Name: isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis at JoVE.com

129S4 עכברים היו מתנה מד"ר פיליפ סוריאנו, בית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני. עבודה זו נתמכה בכספים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH)/המכון הלאומי למחקר דנטלי וקרניופציאלי (NIDCR) R01 DE027689 ו- K02 DE028572 ל- K.A.F., F31 DE029976 ל- M.A.R. ו- F31 DE029364 ל- B.J.C.D.

כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של הקמפוס הרפואי אנשוץ של אוניברסיטת קולורדו ובוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות המוסדיות. נקבות 129S4 עכברים בגיל 1.5-6 חודשים ושוכנו בטמפרטורה תת-תרמונוטריאלית של 21-23 מעלות צלזיוס שימשו לקצירת עוברים. זרימת עב?...

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לחוקרים לחקור אירועי איתות קריטיים התלויים בזרחון במהלך התפתחות קרניופציאלית באופן חזק וניתן לשחזור. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה המבטיחים איסוף נכון של נתונים וניתוח תוצאות. בין אם מבודדים פוספופרוטאינים מתהליכי פנים של עכברים ו/או מתאי מזנכים פאלטל?...

התפתחות קרניופציאלית של יונקים היא תהליך מורפולוגי מורכב שבמהלכו אוכלוסיות תאים מרובות מתאמות ליצירת השלד הקדמי. בעכבר, תהליך זה מתחיל ביום העוברי (E) 9.5 עם היווצרות הבולטות הקדמית וזוגות של תהליכים מקסילריים ומנדיבולריים, שכל אחד מהם מכיל תאי פסגה עצביים גולגולתיים לאחר נדידה. תהליכי האף הצדדיים והמדיאליים נובעים מהבולטות הקדמית עם הופעת בורות האף ובסופו של דבר מתמזגים ליצירת הנחיריים. יתר על כן, תהליכי האף המדיאליים והתהליכים המקסילריים מתמזגים ליצירת השפה העליונה. במקביל, palatogenesis הוא יזם עם היווצרות של outgrowths מובהקים - מדפי palatal המשני - מן הצד האוראלי של התהליכים maxillary ב E11.5. עם הזמן, מדפי הפלטה גדלים כלפי מטה משני צדי הלשון, מתרוממים למצב מנוגד מעל הלשון, ובסופו של דבר מתמזגים בקו האמצע ויוצרים חיך רציף המפריד בין חללי האף והפומיה על ידי E16.51.
שינויים מורפולוגיים אלה במהלך ההתפתחות הקרניופציאלית מתחילים ומתקיימים באמצעות אינטראקציות איתות מגוונות, הכוללות לעתים קרובות זרחון חלבונים על ידי קינאזות. לדוגמה, קולטני קרום התא, כגון תת-קבוצות של קולטני β גורם גדילה משתנה (TGF) β, כולל קולטני חלבון מורפוגנטיים של העצם (BMPRs), ומשפחות שונות של קולטנים טירוזין קינאז (RTK), עוברים אוטופוספוריה עם קשירת ליגנד והפעלתם בתאי צמרת עצביים גולגולתיים 2,3,4 . בנוסף, קולטן הטרנס-ממברנה המצומד לחלבון G מוחלק הופך לזרחני בתאי קרסט עצביים גולגולתיים ובאקטודרם קרניופציאלי במורד הזרם של ליגנד הקיפודים של סוניק (SHH) הנקשר לקולטן Patched1, וכתוצאה מכך הצטברות מוחלקה בקרום הציליארי והפעלת מסלול SHH5. אינטראקציות כאלה בין קולטני ליגנד יכולות להתרחש באמצעות איתות אוטוקרין, פרקרין ו/או ג'וקסטקרין בהקשרים קרניופציאליים. לדוגמה, ידוע כי BMP6 מאותת באופן אוטוקריני במהלך התמיינות כונדרוציטים6, בעוד שגורם גדילה פיברובלסט (FGF) 8 מתבטא באקטודרם קשת הלוע ונקשר לחברי משפחת FGF של RTKs המתבטאים בקשת הלוע מזנכימה באופן פאראקריני כדי ליזום דפוסים וצמיחה של קשתות הלוע7, 8,9,10. יתר על כן, איתות Notch מופעל הן בכונדרוציטים והן באוסטאובלסטים במהלך התפתחות השלד הקרניופציאלי באמצעות איתות ג'וקסטקרין כאשר דלתא טרנס-ממברנה ו/או ליגנדות משוננות נקשרות לקולטני חריץ טרנס-ממברנה על תאים שכנים, אשר לאחר מכן נבקעים וזרחנים11. עם זאת, ישנם זוגות אחרים של ליגנד וקולטנים החשובים להתפתחות קרניופציאלית שיש להם את הגמישות לתפקד הן באיתות אוטוקרין והן באיתות פרקרין. לדוגמה, במהלך מורפוגנזה של שן מורין, הודגם כי גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF)-AA ligand מאותת באופן אוטוקריני להפעלת RTK PDGFRα באפיתל איבר האמייל12. לעומת זאת, בתהליכי פנים של מורין במהלך אמצע ההיריון, תעתיקים המקודדים את הליגנדות PDGF-AA ו-PDGF-CC באים לידי ביטוי באקטודרם הקרניופציאלי, בעוד שקולטן ה-PDGFRα מתבטא במזנכים הנגזרים מהפסגה העצבית הגולגולתית הבסיסית, וכתוצאה מכך ה-paracrine מאותת 13,14,15,16,17 . ללא קשר למנגנון האיתות, אירועי זרחון קולטן אלה גורמים לעתים קרובות לגיוס חלבונים מתאמים ו/או מולקולות איתות, שלעתים קרובות הופכים לזרחניים בעצמם כדי ליזום מפלים תוך-תאיים של קינאז כגון מסלול החלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK)18,19.
האפקטים התוך-תאיים הסופיים של מפלים אלה יכולים לאחר מכן לזרחן מערך של מצעים, כגון גורמי שעתוק, חלבוני RNA קושרי RNA, ציטוסקליטים ומטריצות חוץ-תאיות. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25, ו-Sox926 הם בין גורמי השעתוק הזרחניים בהקשר של התפתחות קרניופציאלית. שינוי פוסט-תרגומי זה (PTM) יכול להשפיע ישירות על הרגישות ל-PTMs חלופיים, דימריזציה, יציבות, מחשוף ו/או זיקה לקשירת DNA, בין פעילויות אחרות 20,21,25,26. בנוסף, החלבון קושר ה-RNA Srsf3 עובר זרחון בהקשר של התפתחות קרניופציאלית, מה שמוביל לטרנסלוקציה הגרעיניתשלו 27. באופן כללי, הודגם כי זרחון של חלבונים קושרי RNA משפיע על הלוקליזציה התת-תאית שלהם, על האינטראקציות בין חלבונים לחלבון, על קשירת הרנ"א ו/או על ספציפיות הרצף28. יתר על כן, פוספורילציה של אקטומיוזין יכולה להוביל לסידור מחדש של השלד הציטוסקטלי במהלך התפתחות קרניופציאלית29,30, וזרחון של חלבוני מטריצה חוץ-תאית, כגון גליקופרוטאינים קטנים המקושרים לליגנד N, הקושרים אינטגרין, תורם לביומינרליזציה במהלך התפתחות השלד31. באמצעות הנ"ל ודוגמאות רבות אחרות, ניכר כי קיימות השלכות רחבות על זרחון חלבונים במהלך התפתחות קרניופציאלית. הוספת רמה נוספת של ויסות, פוספורילציה של חלבונים מווסתת עוד יותר על ידי פוספטזות, אשר מנטרלות קינאזות על ידי הסרת קבוצות פוספטים.
