches, transparent, polyethylene lining</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small latex bulb, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 25 mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with luer tip, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot cassette opening lever</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4560000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann 3MM chr chromatography paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 &#181;L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5422-25G</td>
			<td>stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC403140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>stock concentration 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>E7</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI32106</td>
			<td>low picogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-302B</td>
			<td>low femtogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610772</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof, 1 gallon</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2705HC</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 6N (certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA56-500</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal Ca - 630 non-ionic detergent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19859650</td>
			<td>Nonidet P-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>stock concentration 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9102S</td>
			<td>1:1,000; anti-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB recombinant ligand, rat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>520BB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3169S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>stock concentration 100 U/mL, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC215740100</td>
			<td>PMSF; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9101S</td>
			<td>1:1,000, anti-phospho-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PDGF Receptor &#945; /PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3170S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution, 10%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (crystalline/biological,certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S299-100</td>
			<td>NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205330500</td>
			<td>Na3VO4; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610771</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioWorld</td>
			<td>21560033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot molecular weight marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female 129S4 mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis

哺乳动物颅面发育是一个复杂的形态学过程，在此期间，多个细胞群协调以产生额鼻骨骼。这些形态学变化是通过各种信号传导相互作用开始和维持的，其中通常包括激酶的蛋白质磷酸化。这里，提供了两个生理相关上下文的例子，其中研究了哺乳动物颅面发育过程中蛋白质的磷酸化：小鼠面部过程，特别是E11.5上颌骨过程，以及来自E13.5次级腭架的培养小鼠胚胎腭间充质细胞。为了克服蛋白质分离过程中去磷酸化的常见障碍，讨论了对允许分离磷酸化蛋白的标准实验室方法的适应性和修饰。此外，还提供了在全细胞蛋白裂解物进行蛋白质免疫印迹后对磷酸化蛋白进行适当分析和定量的最佳实践。这些技术，特别是与药理学抑制剂和/或小鼠遗传模型相结合，可用于更深入地了解颅面发育过程中活性的各种磷酸化蛋白的动力学和作用。

当试图表征从小鼠面部过程和/或培养的腭间充质细胞中分离的蛋白质的磷酸化时，理想的结果将在蛋白质印迹后显示一个独特的，可重复的条带，该抗体在相应总蛋白带的高度或附近运行（图3).然而，如果发生蛋白质的广泛磷酸化，与总蛋白质条带相比，磷酸蛋白条带可能会有轻微的向上移动。此外，如果一个组织中存在蛋白质的多个亚型，每个亚型都被磷酸化，或者该蛋...

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Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

