Name: isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis at JoVE.com

129S4 마우스는 시나이 산의 이칸 의과 대학 필립 소리아노 박사의 선물이었다. 이 연구는 NIH (National Institutes of Health) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 및 K02 DE028572에서 K.A.F., F31 DE029976에서 M.A.R. 및 F31 DE029364에서 B.J.C.D.까지의 기금으로 지원되었습니다.

동물과 관련된 모든 절차는 콜로라도 대학 안슈츠 메디컬 캠퍼스의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 제도적 지침 및 규정을 준수하여 수행되었습니다. 암컷 129S4 마우스를 1.5-6개월령에 21-23°C의 열중성 이하 온도에서 사육하여 배아 수확에 사용하였다. 프로토콜의 개략적인 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료,...

여기에 설명 된 프로토콜을 통해 연구원은 두개골 안면 발달 중에 중요한 인산화 의존성 신호 전달 사건을 강력하고 재현 가능한 방식으로 조사 할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 적절한 데이터 수집 및 결과 분석을 보장하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 마우스 안면 과정 및/또는 배양된 구개골 중간엽 세포로부터 포스포단백질을 분리하든, 지시될 때 모든 시약과 물질을 얼음 위에 유지하?...

포유류 두개골 안면 발달은 여러 세포 집단이 전두엽 골격을 생성하기 위해 조정되는 복잡한 형태 학적 과정입니다. 마우스에서,이 과정은 배아 일 (E) 9.5에서 전두엽 두드러기와 상악 및 하악 과정의 쌍을 형성하면서 시작되며, 각각은 철새 후 두개골 신경 볏 세포를 포함합니다. 측면 및 내측 비강 과정은 비강 구덩이의 출현과 함께 전두엽 두드러짐에서 발생하고 결국 융합되어 콧 구멍을 형성합니다. 또한, 내측 비강 과정과 상악 과정은 상립을 생성하기 위해 융합된다. 동시에, 고형성 (palatogenesis)은 E11.5에서 상악 과정의 구강 측에서 뚜렷한 파생물 (이차 구개 선반)의 형성으로 시작됩니다. 시간이 지남에 따라 구개골 선반은 혀의 양쪽에서 아래쪽으로 자라며 혀 위의 반대 위치로 상승하고 결국 중간 선에서 융합되어 E16.51에 의해 비강과 구강 충치를 분리하는 연속 구개열을 형성합니다.
두개골 안면 발달 전반에 걸친 이러한 형태학적 변화는 다양한 신호전달 상호작용을 통해 시작되고 지속되며, 이는 종종 키나아제에 의한 단백질 인산화를 포함한다. 예를 들어, 골형성 단백질 수용체 (BMPRs) 및 다양한 수용체 티로신 키나제 (RTK) 패밀리를 포함하는 형질전환 성장 인자 (TGF)-β 수용체의 서브패밀리와 같은 세포막 수용체는 두개골 신경 크레스트 세포 2,3,4에서 리간드 결합 및 활성화시 자가인산화된다. . 추가적으로, G 단백질-결합된 막횡단 수용체 평활화는 Patched1 수용체에 결합하는 소닉 헤지호그(SHH) 리간드의 두개골 신경 크레스트 세포 및 두개골 외배엽 하류에서 인산화되어, 섬모막 및 SHH 경로 활성화5에서의 평활화된 축적을 초래한다. 이러한 리간드-수용체 상호작용은 두개골 맥락에서 자가분비, 파라크린, 및/또는 병타크린 신호전달을 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, BMP6는 연골세포 분화 6 동안 자가분비 방식으로 신호를 보내는 것으로 알려져 있는 반면, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 8은 인두 아치 외배엽에서 발현되고 인두 아치 중간엽에서 발현되는 RTKs의 FGF 패밀리의 구성원에 결합하여 인두 아치의 패터닝 및 발발을 개시하는 파라크린 방식으로7, 8,9,10. 또한, 노치 신호전달은 막횡단 델타 및/또는 재그드 리간드가 이웃 세포 상의 막횡단 노치 수용체에 결합할 때 juxtacrine 신호전달을 통해 두개골 골격 발달 동안 연골세포 및 조골세포 둘 다에서 활성화되며, 이는 후속적으로 절단되고 인산화된다(11). 그러나, 자가분비 및 파라크린 신호전달 둘 다에서 기능할 수 있는 유연성을 갖는 두개골 발달에 중요한 다른 리간드 및 수용체 쌍이 있다. 일례로서, 뮤린 치아 형태형성 동안, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF)-AA 리간드는 법랑질 기관 상피12에서 RTK PDGFRα를 활성화시키는 자가분비 방식으로 신호를 보내는 것으로 입증되었다. 대조적으로, 임신 중반 동안의 뮤린 안면 과정에서, 리간드 PDGF-AA 및 PDGF-CC를 코딩하는 전사체는 두개골 외배엽에서 발현되는 반면, PDGFRα 수용체는 기저 두개골 신경 볏 유래 중간엽에서 발현되어, 파라크린 신호전달13,14,15,16,17을 초래한다. . 신호전달 메카니즘에 관계없이, 이러한 수용체 인산화 사건은 종종 어댑터 단백질 및/또는 신호전달 분자의 모집을 초래하며, 이는 종종 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 경로와 같은 세포내 키나제 캐스케이드를 개시하기 위해 스스로 인산화된다18,19.
이들 캐스케이드의 말단 세포내 이펙터는 이어서 전사 인자, RNA-결합, 세포골격 및 세포외 매트릭스 단백질과 같은 기질의 어레이를 인산화할 수 있다. Runx220, Hand1 21, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 및 Sox9 26은 두개골 안면 발달의 맥락에서 인산화된 전사 인자 중 하나이다. 이러한 번역 후 변형(PTM)은 다른 활동들 중에서도 대안적인 PTM, 이량체화, 안정성, 절단 및/또는 DNA 결합 친화도에 대한 감수성에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다(20,21,25,26). 추가적으로, RNA-결합 단백질 Srsf3는 두개골 안면 발달의 맥락에서 인산화되어, 그의 핵 전좌(27)로 이어진다. 일반적으로, RNA-결합 단백질의 인산화는 그들의 세포외 국소화, 단백질-단백질 상호작용, RNA 결합, 및/또는 서열 특이성(28)에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 더욱이, 악토묘신의 인산화는 두개골 발달 전반에 걸쳐 세포골격 재배열(29,30)을 유도할 수 있고, 작은 인테그린 결합 리간드 N-결합 당단백질과 같은 세포외 매트릭스 단백질의 인산화는 골격 발달 동안 생광물화에 기여한다(31). 상기 및 다수의 다른 예를 통해, 두개골 안면 발달 동안 단백질 인산화에 대한 광범위한 함의가 있음이 명백하다. 추가적인 수준의 조절을 추가하면, 단백질 인산화는 포스파타제에 의해 더욱 조절되며, 이는 포스페이트 그룹을 제거함으로써 키나아제를 상쇄시킨다.
수용체 및 이펙터 분자 수준 모두에서 이러한 인산화 사건은 신호전달 경로의 전파에 매우 중요하며, 궁극적으로 핵에서의 유전자 발현의 변화를 초래하여, 이동, 증식, 생존 및 분화와 같은 특정 세포 활동을 유도하여, 포유동물 얼굴의 적절한 형성을 초래한다. 키나제 및 포스파타아제와의 단백질 상호작용의 맥락 특이성, PTM의 결과적인 변화, 세포 활성에 미치는 영향을 고려할 때, 이러한 파라미터가 생리학적으로 관련된 환경에서 연구되어 두개골 발달에 대한 인산화 사건의 기여에 대한 완전한 이해를 얻는 것이 중요하다. 여기에서, 단백질의 인산화 및 따라서 포유동물 두개골 발달 동안 신호전달 경로의 활성화를 연구하는 두 가지 맥락의 예가 제공된다: 마우스 안면 과정, 특히 E11.5 상악 과정, 및 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포 E13.5 이차 구개 선반으로부터 유래 - 일차32차 및 불멸화33 둘 다 . E11.5에서, 상악 과정은 측방 및 내측 비강 과정1과 융합하는 과정에 있으며, 이로써 마우스 두개골 안면 발달 동안 중요한 시점을 나타낸다. 또한, 상악 과정 및 구개골 선반에서 유래 된 세포는 후자의 구조가 전자의 유도체이기 때문에 여기에서 선택되었으며, 따라서 연구자들은 관련 맥락에서 생체 내 및 시험관 내에서 단백질 인산화를 조사 할 수있는 기회를 제공합니다. 그러나이 프로토콜은 대체 얼굴 프로세스 및 발달 시점에도 적용 할 수 있습니다.
인산화된 단백질을 연구할 때 중요한 문제는 풍부한 환경 포스파타제에 의한 단백질 분리 중에 쉽게 탈인산화된다는 것입니다. 이러한 장벽을 극복하기 위해 인산화 단백질의 분리를 허용하는 표준 실험실 방법에 대한 적응 및 변형이 논의됩니다. 또한, 인산화된 단백질의 적절한 분석 및 정량화를 위한 모범 사례가 제공됩니다. 이러한 기술은, 특히 약리학적 억제제 및/또는 뮤린 유전 모델과 조합하여, 두개골 안면 발달 동안 활성인 다양한 신호전달 경로의 역학 및 역할에 대한 더 큰 통찰력을 얻기 위해 사용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block for mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+ imaging system with Image Lab software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>chemiluminescence imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, air jacket</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting board, 11 x 13 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09 002 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis cell, 4-gel, for mini precast gels with mini trans-blot module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UVP95003001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5415 D with F45-24-11 rotor (Eppendorf)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z604062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini dry bath</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>400780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for SDS-PAGE</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular ice pan, maxi 9 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 stereo microscope with stand K LAB, LED ring light</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4350649020000000</td>