אירועי זרחון אלה הן ברמת הקולטן והן ברמת המולקולטור הם קריטיים להפצת מסלולי איתות ובסופו של דבר גורמים לשינויים בביטוי הגנים בגרעין, המניעים פעילויות תאיות ספציפיות, כגון נדידה, התפשטות, הישרדות והתמיינות, המביאות להיווצרות נכונה של פני היונקים. בהתחשב בספציפיות ההקשר של אינטראקציות חלבונים עם קינאזות ופוספטזות, השינויים הנובעים מכך ב-PTMs והשפעתם על פעילות התאים, חשוב מאוד שהפרמטרים האלה ייחקרו בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית כדי להשיג הבנה מלאה של התרומה של אירועי זרחון להתפתחות קרניופציאלית. כאן, מסופקות דוגמאות לשני הקשרים שבהם ניתן לחקור זרחון של חלבונים, ולפיכך, הפעלה של מסלולי איתות במהלך התפתחות קרניופציאלית של יונקים: תהליכי פנים של עכברים, במיוחד תהליכים מקסילריים E11.5, ותאי מזנכים עובריים של עכברים מתורבתים שמקורם במדפים פאלטליים משניים E13.5 - הן ראשוניים32 והןמונצחים 33 . ב- E11.5, התהליכים המקסילריים נמצאים בתהליך של התמזגות עם תהליכי האף הצדדיים והמדיאליים1, ובכך מייצגים נקודת זמן קריטית במהלך התפתחות קרניופציאלית של עכבר. יתר על כן, תהליכים מקסילריים ותאים שמקורם במדפי הפלטה נבחרו כאן מכיוון שהמבנים האחרונים הם נגזרות של הראשונים, ובכך מספקים לחוקרים את ההזדמנות לחקור את זרחון החלבון in vivo ו - in vitro בהקשרים קשורים. עם זאת, פרוטוקול זה חל גם על תהליכי פנים חלופיים ונקודות זמן התפתחותיות.
בעיה קריטית בחקר חלבונים זרחניים היא שהם עוברים דה-פוספורילציה בקלות במהלך בידוד חלבונים על-ידי שפע של פוספטזות סביבתיות. כדי להתגבר על מחסום זה, נדונים התאמות ושינויים בשיטות מעבדה סטנדרטיות המאפשרות בידוד של חלבונים זרחניים. בנוסף, שיטות עבודה מומלצות מסופקות לניתוח נכון וכימות של חלבונים זרחניים. ניתן להשתמש בטכניקות אלה, במיוחד בשילוב עם מעכבים פרמקולוגיים ו/או מודלים גנטיים של מורין, כדי לקבל תובנה רבה יותר לגבי הדינמיקה והתפקידים של מסלולי איתות שונים הפעילים במהלך התפתחות קרניופציאלית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block for mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>chemiluminescence imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, air jacket</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting board, 11 x 13 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09 002 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UVP95003001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z604062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for SDS-PAGE</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular ice pan, maxi 9 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350649020000000</td>
			<td>dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11 676 341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02 215 414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9358182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 6 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 12 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, polypropylene, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 5.75&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 9&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pouches, transparent, polyethylene lining</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small latex bulb, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 25 mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with luer tip, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot cassette opening lever</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4560000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann 3MM chr chromatography paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 &#181;L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5422-25G</td>
			<td>stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC403140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>stock concentration 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>E7</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI32106</td>
			<td>low picogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-302B</td>
			<td>low femtogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610772</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof, 1 gallon</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2705HC</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 6N (certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA56-500</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal Ca - 630 non-ionic detergent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19859650</td>
			<td>Nonidet P-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>stock concentration 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9102S</td>
			<td>1:1,000; anti-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB recombinant ligand, rat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>520BB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3169S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>stock concentration 100 U/mL, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC215740100</td>
			<td>PMSF; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9101S</td>
			<td>1:1,000, anti-phospho-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PDGF Receptor &#945; /PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3170S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution, 10%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (crystalline/biological,certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S299-100</td>
			<td>NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205330500</td>
			<td>Na3VO4; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610771</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioWorld</td>
			<td>21560033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot molecular weight marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female 129S4 mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis

