Name: isolation of preadipocytes from broiler chick embryos
Uploaded: 2022-08-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos at JoVE.com

Die Autoren danken UT AgResearch und dem Department of Animal Science für die Unterstützung und Optimierung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde durch USDA-Zuschuss finanziert.

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Tennessee genehmigt. Frisch befruchtete kommerzielle Masthähncheneier (Cobb 500) wurden aus einer lokalen Brüterei gewonnen. Die Eier wurden bei 38 °C mit 60% relativer Luftfeuchtigkeit bis zur Dissektion an den Embryonaltagen 16-18 (E16-E18) bebrütet. Fettgewebe wurde aus dem subkutanen (femoralen) Depot entnommen.
1. Vorbereitung auf Isolation und Kultur
<ol><li>Bereiten Sie die...

<ol>
	<li>Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).</li><li>Siegel, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+modern+broiler+and+feed+efficiency.">Evolution of the modern broiler and feed efficiency.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).</li><li>Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth,+efficiency,+and+yield+of+commercial+broilers+from+1957,+1978,+and+2005.">Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005.</a> Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).</li><li>Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+models+for+differentiation:+preadipocytes+and+adipocytes.">Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes.</a> Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).</li><li>Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+influence+on+stromal+vascular+fraction+cell+yield+obtained+from+human+lipoaspirates.">Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).</li><li>Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+changes+in+lipid+composition+and+lipoprotein+lipase+activity+during+the+development+of+the+chick+embryo.">Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).</li><li>Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+adipose+tissue+growth+through+hyperplasia+and+hypertrophy+in+the+embryonic+Leghorn+and+broiler.">Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler.</a> Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).</li><li>Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+size+and+docosahexaenoic+acid+content+of+adipocytes+during+chick+embryo+development.">Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development.</a> Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).</li><li>Claver, J. A., Quaglia, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphology,+development,+and+function+of+blood+cells+in+nonmammalian+vertebrates.">Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates.</a> Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).</li><li>. Corning Cell Counter Demo Video Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg">https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg</a> (2022)</li><li>Nema, R., Khare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+cell+culture:+Advance+technology+for+modern+research.">An animal cell culture: Advance technology for modern research.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).</li><li>Regassa, A., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oleic+acid+and+chicken+serum+on+the+expression+of+adipogenic+transcription+factors+and+adipogenic+differentiation+in+hen+preadipocytes.">Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes.</a> Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).</li><li>Temkin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crude+oil/dispersant+mixture+and+dispersant+components+on+PPAR+&#947;+activity+in+vitro+and+in+vivo:+identification+of+dioctyl+sodium+sulfosuccinate+(DOSS;+CAS#+577-11-7)+as+a+probable+obesogen.">Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR &#947; activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen.</a> Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).</li><li>Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+protocol+to+maximize+differentiation+of+human+preadipocytes+and+improve+metabolic+phenotypes.">A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes.</a> Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+adipocyte-derived+extracellular+vesicles+using+filtration+and+ultracentrifugation.">Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).</li><li>Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fungizone+in+control+of+fungi+and+yeasts+in+tissue+culture.">Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).</li><li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture.">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+swimming+dots+in+cell+culture:+the+identity,+detection+method+and+judging+criteria.">Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria.</a> bioRxiv. , 366906 (2018).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).</li></ol>

Obwohl mehrere gut beschriebene Protokolle über die Isolierung von Präadipozyten14,15,16,17 berichtet haben, wurde die Isolierung für embryonale Präadipozyten optimiert, die für funktionelle Analysen des Fettwachstums und der Entwicklung im frühen Leben bei Masthähnchenküken verwendet werden kann. Dieses Protokoll liefert embryonale Adipozyten-Vorläufer mit hoher Lebensfähigkeit und h...

