Name: isolation of preadipocytes from broiler chick embryos
Uploaded: 2022-08-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos at JoVE.com

Forfatterne takker UT AgResearch og Institut for Husdyrvidenskab for at støtte og optimere denne protokol. Dette arbejde blev finansieret af USDA-tilskud.

Alle dyreprocedurer blev godkendt af University of Tennessee Institutional Animal Care and Use Committee. Frisk befrugtede kommercielle slagtekyllinger (Cobb 500) blev opnået fra et lokalt rugeri. Æggene blev inkuberet ved 38 °C med 60 % relativ luftfugtighed indtil dissektioner ved embryonale dage 16-18 (E16-E18). Fedtvæv blev opsamlet fra det subkutane (lårbens) depot.
1. Forberedelse til isolation og kultur
<ol><li>Forbered kulturhætten og instrumenterne.<ol>
<li>F?...

<ol>
	<li>Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).</li><li>Siegel, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+modern+broiler+and+feed+efficiency.">Evolution of the modern broiler and feed efficiency.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).</li><li>Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth,+efficiency,+and+yield+of+commercial+broilers+from+1957,+1978,+and+2005.">Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005.</a> Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).</li><li>Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+models+for+differentiation:+preadipocytes+and+adipocytes.">Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes.</a> Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).</li><li>Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+influence+on+stromal+vascular+fraction+cell+yield+obtained+from+human+lipoaspirates.">Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).</li><li>Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+changes+in+lipid+composition+and+lipoprotein+lipase+activity+during+the+development+of+the+chick+embryo.">Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).</li><li>Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+adipose+tissue+growth+through+hyperplasia+and+hypertrophy+in+the+embryonic+Leghorn+and+broiler.">Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler.</a> Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).</li><li>Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+size+and+docosahexaenoic+acid+content+of+adipocytes+during+chick+embryo+development.">Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development.</a> Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).</li><li>Claver, J. A., Quaglia, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphology,+development,+and+function+of+blood+cells+in+nonmammalian+vertebrates.">Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates.</a> Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).</li><li>. Corning Cell Counter Demo Video Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg">https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg</a> (2022)</li><li>Nema, R., Khare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+cell+culture:+Advance+technology+for+modern+research.">An animal cell culture: Advance technology for modern research.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).</li><li>Regassa, A., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oleic+acid+and+chicken+serum+on+the+expression+of+adipogenic+transcription+factors+and+adipogenic+differentiation+in+hen+preadipocytes.">Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes.</a> Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).</li><li>Temkin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crude+oil/dispersant+mixture+and+dispersant+components+on+PPAR+&#947;+activity+in+vitro+and+in+vivo:+identification+of+dioctyl+sodium+sulfosuccinate+(DOSS;+CAS#+577-11-7)+as+a+probable+obesogen.">Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR &#947; activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen.</a> Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).</li><li>Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+protocol+to+maximize+differentiation+of+human+preadipocytes+and+improve+metabolic+phenotypes.">A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes.</a> Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+adipocyte-derived+extracellular+vesicles+using+filtration+and+ultracentrifugation.">Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).</li><li>Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fungizone+in+control+of+fungi+and+yeasts+in+tissue+culture.">Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).</li><li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture.">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+swimming+dots+in+cell+culture:+the+identity,+detection+method+and+judging+criteria.">Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria.</a> bioRxiv. , 366906 (2018).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).</li></ol>

Selvom flere velbeskrevne protokoller har rapporteret isolering af præadipocytter 14,15,16,17, er isolering for embryonale præadipocytter blevet optimeret, hvilket kan bruges til funktionelle analyser af fedtvækst og udvikling i det tidlige liv hos slagtekyllinger. Denne protokol giver embryonale adipocytprogenitter med høj levedygtighed med højt differentieringspotentiale. Desuden er den ...