התפתחות קרניופציאלית של יונקים היא תהליך מורפולוגי מורכב שבמהלכו אוכלוסיות תאים מרובות מתאמות ליצירת השלד הקדמי. שינויים מורפולוגיים אלה מתחילים ומתקיימים באמצעות אינטראקציות איתות מגוונות, הכוללות לעתים קרובות זרחון חלבונים על ידי קינאזות. כאן מסופקות שתי דוגמאות להקשרים פיזיולוגיים-רלוונטיים שבאמצעותם ניתן לחקור זרחון של חלבונים במהלך התפתחות קרניופציאלית של יונקים: תהליכי פנים של עכברים, במיוחד תהליכים מקסילריים E11.5, ותאי מזנכים עובריים של עכבר תרבית שמקורם במדפי פלטה משניים E13.5. כדי להתגבר על המחסום הנפוץ של דה-פוספורילציה במהלך בידוד חלבונים, נדונים התאמות ושינויים בשיטות מעבדה סטנדרטיות המאפשרות בידוד של פוספופרוטאינים. בנוסף, שיטות עבודה מומלצות ניתנות לניתוח וכימות נכונים של פוספופרוטאינים בעקבות כתמים מערביים של ליזאטים של חלבון של תאים שלמים. ניתן להשתמש בטכניקות אלה, במיוחד בשילוב עם מעכבים פרמקולוגיים ו/או מודלים גנטיים של מורין, כדי לקבל תובנה רבה יותר לגבי הדינמיקה והתפקידים של פוספופרוטאינים שונים הפעילים במהלך התפתחות קרניופציאלית.