Fettleibigkeit ist eine globale Gesundheitsbedrohung für Erwachsene und Kinder. Kinder, die übergewichtig oder fettleibig sind, sind etwa fünfmal häufiger fettleibig als Erwachsene, was sie einem signifikant erhöhten Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Diabetes und viele andere Komorbiditäten aussetzt. Etwa 13,4% der US-Kinder im Alter von 2-5 Jahren haben Fettleibigkeit1, was zeigt, dass die Tendenz, überschüssiges Körperfett anzusammeln, sehr früh im Leben in Gang gesetzt werden kann. Aus sehr unterschiedlichen Gründen ist die Ansammlung von überschüssigem Fettgewebe ein Problem für Masthühner (Fleisch). Moderne Masthähnchen sind unglaublich effizient, akkumulieren aber immer noch mehr Lipid als physiologisch notwendigist 2,3. Diese Tendenz beginnt kurz nach dem Schlüpfen und verschwendet effektiv Futter, die teuerste Produktionskomponente, indem sie es vom Muskelwachstum weg verteilt. Daher besteht sowohl für Kinder als auch für Masthühner, wenn auch aus sehr unterschiedlichen Gründen, die Notwendigkeit, Faktoren zu verstehen, die die Entwicklung des Fettgewebes beeinflussen, und Wege zu finden, die Fettexpansion früh im Leben zu begrenzen.
Adipozyten bilden sich aus Präadipozyten, aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen, die einer Differenzierung unterzogen werden, um reife, lipidspeichernde Fettzellen zu entwickeln. Dementsprechend sind Präadipozyten in vitro ein wertvolles experimentelles Modell für Adipositasstudien. Diese Zellen, die aus der stromalen vaskulären Fraktion der Fettdepots isoliert sind, können ein grundlegendes Verständnis der molekularen Signalwege liefern, die die Differenzierung und den Stoffwechsel der Adipozyten steuern 4,5. Kükenembryonen sind ein günstiges experimentelles Modell in Entwicklungsstudien, da die Kultivierung von Eiern nach dem gewünschten Zeitplan die experimentelle Manipulation erleichtert, da sie es ermöglicht, Embryonen ohne das Opfer der Mutter zu erhalten, um eine Reihe von Entwicklungsstadien von Embryonen zu beobachten. Darüber hinaus sind komplizierte chirurgische Eingriffe und längere Zeiträume nicht erforderlich, um Embryonen im Vergleich zu größeren Tiermodellen zu erhalten. Daher bietet der Kükenembryo die Möglichkeit, Präadipozyten aus den frühesten Stadien der Fettgewebeentwicklung zu erhalten. Unterhautfettgewebe wird im Küken um den 12. Embryonaltag (E12) als klar definiertes Depot um den Oberschenkel herum sichtbar. Dieses Depot ist mit hochproliferativen Präadipozyten angereichert, die unter Entwicklungshinweisen aktiv differenziert werden, um reife Adipozytenzu bilden 6,7. Der Prozess der adipogenen Differenzierung ist zwischen Hühnern und Menschen vergleichbar. Daher können Präadipozyten, die aus Kükenembryonen isoliert wurden, als Zweizweckmodell für Studien verwendet werden, die für Menschen und Geflügel relevant sind. Die Ausbeute an Präadipozyten nimmt jedoch mit zunehmendem Alter ab, da die Zellen zu reifen Adipozyten heranwachsen5.
Das vorliegende Protokoll optimiert die Isolierung von Präadipozyten aus Fettgewebe während des Stadiums (E16-E18), in dem adipogene Differenzierung und Adipozytenhypertrophie in Masthähnchenkükenembryonen ihren Höhepunkt erreichen8. Dieses Verfahren kann die Auswirkungen von Faktoren, denen der sich entwickelnde Embryo in Ovo ausgesetzt ist, wie z. B. die Ernährung von Hühnern, auf die Adipozytenentwicklung und das adipogene Potenzial ex vivo bewerten. Es kann auch den Einfluss verschiedener Manipulationen (z. B. Hypoxie, Nährstoffzusätze, pharmakologische Agonisten und Antagonisten) auf die Adipogenese oder die verschiedenen Ome (z. B. Transkriptom, Metabolom, Methylom) von Adipozytenvorläufern testen. Als Darstellung des frühesten Stadiums der Fettbildung sind die mit diesem Protokoll erhaltenen Zellen wertvolle Modelle für Studien, die für Geflügel und Menschen relevant sind.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683825</td>
			<td>Single Channel Pipette, 100 - 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette Tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A426P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Flask</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4980-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F75P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>Tissue Culture-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Assay Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Plate, Black Bottom</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue Culture-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Wiper (Kimtechwiper)</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Up &#38; Up</td>
			<td>NDC 1167300334</td>
			<td>20% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 40 &#181;m</td>
			<td>SPL</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugaton</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes, 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>343958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps, 100 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Surgical Scissors, 115 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SYNSV0000</td>
			<td>Despensed as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30023.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td>70% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Evos</td>
			<td>M7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td></td>
			<td>Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Container</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>4055</td>
			<td>2% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocytometer (Counting Chamber)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>480200</td>
			<td>0.1 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Sterilizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>B1205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9655</td>
			<td>1x Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Evos</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Channel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661070</td>
			<td>12-Channel Pipetters, 30 - 300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>KS130BS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towel</td>
			<td>Tork</td>
			<td>RK8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Steptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>1x Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 100 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 60 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservior</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Beaker, 100 mL</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>762703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps, 120 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-4960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Scissors, 140 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>Tissue Culture-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Strainer, 250 &#181;m</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>87791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>0.1% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, 110 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of preadipocytes from broiler chick embryos