			<td>dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62344-641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11 676 341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02 215 414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9358182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 6 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 12 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, polypropylene, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 0.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 5.75&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet, 9&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 10 cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 35 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pouches, transparent, polyethylene lining</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-812-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small latex bulb, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 25 mm, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with luer tip, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot cassette opening lever</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4560000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann 3MM chr chromatography paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-15% Precast protein gels, 10-well, 30 &#181;L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5422-25G</td>
			<td>stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock tested</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC403140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete mini protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11836153001</td>
			<td>stock concentration 25x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E7, mouse monoclonal beta tubulin primary antibody, concentrate 0.1 mL</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>E7</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI32106</td>
			<td>low picogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL western blotting substrate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-302B</td>
			<td>low femtogram range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610772</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof, 1 gallon</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2705HC</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, Di Na salt dihydr. (crystalline powd./electrophor.)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, characterized, US origin, 500 mL</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated secondary antibody, goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>1:20,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution, 6N (certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA56-500</td>
			<td>HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal Ca - 630 non-ionic detergent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19859650</td>
			<td>Nonidet P-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td>stock concentration 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9102S</td>
			<td>1:1,000; anti-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB recombinant ligand, rat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>520BB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3169S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>stock concentration 100 U/mL, 100 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC215740100</td>
			<td>PMSF; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9101S</td>
			<td>1:1,000, anti-phospho-Erk1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-PDGF Receptor &#945; /PDGF Receptor &#946; primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3170S</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (white crystals)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td>KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution, 10%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (crystalline/biological,certified)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride (powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S299-100</td>
			<td>NaF; aliquot for one time use; stock concentration 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate, 99%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205330500</td>
			<td>Na3VO4; stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (granular or powder/certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer, 5 L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610771</td>
			<td>stock concentration 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (white crystals or crystalline powder/molecular biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>BioWorld</td>
			<td>21560033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot molecular weight marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female 129S4 mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>gift of Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine at Mount Sinai</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of whole cell protein lysates from mouse facial processes and cultured palatal mesenchyme cells for phosphoprotein analysis