כאשר מנסים לאפיין את הזרחון של חלבונים שבודדו מתהליכי פנים של עכברים ו/או מתאי מזנכיים פאלטליים בתרבית, התוצאות הייצוגיות יחשפו באופן אידיאלי פס מובחן וניתן לשחזור בעקבות כתם מערבי עם נוגדן אנטי-פוספופרוטאין הפועל בגובה או בסמוך לגובה רצועת החלבון הכוללת המתאימה (איור 3) )...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis at JoVE.com

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

הפרוטוקול מציג שיטה לבידוד ליזאטים של חלבונים של תאים שלמים מתהליכי פנים של עוברי עכברים שנותחו או מתאי מזנכים עובריים של עכברים שעברו תרבית, וביצוע כתמים מערביים לאחר מכן כדי להעריך את רמות החלבון שעבר זרחן.

בידוד של חלבון של תאים שלמים ליסאטים מתהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכיים פאלטליים בתרבית לניתוח פוספופרוטאין לניתוח פוספופרוטאין

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבל תובנה רבה יותר על הדינמיקה והתפקידים של פוספופרוטאינים הפעילים במהלך התפתחות קרניופציאלית של יונקים. פרוטוקול זה מתגבר על המחסום הנפוץ של דה-פוספורילציה במהלך בידוד חלבונים משני הקשרים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, תהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכים עובריים שעברו תרבית של עכברים. זה הכרחי לנוע במהירות תוך שמירה על כל הריאגנטים והחומרים על קרח ולהשתמש במעכבי פוספטאז בכל מאגרי הליזיס כדי לשמור על שלמותם של חלבונים זרחניים.כדי להתחיל, הניחו את גוף העכבר על לוח ניתוח כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה, וריססו את בטן העכבר ב-70% אתנול. לאחר מכן פתח את חלל הבטן על ידי צביטה והרמת העור הקדמי לפתח הנרתיק עם מלקחיים ישרים של Semken. לאחר מכן, חתכו את העור המורם בשכבות תחתיות עם מספריים כירורגיים בעלי להב ישר בזווית של 45 מעלות משני הצדדים כדי ליצור צורת V המשתרעת על כל משטח רוחבי בערך באמצע הדרך בין ארבעת הגפיים והגפיים האחוריות.באמצעות מלקחיים Semken, לאחוז באחת הקרניים הרחם ולחתוך מתחת oviduct ומעל צוואר הרחם עם מספריים כירורגיים. כדי לאפשר הסרה מלאה של קרן הרחם, חתכו את המסומטריום, ואז העבירו את קרן הרחם המנותקת ל-10 מיליליטרים של היסטולוגיה PBS בצלחת פטרי של 10 סנטימטרים. באופן דומה, הסר את קרן הרחם השנייה בצד הנגדי של חלל הבטן.לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי באורך 10 ס"מ המכילה את שתי קרני הרחם על קרח. תחת מיקרוסקופ סטריאו מנתח, נתחו בזהירות כל עובר מקרני הרחם עם מלקחיים עדינים של דומונט 5. ואז לאט לאט למשוך את המיומטריום, את ההחלטה ואת הכוריאון.לאחר מכן, קרעו והסירו את האניון השקוף יחסית המקיף את העובר ונתקו את חבל הטבור המחבר את העובר לשליה. לאחר מכן העבירו כל עובר מנותח ל-2.5 מיליליטרים של היסטולוגיה PBS בבאר בודדת של צלחת תרבית תאים בת 12 בארות על קרח באמצעות צינור העברת פלסטיק חתוך. הכינו שלוש צלחות פטרי באורך 10 ס"מ המכילות 10 מיליליטרים של PBS היסטולוגיים ושמרו אותן על קרח לשימוש בסיבוב בין עוברים.לאחר מכן העבירו עובר אחד מבאר בודדת של צלחת תרבית התאים בת 12 הקידוחים לאחת מצורות פטרי באורך 10 ס"מ עם היסטולוגיה PBS על קרח באמצעות פיפטת העברת פלסטיק חתוכה. תחת מיקרוסקופ הניתוח, הפרד כל תהליך מקסילרי מהפנים באמצעות המלקחיים העדינים על ידי ביצוע תחילה חתך בצד הקדמי של תהליך מקסילרי אחד לאורך הכניסה הטבעית המפרידה בין תהליך האף הלטרלי בתהליך המקסילרי בתהליך המקסילרי. לאחר מכן, חותכים את הצד האחורי של התהליך המקסילרי לאורך הכניסה הטבעית המפרידה בין התהליך המקסילרי לבין התהליך המנדיבולרי.