Fedme er en global sundhedstrussel for både voksne og børn. Børn, der er overvægtige eller fede, er cirka fem gange mere tilbøjelige til at være overvægtige som voksne, hvilket placerer dem i signifikant øget risiko for hjerte-kar-sygdomme, diabetes og mange andre comorbiditeter. Omkring 13,4% af amerikanske børn i alderen 2-5 har fedme1, hvilket illustrerer, at tendensen til at akkumulere overskydende kropsfedt kan sættes i gang meget tidligt i livet. Af meget forskellige grunde er akkumuleringen af overskydende fedtvæv en bekymring for slagtekyllinger (kødtype). Moderne slagtekyllinger er utroligt effektive, men akkumulerer stadig mere lipid end det er fysiologisk nødvendigt 2,3. Denne tendens begynder kort efter luge og spilder effektivt foder, den dyreste produktionskomponent, ved at allokere det væk fra muskelvækst. Derfor er der for både børn og slagtekyllinger, omend af meget forskellige grunde, behov for at forstå faktorer, der påvirker fedtvævsudviklingen og identificere måder at begrænse fedtudvidelsen tidligt i livet.
Adipocytter dannes fra preadipocytter, fedtvævsafledte stamceller, der gennemgår differentiering for at udvikle modne, lipidlagrende fedtceller. Følgelig er præadipocytter in vitro en værdifuld eksperimentel model for fedmeundersøgelser. Disse celler, isoleret fra den stromale vaskulære fraktion af fedtdepoter, kan give en grundlæggende forståelse af molekylære veje, der styrer adipocytdifferentiering og metabolisme 4,5. Kyllingeembryoner er en gunstig eksperimentel model i udviklingsundersøgelser, fordi dyrkning af æg på den ønskede tidsplan gør eksperimentel manipulation lettere, da det gør det muligt at opnå embryoner uden moderens offer for at observere en række udviklingsstadier af embryoner. Desuden er komplicerede kirurgiske procedurer og lange perioder ikke nødvendige for at opnå embryoner i forhold til større dyremodeller. Derfor giver kyllingembryret mulighed for at opnå præadipocytter fra de tidligste stadier af fedtvævsudvikling. Subkutant fedtvæv bliver synligt i kyllingen omkring embryonal dag 12 (E12) som et klart defineret depot placeret omkring låret. Dette depot er beriget i stærkt proliferative præadipocytter, der aktivt gennemgår differentiering under udviklingssignaler for at danne modne adipocytter 6,7. Processen med adipogen differentiering er sammenlignelig mellem kyllinger og mennesker. Derfor kan præadipocytter isoleret fra kyllingeembryoner anvendes som en model med dobbelt formål til undersøgelser, der er relevante for mennesker og fjerkræ. Udbyttet af præadipocytter falder imidlertid med aldring, da celler vokser til modne adipocytter5.
Den nuværende protokol optimerer isoleringen af præadipocytter fra fedtvæv i det stadium (E16-E18), hvor adipogen differentiering og adipocythypertrofi er på deres højeste islagtekyllingermbryoner 8. Denne procedure kan vurdere virkningerne af faktorer, som det udviklende embryo udsættes for i ovo, såsom hønediet, på adipocytudvikling og adipogent potentiale ex vivo. Det kan også teste virkningen af forskellige manipulationer (f.eks. Hypoxi, næringsstoftilsætninger, farmakologiske agonister og antagonister) på adipogenese eller de forskellige 'omes (f.eks. Transkriptom, metabolom, methylom) af adipocytprogenitorer. Som en repræsentation af det tidligste stadium af fedtdannelse er celler opnået ved anvendelse af denne protokol værdifulde modeller for undersøgelser, der er relevante for fjerkræ og mennesker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683825</td>
			<td>Single Channel Pipette, 100 - 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette Tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A426P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Flask</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4980-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F75P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>Tissue Culture-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Assay Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Plate, Black Bottom</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue Culture-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Wiper (Kimtechwiper)</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Up &#38; Up</td>
			<td>NDC 1167300334</td>
			<td>20% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 40 &#181;m</td>
			<td>SPL</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugaton</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes, 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>343958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps, 100 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Surgical Scissors, 115 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SYNSV0000</td>
			<td>Despensed as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30023.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td>70% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Evos</td>
			<td>M7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td></td>
			<td>Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Container</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>4055</td>
			<td>2% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocytometer (Counting Chamber)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>480200</td>
			<td>0.1 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Sterilizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>B1205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9655</td>
			<td>1x Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Evos</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Channel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661070</td>
			<td>12-Channel Pipetters, 30 - 300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>KS130BS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towel</td>
			<td>Tork</td>
			<td>RK8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Steptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>1x Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 100 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 60 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservior</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Beaker, 100 mL</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>762703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps, 120 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-4960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Scissors, 140 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>Tissue Culture-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Strainer, 250 &#181;m</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>87791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>0.1% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, 110 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of preadipocytes from broiler chick embryos