该协议提出了一种从解剖的小鼠胚胎面部过程或培养的小鼠胚胎腭间充质细胞中分离全细胞蛋白裂解物并随后进行蛋白质免疫印迹以评估磷酸化蛋白水平的方法。

从小鼠面部过程和培养的腭间充质细胞中分离全细胞蛋白质裂解物以进行磷酸化蛋白分析

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

该协议可用于更深入地了解哺乳动物颅面发育过程中活性磷酸化蛋白的动力学和作用。该方案克服了从两个生理相关背景（小鼠面部过程和培养的小鼠胚胎腭间充质细胞）分离蛋白质过程中脱磷酸化的常见障碍。必须快速移动，同时将所有试剂和材料保持在冰上，并在所有裂解缓冲液中使用磷酸酶抑制剂，以保持磷酸化蛋白质的完整性。首先，将小鼠身体放在腹侧朝上，并将小鼠腹部喷洒70%乙醇的解剖板上。然后用直的Semken镊子捏住并抬起阴道口前方的皮肤，以打开腹腔。接下来，用直刀片手术剪刀在两侧以45度角切割抬起的皮肤，以产生V形，该形状延伸到四肢和后肢之间大约一半的每个侧表面。使用Semken镊子，抓住其中一个子宫角，并用手术剪刀切开输卵管下方和子宫颈上方。为了完全切除子宫角，切除子宫中膜，然后将解剖的子宫角转移到10厘米培养皿中的10毫升组织学PBS中。同样，切除腹腔相对侧的第二个子宫角。之后，将含有两个子宫角的10厘米培养皿放在冰上。在解剖体视显微镜下，用Dumont 5细镊子小心地从子宫角中解剖出每个胚胎。然后慢慢拉开子宫肌层、蜕膜和绒毛膜。接下来，撕开并去除胚胎周围相对透明的羊膜，并切断连接胚胎和胎盘的脐带。然后使用切割的塑料转移移液管将每个解剖的胚胎转移到2.5毫升组织学PBS中，在冰上12孔细胞培养板的单个孔中。准备三个含有10毫升组织学PBS的10厘米培养皿，并将它们保存在冰上，以便在胚胎之间旋转。然后使用切割的塑料移液管将一个胚胎从12孔细胞培养板的单个孔转移到具有组织学PBS的10厘米培养皿之一。在解剖显微镜下，使用细镊子将每个上颌突与面部分开，方法是首先沿着上颌突中分离外侧鼻突的自然压痕在上颌突的一个上颌突的前侧进行切割。接下来，沿着自然压痕切割上颌突的后侧，将上颌突和下颌突分开。然后通过从上颌过程的眼睛侧上颌过程的前后侧垂直切割上颌过程来完全分离上颌过程，其中上面引用的自然压痕结束。使用带有两毫升小乳胶灯泡的9英寸巴斯德移液器，将解剖的上颌骨工艺在约30微升的组织学PBS小液滴中转移到冰上标记的35毫米培养皿中。然后使用巴斯德移液器将一对上颌过程组织转移到冰上标记的1.5毫升微量离心管中，从而最大限度地减少组织学PBS的转移。此外，用巴斯德移液管在1.5毫升微量离心管中除去任何多余的组织学PBS。在冰上使用之前，立即加入0.1毫升冰冷的NP40裂解缓冲液和蛋白酶和磷酸酶抑制剂。然后用200微升移液器上下移液10次。接下来，涡旋10秒，然后用200微升的PIPETMAN上下移液10次，同时避免气泡的产生。在四摄氏度下孵育两小时，同时使用带有管式左轮手枪的1.5毫升或两毫升桨叶进行端到端旋转。然后将样品以13，500×g在4摄氏度下离心20分钟，并将上清液收集到具有200毫升PIPETMAN的冰上新的1.5毫升微量离心管中。首先，使用连接到真空系统的5.75英寸巴斯德移液管从小鼠胚胎腭间充质细胞中抽吸培养基。然后用冰冷的组织培养PBS洗涤细胞两次，并在最后一次洗涤期间将板向侧面倾斜，以确保所有组织培养PBS被吸出。接下来，在冰上使用之前立即加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冷NP40裂解缓冲液以裂解细胞。将板在冰上孵育五分钟，大约每分钟旋转一次，以确保板完全覆盖。然后使用预冷的细胞提升器将细胞从板上刮下，并将细胞悬浮液转移到冰上预冷的1.5毫升微量离心管中。之后，将细胞悬浮液在四摄氏度下孵育30分钟，同时使用1.5毫升或两毫升桨和管式左轮手枪进行端对端旋转。然后将样品以13，500×g在4摄氏度下离心20分钟，并将上清液收集到具有200毫升PIPETMAN的冰上新的1.5毫升微量离心管中。在用PDFG-B配体刺激2至15分钟后，对永生化小鼠胚胎腭间充质细胞的全细胞裂解物进行蛋白质印迹分析，揭示了在相应总蛋白条带高度或附近运行的磷酸化蛋白的不同可重复条带。与未处理的细胞相比，用生长因子处理时观察到磷酸蛋白条带强度的增加，而样品之间的总蛋白条带强度相对相等。该协议可用于探究扰动和磷酸化如何直接影响颅面环境中的细胞间信号传导，基因表达和细胞活性。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

新生小鼠胰腺胰岛功能的有效隔离

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

科研

发育生物学

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

隔离并通过流式细胞仪分析胰腺间充质细胞

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

分离的原发性上皮细胞从附睾的全细胞贴片钳记录

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

小鼠胚胎心肌内祖群的定量全贴免疫荧光分析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

人胎脑神经干细胞 Zika 病毒感染的免疫细胞化学分析

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

培养小鼠卵巢的全贴装免疫荧光和卵泡定量研究

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

小鼠皮肤角质细胞的分离和染色,用于细胞周期特定分析细胞蛋白表达的量度细胞测定

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

人诱导多能干细胞体外生成体细胞衍生物的研究

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

全山荧光在小鼠胚胎发生过程中心脏室发育的分析

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

为早期小鼠胚胎测序准备小型RNA库

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...