לאחר מכן הפרד לחלוטין את התהליך המקסילרי על ידי ביצוע חיתוך אנכי מהצדדים הקדמיים לאחוריים של התהליך המקסילרי בצד העין של התהליך המקסילרי שבו ההזחות הטבעיות המוזכרות לעיל מסתיימות. באמצעות פיפטת פסטר של תשעה אינץ' עם נורת לטקס קטנה של שני מיליליטר, מעבירים את זוג התהליכים המקסילריים המנותחים בטיפה קטנה של כ-30 מיקרוליטרים של PBS היסטולוגי לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר על קרח. לאחר מכן העבירו את זוג רקמות התהליך המקסילרי לצינור מיקרו-צנטריפוג מסומן של 1.5 מיליליטר על קרח באמצעות פיפטת פסטר, ובכך למזער את העברת ההיסטולוגיה PBS.יתר על כן, הסר כל עודף היסטולוגיה PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר עם פיפטה פסטר. הוסיפו 0.1 מיליליטר של חיץ ליזה NP40 קר כקרח עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז שנוספו מיד לפני השימוש בקרח. ואז פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם PIPETMAN 200 microliter.לאחר מכן, מערבולת למשך 10 שניות, ולאחר מכן פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם PIPETMAN 200 microliter, תוך הימנעות יצירת בועות. דגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים תוך כדי סיבוב מקצה לקצה באמצעות משוט 1.5 מיליליטר או שני מיליליטר עם אקדח צינור. לאחר מכן צנטריפוגה הדגימות ב 13, 500 x g במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר על קרח עם PIPETMAN 200 מיליליטר.ראשית, שאפו את המדיום מתאי המזנכים הפאלאטאליים העובריים של העכבר באמצעות פיפטת פסטר בגודל 5.75 אינץ' המחוברת למערכת ואקום. לאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם PBS תרבית רקמה קרה כקרח ולהטות את הצלחת הצידה במהלך הכביסה האחרונה כדי להבטיח שכל תרבית הרקמה PBS שואפת. לאחר מכן, הוסיפו חיץ ליזה NP40 קר כקרח עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז שנוספו מיד לפני השימוש בקרח כדי ליזום את התאים.דוגרים את הצלחת על קרח במשך חמש דקות עם סיבוב בערך כל דקה כדי להבטיח כיסוי מלא של הצלחת. לאחר מכן מגרדים את התאים מהצלחת באמצעות מרים תאים מקורר מראש, ומעבירים את תרחיף התא לצינור מיקרו-צנטריפוג' 1.5 מיליליטר מקורר מראש על קרח. לאחר מכן, דגירה של מתלה התא בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תוך סיבוב מקצה לקצה באמצעות משוט 1.5 מיליליטר או שני מיליליטר עם אקדח צינור.לאחר מכן צנטריפוגה הדגימות ב 13, 500 x g במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר על קרח עם PIPETMAN 200 מיליליטר. ניתוח כתמים מערביים של ליסאטים של תאים שלמים מתאי מזנכים פאלטליים עובריים של עכברים מונצחים בעקבות גירוי עם ליגנד PDFG-B בין 2 ל-15 דקות חשף רצועות משוחזרות שונות עבור פוספופרוטאינים הפועלים בגובה או בסמוך לגובה רצועת החלבון הכוללת המתאימה. עלייה בעוצמות רצועת הפוספופרוטאין נצפתה עם טיפול עם גורם גדילה בהשוואה לאלה של תאים לא מטופלים, בעוד שעוצמות רצועת החלבון הכוללת היו שוות יחסית בין הדגימות.פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור כיצד הפרעות וזרחון משפיעות ישירות על איתות בין-תאי, ביטוי גנים ופעילות תאית בהקשרים קרניופציאליים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

בידוד וניתוח תאים של mesenchyme הלבלב ידי cytometry הזרימה

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

כל תא תיקון מהדק הקלטות של תאים אפיתל העיקרי מבודדים מן האברדימיס

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

זיהום בנגיף Zika של תאי גזע עצביים במוח העובר האנושי בתרבית לניתוח Immunocytochemical

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

הכנת ספריות RNA קטנות לצורך רצף של עוברי עכבר מוקדם

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...