Primäre Präadipozyten sind ein wertvolles experimentelles System zum Verständnis der molekularen Signalwege, die die Differenzierung und den Stoffwechsel von Adipozyten steuern. Hühnerembryonen bieten die Möglichkeit, Präadipozyten vom frühesten Stadium der Fettentwicklung an zu isolieren. Diese Primärzelle kann verwendet werden, um Faktoren zu identifizieren, die die Präadipozytenproliferation und die adipogene Differenzierung beeinflussen, was sie zu einem wertvollen Modell für Studien im Zusammenhang mit Fettleibigkeit bei Kindern und der Kontrolle der überschüssigen Fettablagerung bei Geflügel macht. Das schnelle Wachstum von postnatalem Fettgewebe verschwendet effektiv Futter, indem es vom Muskelwachstum bei Masthühnern wegverteilt wird. Daher können Methoden zum Verständnis der frühesten Stadien der Fettgewebeentwicklung Hinweise geben, um diese Tendenz zu regulieren und Wege zu finden, die Fettausdehnung früh im Leben zu begrenzen. Die vorliegende Studie wurde entwickelt, um eine effiziente Methode zur Isolierung, Primärkultur und adipogenen Differenzierung von Präadipozyten zu entwickeln, die aus sich entwickelndem Fettgewebe kommerzieller Masthähnchen-Kükenembryonen (Fleischtyp) isoliert wurden. Das Verfahren wurde optimiert, um Zellen mit hoher Lebensfähigkeit (~ 98%) und erhöhter Fähigkeit zur Differenzierung in reife Adipozyten zu erhalten. Diese einfache Methode der embryonalen Präadipozytenisolierung, -kultur und -differenzierung unterstützt funktionelle Analysen des Fettwachstums und der Entwicklung im frühen Leben.

Primäre Präadipozyten sind morphologisch ähnlich wie Fibroblasten, mit unregelmäßigen, sternförmigen Formen und einem zentralen Kern (Abbildung 2A-C). Die Zellen haften leicht an Gewebekulturplastik und beginnen sich bald nach der Anheftung zu vermehren. Sie differenzieren und akkumulieren schnell Lipidtröpfchen (Abbildung 3D), wenn sie mit Fettsäuren in den Medien versorgt werden. Die Lebensfähigkeit (98%, basierend au...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos at JoVE.com

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung von Präadipozyten aus Fettgewebe in Masthähnchenembryonen. Diese Methode ermöglicht die Isolierung mit hoher Ausbeute, Primärkultur und adipogener Differenzierung von Präadipozyten. Öl-Rot-O-Färbung und Lipid-/DNA-Färbung maßen die adipogene Fähigkeit isolierter Zellen, die mit Differenzierungsmedien induziert wurden.