Primære præadipocytter er et værdifuldt eksperimentelt system til forståelse af de molekylære veje, der styrer adipocytdifferentiering og metabolisme. Kyllingembryoner giver mulighed for at isolere præadipocytter fra det tidligste stadium af fedtudvikling. Denne primære celle kan bruges til at identificere faktorer, der påvirker præadipocytproliferation og adipogen differentiering, hvilket gør dem til en værdifuld model for undersøgelser relateret til fedme hos børn og kontrol af overskydende fedtaflejring hos fjerkræ. Den hurtige vækst af postnatal fedtvæv spilder effektivt foder ved at allokere det væk fra muskelvækst hos slagtekyllinger. Derfor kan metoder til at forstå de tidligste stadier af fedtvævsudvikling give spor til at regulere denne tendens og identificere måder at begrænse fedtudvidelse tidligt i livet. Denne undersøgelse var designet til at udvikle en effektiv metode til isolering, primær dyrkning og adipogen differentiering af præadipocytter isoleret fra udvikling af fedtvæv af kommercielle slagtekyllinger (kødtype) kyllingeembryoner. Proceduren er optimeret til at give celler med høj levedygtighed (~ 98%) og øget kapacitet til at differentiere sig til modne adipocytter. Denne enkle metode til embryonal præadipocytisolering, kultur og differentiering understøtter funktionelle analyser af fedtvækst og udvikling tidligt i livet.

Primære præadipocytter ligner morfologisk fibroblaster med uregelmæssige, stjernelignende former og en central kerne (figur 2A-C). Cellerne klæber let til vævskulturplastik og begynder at sprede sig kort efter vedhæftning. De differentierer hurtigt og akkumulerer lipiddråber (figur 3D), når de forsynes med fedtsyrer i medierne. Levedygtigheden (98%, baseret på farveeksklusion) rapporteret i de isolationer, der er repræ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos at JoVE.com

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

Denne protokol beskriver en simpel metode til isolering af præadipocytter fra fedtvæv i slagtekyllinger. Denne metode muliggør isolering med højt udbytte, primær kultur og adipogen differentiering af præadipocytter. Olie Rød O farvning og lipid / DNA-plet målte den adipogene evne af isolerede celler induceret med differentieringsmedier.