포유류 두개골 안면 발달은 여러 세포 집단이 전두엽 골격을 생성하기 위해 조정되는 복잡한 형태 학적 과정입니다. 이러한 형태학적 변화는 다양한 신호전달 상호작용을 통해 시작되고 지속되며, 이는 종종 키나아제에 의한 단백질 인산화를 포함한다. 여기에서, 포유동물 두개골 발달 동안 단백질의 인산화를 연구하는 생리학적으로 관련된 맥락의 두 가지 예가 제공된다: 마우스 안면 과정, 특히 E11.5 상악 과정, 및 E13.5 이차 구개 선반으로부터 유래된 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포. 단백질 분리 중 탈인산화의 공통적 인 장벽을 극복하기 위해 포스포 단백질의 분리를 허용하는 표준 실험실 방법에 대한 적응 및 변형이 논의됩니다. 또한, 전체 세포 단백질 용해물의 웨스턴 블롯팅에 따른 포스포단백질의 적절한 분석 및 정량화를 위한 모범 사례가 제공됩니다. 이러한 기술은, 특히 약리학적 억제제 및/또는 뮤린 유전 모델과 조합하여, 두개골 발달 동안 활성인 다양한 포스포단백질의 역학 및 역할에 대한 더 큰 통찰력을 얻기 위해 사용될 수 있다.