Isolierung von Präadipozyten aus Masthähnchen-Kieferembryonen

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

Primäre Präadipozyten sind ein wertvolles experimentelles System zum Verständnis der molekularen Signalwege, die den Adipozytenstoffwechsel steuern. Hühnerembryonen bieten die Möglichkeit, Präadipozyten vom frühesten Stadium der Adipozytenentwicklung an zu isolieren. Diese Methode wurde optimiert, um Zellen mit hoher Lebensfähigkeit und erhöhter Differenzierungsfähigkeit in reife Adipozyten zu erhalten, die für die funktionelle Analyse des frühen Lebensfettwachstums und der Entwicklung von Embryonen bei Küken verwendet werden können.Der Prozess der adipogenen Differenzierung ist zwischen Hühnern und Menschen in hohem Maße vergleichbar. Daher können isolierte Präadipozyten als Dual-vorgeschlagenes Modell für Studien verwendet werden, die für Mensch und Geflügel relevant sind. Um den Embryonenkörper mit 70% Ethanol abzutupfen.Um Interferenzen während der Filtration bei späteren Schritten nach der Verdauung zu vermeiden, schrubben Sie die Hautoberfläche vorsichtig mit steriler Gaze, um Federn zu entfernen. Schneiden Sie dann die Haut zwischen den Beinen und der Bauchregion ab, um das Paar femoraler Fettdepots freizulegen. Verwenden Sie gebogene Pinzetten mit einer Hand, um die Haut um das Bein zu halten und das femure subkutane Fett vorsichtig zu entfernen.mit der anderen Hand. Verwenden Sie später eine gebogene Pinzette, um das Depot vorsichtig vom Bein wegzuziehen. Geben Sie das Gewebe in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern Sammelmedien und wiederholen Sie die Dissektion für die andere Seite des Fettpolsters.Geben Sie nun die gesammelten Fettpolster in eine 60-Millimeter-Petrischale mit Sterilisationslösung und spülen Sie sie kurz ab, indem Sie die Schale einige Male schwenken. Dann spülen Sie die Sterilisationslösung ab, indem Sie die Fettpads in eine 60-Millimeter-Petrischale mit PBS geben. Den Teller vorsichtig schwenken und erneut mit PBS waschen.Zur Verdauung des Fettgewebes in ein 15-Millimeter-Rohr mit vorwarmer enzymatischer Lösung überführen. Tauchen Sie dann eine lange gerade Schere in die Tube und zerkleinern Sie schließlich das Fettgewebe in der Lösung in möglichst kleine Stücke. Überführen Sie das gehackte Gewebe und die enzymatische Lösung in einen 25-Milliliter-Autoklavenkolben.Umwickeln Sie den Kolben mit Paraffinfolie und legen Sie den Kolben zur Verdauung in einen orbitalen Shaker-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nach der Verdauung vorsichtig auf und ab pipettieren, um sich gut zu vermischen. Entfernen Sie dann alle unverdauten Gewebestücke und Ablagerungen, indem Sie durch ein 250 Mikrometer langes Gewebesieb durch Pipettieren in ein 15-Milliliter-Rohr filtern.Entfernen Sie nun die am Kolben haften Zellen, indem Sie den Kolben mit vier Millilitern Wachstumsmedien spülen und die Zellsuspension in das gleiche 15-Milliliter-Rohr filtern. Als nächstes spülen Sie das Sieb ab, indem Sie das Wachstumsmedium erneut pipettieren, um alle im Filter eingeschlossenen Zellen zu entfernen. Zentrifugieren Sie bei 300 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellfraktion zu pelletieren und den Überstand abzusaugen, ohne das Zellpellet zu stören.Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig in einem Milliliter Lysepuffer für rote Blutkörperchen, mischen Sie gut durch Pipettieren und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Dann verdünnen Sie die Zellen, indem Sie fünf Milliliter Wachstumsmedien in die Röhre geben, die die Zellen enthält, und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren. Pipettieren Sie nun die Zellen auf ein 40-Mikrometer-Zellsieb und filtern Sie sie in ein neues 50-Milliliter-Rohr.Dann spülen Sie das Sieb mit zusätzlichen fünf Millilitern Wachstumsmedien aus und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 300 mal G für sieben Minuten bei Raumtemperatur. Den Überstand vorsichtig abspritzen. Resuspendiert das verbleibende Zellpellet in einem Milliliter Wachstumsmedien durch Pipettieren Um die Zelldichte und Lebensfähigkeit zu bestimmen, mischen Sie 10 Mikroliter jeder Probe in Trypanblau durch Pipettieren.Laden Sie 10 Mikroliter der Mischung auf das Hämozytometer und zählen Sie die Zellen. Die Analyse der Präadipozyten nach 24, 48 und 72 Stunden zeigte eine normale Zellmorphologie und -anzahl. Die adipogene Induktion von Präadipozyten zeigte eine schnelle Differenzierung und Akkumulation von Lipidtröpfchen.Der aggressive Umgang mit Präadipozyten während der Isolierung führte zu Zellschäden und geringer Zellzahl. Eine mikrobielle Kontamination kann trotz vorbeugender Maßnahmen beobachtet werden. Die Lipidfärbung mit ölrotem O zeigte, dass die Präadipozyten unter adipogenem Anreiz schnell Lipidtröpfchen entwickeln und die Akkumulation im Laufe der Zeit fortschreitet, wie in 24, 48 und 72 Stunden beobachtet.Die Lipidakkumulation relativ zur Zellzahl wurde mit Hilfe von Lipid- und DNA-Flecken quantifiziert. Sowohl die Lipidakkumulation als auch die Zellproliferation nahmen im Laufe der Zeit zu. Niedrige Zellzahlen oder beschädigte Zellen können beobachtet werden, wenn die Gewebefraktionen zu lange verdaut werden.Daher wird empfohlen, dass eineinhalb Stunden Verdauung nicht überschritten werden. Isolierte Präadipozyten können für Genexpressionsstudien verwendet werden. Es kann ausreichend RNA für den Einsatz in der cDNA-Synthese und der anschließenden qPCR oder RNAseq gewonnen werden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimierte<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Züchtung von Hühnerembryonen zu fortgeschrittenen Entwicklungsstadium

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Vorwärts genetische Ansatz zur Stressresistenz-Gene in Mäuse Entdecken - Hochdurchsatz-Bildschirm in ES-Zellen

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Primäre Endodermal Epithelial Cell Culture aus dem Dottersack-Membran der japanischen Wachtel Embry

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affinitatsmarkierung Nachweis endogener Receptors von Zebrafischembryonen

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Zeitraffer-Imaging von frühen Hühnerembryonen

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Erzeugung naiver Blastoderm-Expflanzen aus Zebrafisch-Embryonen

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...