Isolering af preadipocytter fra broilerkyllingembryoner

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

Primære præadipocytter er et værdifuldt eksperimentelt system til forståelse af de molekylære veje, der styrer adipocytmetabolisme. Kyllingembryoner giver mulighed for at isolere præadipocytter fra det tidligste stadium af adipocytudvikling. Denne metode er optimeret til at give celler med høj levedygtighed og øget kapacitet til at differentiere sig til moden adipocyt, som kan bruges til funktionel analyse af tidlig fedtvækst og udviklingsembryo hos kyllinger.Processen med adipogen differentiering er meget sammenlignelig mellem kyllinger og mennesker. Derfor kan isolerede præadipocytter anvendes som en dobbelt foreslået model til undersøgelser, der er relevante for mennesker og fjerkræ. For at begynde at pode embryokroppen med 70% ethanol.Derefter for at forhindre interferens under filtrering på senere trin efter fordøjelsen skrubbede forsigtigt hudoverfladen med sterilt gasbind for at fjerne fjer. Skær derefter huden mellem benene og maveregionen af for at afsløre parret af lårbensfedtdepoter. Brug buede pincet med den ene hånd til at holde huden rundt om benet og fjern forsigtigt lårbenets subkutane fedt.med den anden hånd. Brug senere buede tang til forsigtigt at trække depotet væk fra benet. Overfør vævene til et 15 ml rør indeholdende fem milliliter opsamlingsmedier og gentag dissektionen for den anden side af fedtpuden.Overfør nu de opsamlede fedtpuder til en 60 millimeter petriskål indeholdende steriliseringsopløsning og skyl kort ved at hvirvle skålen et par gange. Skyl derefter steriliseringsopløsningen ved at overføre fedtpuderne til en 60 millimeter petriskål indeholdende PBS. Hvirvl forsigtigt pladen og vask igen med PBS.Til fordøjelse af fedtvævene overføres dem til et 15 millimeter rør indeholdende forvarm enzymatisk opløsning. Derefter nedsænkes et par lange lige saks i røret og til sidst hakker fedtvævene i opløsningen i stykker så små som muligt. Overfør hakket væv og enzymatisk opløsning til en 25 ml autoklaveret kolbe.Kolben pakkes ind med paraffinfilm, og kolben anbringes i en orbital shaker-inkubator ved 37 grader Celsius til fordøjelse. Efter fordøjelsen pipetteres forsigtigt op og ned for at blande godt. Fjern derefter eventuelle stykker ufordøjet væv og snavs ved at filtrere gennem en 250 mikrometer vævssi i et 15 ml rør ved pipettering.Fjern nu cellerne, der klæbes til kolben, ved at skylle kolben med fire milliliter vækstmedier og filtrere cellesuspensionen i det samme 15 ml rør. Skyl derefter sien ved at pipettere vækstmediet igen for at fjerne eventuelle celler, der er fanget i filteret. Centrifuger ved 300 gange G i fem minutter ved stuetemperatur for at pelletere cellefraktionen og aspirere supernatanten uden at forstyrre cellepillen.Resuspender forsigtigt pelleten i en milliliter lysisbuffer for røde blodlegemer, bland godt ved pipettering og inkuber i fem minutter ved stuetemperatur. Fortynd derefter cellerne ved at tilsætte fem milliliter vækstmedier til røret indeholdende cellerne og bland dem forsigtigt ved pipettering. Pipetter nu cellerne på en 40 mikrometer cellesi og filtrer dem i et nyt 50 ml rør.Skyl derefter silen med yderligere fem milliliter vækstmedier og pellet cellerne ved centrifugering ved 300 gange G i syv minutter ved stuetemperatur. Aspirer forsigtigt supernatanten. Resuspender den resterende cellepellet i en milliliter vækstmedier ved pipettering For at bestemme celletætheden og levedygtigheden blandes 10 mikroliter af hver prøve i trypanblå ved pipettering.Hæld 10 mikroliter af blandingen på hæmocytometeret og tæl cellerne. Analyse af præadipocytter efter 24, 48 og 72 timer viste normal cellemorfologi og antal. Adipogen induktion af preadipocytter viste hurtig differentiering og ophobning af lipiddråber.Aggressiv håndtering af præadipocytter under isolering resulterede i celleskader og lavt celletal. Mikrobiel kontaminering kan observeres på trods af forebyggende foranstaltninger. Lipidfarvning med olierød O indikerede, at præadipocytterne hurtigt begynder at udvikle lipiddråber under adipogen inducering, og akkumulering skrider frem over tid som observeret i 24, 48 og 72 timer.Lipidakkumuleringen i forhold til celleantal blev kvantificeret ved hjælp af lipid- og DNA-pletter. Både lipidakkumulering og celleproliferation steg over tid. Lavt celletal eller beskadigede celler kan observeres, når vævsfraktionerne fordøjes for længe.Derfor anbefales det, at en og en halv times fordøjelse ikke overskrides. Isolerede præadipocytter kan anvendes til genekspressionsundersøgelser. Tilstrækkeligt RNA kan opnås til brug i cDNA-syntese og efterfølgende qPCR eller RNAseq.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimeret<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Dyrkning af kyllingeembryoer til fremskredne stadier af udvikling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Frem Genetisk tilgang til Afdække Stress resistensgener i mus - En Højkapacitetsforskning skærm i ES-celler

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Primær endodermal epithelcellekultur fra blommesækken membran af japanske vagtelembryoner

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering af enkeltceller fra zebrafisk embryoer

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affinity Labeling Påvisning af endogene receptorer fra zebrafisk embryoer

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

En neddykket Filter Paper Sandwich til Langsigtet<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse Imaging af Early Chick embryoner

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Afledning af stamcellelinjer fra mus præimplantations embryoner

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Forberedelse af små RNA-biblioteker til sekventering fra tidlige museembryoner

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Generation af naive Blastoderm Explants fra Zebrafish Embryoner

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...