마우스 안면 과정 및/또는 배양된 구개 중간엽 세포로부터 분리된 단백질의 인산화를 특성화하려고 시도할 때, 대표적인 결과는 상응하는 총 단백질 밴드의 높이 또는 그 근처에서 실행되는 항-포스포단백질 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 이어 뚜렷하고 재현 가능한 밴드를 이상적으로 드러낼 것이다(그림 3 ). 그러나, 단백질의 광범위한 인산화가 발생하는 경우, 전체 단?...

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Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

상기 프로토콜은 해부된 마우스 배아 안면 과정 또는 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포로부터 전체 세포 단백질 용해물을 단리하고 인산화된 단백질 수준을 평가하기 위해 후속 웨스턴 블롯팅을 수행하는 방법을 제시한다.

마우스 안면 과정으로부터 전체 세포 단백질 용해물을 분리하고 포스포단백질 분석을 위해 배양된 팔라탈 중간엽 세포

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

이 프로토콜은 포유동물 두개골 발달 동안 활성인 포스포단백질의 역학 및 역할에 대한 더 큰 통찰력을 얻기 위해 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 두 가지 생리학적으로 관련된 맥락, 마우스 안면 과정 및 배양된 마우스 배아 구개 중간엽 세포로부터 단백질 분리 동안 탈인산화의 공통된 장벽을 극복한다. 모든 시약과 물질을 얼음 위에 유지하면서 신속하게 움직이고 인산화 단백질의 무결성을 유지하기 위해 모든 용해 완충액에 포스파타제 억제제를 사용하는 것이 필수적입니다.시작하려면 복부 쪽이 위를 향하게하는 해부 보드에 마우스 몸체를 놓고 마우스 복부에 70 % 에탄올을 뿌립니다. 그런 다음 직선 Semken 포셉으로 질 개구부의 앞쪽에있는 피부를 꼬집고 들어 올려 복강을 엽니 다. 다음으로, 양쪽에 45도 각도로 직선 블레이드 수술 가위로 기저층에서 들어 올린 피부를 잘라 네 팔다리와 뒷다리 사이의 대략 절반 정도의 각 측면 표면으로 확장되는 V 자형을 생성합니다.Semken 포셉을 사용하여 자궁 뿔 중 하나를 잡고 난관 아래와 수술 가위로 자궁 경부 위를 자릅니다. 자궁 경적을 완전히 제거하려면 mesometrium을 잘라 낸 다음 해부 된 자궁 뿔을 10 센티미터 페트리 접시의 조직학 PBS 10 밀리리터로 옮깁니다. 마찬가지로, 복강의 반대쪽에있는 두 번째 자궁 경적을 제거하십시오.그런 다음 두 자궁 뿔이 들어있는 10 센티미터의 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 해부 스테레오 현미경으로 Dumont 5 미세 포셉으로 자궁 뿔에서 각 배아를 조심스럽게 해부하십시오. 그런 다음 천천히 myometrium, decidua, chorion을 떼어냅니다.다음으로, 배아를 둘러싸고 있는 비교적 투명한 양수를 찢고 제거하고, 배아를 태반에 연결하는 탯줄을 절단한다. 이어서, 각각의 해부된 배아를 절단된 플라스틱 전달 피펫을 사용하여 얼음 상의 12-웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰에서 2.5 밀리리터의 조직학 PBS로 옮긴다. 조직학 PBS 10 밀리리터가 들어있는 세 개의 10 센티미터 페트리 접시를 준비하고 배아 사이의 회전에 사용할 얼음 위에 보관하십시오.이어서, 절단된 플라스틱 전달 피펫을 사용하여 얼음 상의 조직학 PBS가 있는 10센티미터 페트리 접시 중 하나로 12-웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰로부터 하나의 배아를 옮긴다. 해부 현미경 하에서, 먼저 상악 과정에서 측면 비강 과정을 분리하는 자연 압흔을 따라 하나의 상악 과정의 전방 측면에서 절단을 만들어 미세 포셉을 사용하여 얼굴로부터 각 상악 과정을 분리합니다. 다음으로, 자연 압흔을 따라 상악 과정의 후방면을 절단하여 상악 과정과 하악 과정을 분리한다.그런 다음 위에서 언급 한 자연 들여 쓰기가 끝나는 상악 과정의 눈 쪽에서 상악 과정의 앞쪽에서 후방으로 수직으로 절단하여 상악 과정을 완전히 분리하십시오. 두 밀리리터의 작은 라텍스 전구가 있는 아홉 인치 파스퇴르 피펫을 사용하여, 해부된 한 쌍의 상악 과정을 약 30 마이크로리터의 조직학 PBS의 작은 물방울에 담아 얼음 위에 라벨이 붙은 35밀리미터 페트리 접시로 옮깁니다. 그런 다음 한 쌍의 상악 처리 조직을 파스퇴르 피펫을 사용하여 얼음 위의 표지 된 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 조직학 PBS의 전달을 최소화합니다.또한, 파스퇴르 피펫으로 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브 내의 임의의 과량의 조직학 PBS를 제거하였다. 얼음 위에서 사용하기 직전에 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 첨가한 0.1밀리리터의 얼음냉 NP40 용해 완충액을 첨가하십시오. 그런 다음 200 마이크로 리터 PIPETMAN으로 10 번 위아래로 피펫을 만듭니다.다음으로, 10 초 동안 와류 한 다음 거품 생성을 피하면서 200 마이크로 리터 PIPETMAN으로 10 번 위아래로 피펫을 사용합니다. 섭씨 네 도에서 두 시간 동안 인큐베이션하면서 튜브 리볼버가 있는 1.5밀리리터 또는 두 밀리리터 패들을 사용하여 엔드오버 엔드를 회전시킵니다. 이어서, 샘플을 섭씨 4도에서 20분 동안 13, 500 x g에서 원심분리하고, 200 밀리리터 PIPETMAN으로 얼음 위에 새로운 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 상청액을 수집한다.먼저, 진공 시스템에 부착된 5.75 인치 파스퇴르 피펫을 사용하여 마우스 배아 구개 중간엽 세포로부터의 배지를 흡인한다. 그 다음 얼음처럼 차가운 조직 배양 PBS로 세포를 두 번 세척하고, 마지막 세척 동안 플레이트를 옆으로 기울여 모든 조직 배양 PBS가 흡인되도록 한다. 다음으로, 세포를 용해시키기 위해 얼음 위에 사용하기 직전에 프로테아제 및 포스파타제 억제제가 첨가된 얼음차가운 NP40 용해 완충액을 첨가한다.플레이트를 얼음 위에서 다섯 분 동안 인큐베이션하고 플레이트의 완전한 커버리지를 보장하기 위해 대략 매분마다 회전시킨다. 그런 다음 미리 냉각된 셀 리프터를 사용하여 플레이트에서 세포를 긁어내고, 세포 현탁액을 얼음 위에 미리 냉각된 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 그 후, 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 30분 동안 인큐베이션하면서 튜브 리볼버와 함께 1.5밀리리터 또는 두 밀리리터 패들을 사용하여 엔드-오버 엔드를 회전시킨다.이어서, 샘플을 섭씨 4도에서 20분 동안 13, 500 x g에서 원심분리하고, 200 밀리리터 PIPETMAN으로 얼음 위에 새로운 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에 상청액을 수집한다. 2 내지 15분에서 PDFG-B 리간드로 자극한 후 불멸화된 마우스 배아 구개 중간엽 세포로부터의 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석은 상응하는 총 단백질 밴드의 높이 또는 그 근처에서 실행되는 포스포단백질에 대한 뚜렷한 재현성 밴드를 밝혀냈다. 성장 인자로 처리했을 때 포스포단백질 밴드 강도의 증가가 처리되지 않은 세포의 것과 비교하여 관찰된 반면, 총 단백질 밴드 강도는 샘플 간에 상대적으로 동일하였다.이 프로토콜은 섭동 및 인산화가 두개골 문맥에서 세포 간 신호 전달, 유전자 발현 및 세포 활동에 직접적으로 어떻게 영향을 미치는지 조사하는 데 사용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

연구

발생학

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

분리 및 유동 세포 계측법에 의해 췌장 중간 엽 세포 분석

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

부고환에서 분리 된 1 차 상피 세포의 전체 세포 패치 - 클램프 기록

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Immunocytochemical 분석에 대 한 교양된 인간 태아 뇌 신경 줄기 세포의 Zika 바이러스 감염

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...