Name: isolation of preadipocytes from broiler chick embryos
Uploaded: 2022-08-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos at JoVE.com

המחברים מודים ל- UT AgResearch ולמחלקה למדעי בעלי החיים על התמיכה והאופטימיזציה של פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי מענק USDA.

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת טנסי. ביצי ברוילר מסחריות מופרות טריות (קוב 500) התקבלו ממדגרה מקומית. ביצים דוגרו בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס עם 60% לחות יחסית עד לניתוחים בימים העובריים 16-18 (E16-E18). רקמת השומן נאספה מהמחסן התת עורי (עצם הי?...

<ol>
	<li>Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).</li><li>Siegel, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+modern+broiler+and+feed+efficiency.">Evolution of the modern broiler and feed efficiency.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).</li><li>Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth,+efficiency,+and+yield+of+commercial+broilers+from+1957,+1978,+and+2005.">Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005.</a> Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).</li><li>Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+models+for+differentiation:+preadipocytes+and+adipocytes.">Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes.</a> Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).</li><li>Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+influence+on+stromal+vascular+fraction+cell+yield+obtained+from+human+lipoaspirates.">Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).</li><li>Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+changes+in+lipid+composition+and+lipoprotein+lipase+activity+during+the+development+of+the+chick+embryo.">Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).</li><li>Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+adipose+tissue+growth+through+hyperplasia+and+hypertrophy+in+the+embryonic+Leghorn+and+broiler.">Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler.</a> Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).</li><li>Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+size+and+docosahexaenoic+acid+content+of+adipocytes+during+chick+embryo+development.">Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development.</a> Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).</li><li>Claver, J. A., Quaglia, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphology,+development,+and+function+of+blood+cells+in+nonmammalian+vertebrates.">Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates.</a> Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).</li><li>. Corning Cell Counter Demo Video Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg">https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg</a> (2022)</li><li>Nema, R., Khare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+cell+culture:+Advance+technology+for+modern+research.">An animal cell culture: Advance technology for modern research.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).</li><li>Regassa, A., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oleic+acid+and+chicken+serum+on+the+expression+of+adipogenic+transcription+factors+and+adipogenic+differentiation+in+hen+preadipocytes.">Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes.</a> Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).</li><li>Temkin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crude+oil/dispersant+mixture+and+dispersant+components+on+PPAR+&#947;+activity+in+vitro+and+in+vivo:+identification+of+dioctyl+sodium+sulfosuccinate+(DOSS;+CAS#+577-11-7)+as+a+probable+obesogen.">Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR &#947; activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen.</a> Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).</li><li>Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+protocol+to+maximize+differentiation+of+human+preadipocytes+and+improve+metabolic+phenotypes.">A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes.</a> Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+adipocyte-derived+extracellular+vesicles+using+filtration+and+ultracentrifugation.">Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).</li><li>Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fungizone+in+control+of+fungi+and+yeasts+in+tissue+culture.">Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).</li><li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture.">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+swimming+dots+in+cell+culture:+the+identity,+detection+method+and+judging+criteria.">Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria.</a> bioRxiv. , 366906 (2018).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).</li></ol>

אף על פי שכמה פרוטוקולים שתוארו היטב דיווחו על בידוד של פרדיפוציטים 14,15,16,17, בידוד עבור פראדיפוציטים עובריים עבר אופטימיזציה, אשר יכול לשמש לניתוחים פונקציונליים של צמיחת שומן מוקדם בחיים והתפתחות אצל אפרוחי ברוילר. פר...

השמנת יתר היא איום בריאותי עולמי על מבוגרים וילדים כאחד. ילדים הסובלים מעודף משקל או מהשמנת יתר נמצאים בסיכון גבוה פי חמישה בערך להיות שמנים כמבוגרים, מה שמציב אותם בסיכון מוגבר באופן משמעותי למחלות לב וכלי דם, סוכרת ותחלואה נלווית רבים אחרים. כ -13.4% מהילדים בארה"ב בגילאי 2-5 סובלים מהשמנת יתר1, מה שממחיש כי הנטייה לצבור עודפי שומן בגוף יכולה להיות מופעלת בשלב מוקדם מאוד בחיים. מסיבות שונות מאוד, הצטברות של עודף רקמת שומן היא דאגה עבור תרנגולות broiler (סוג בשר). ברוילרים מודרניים יעילים להפליא אך עדיין צוברים יותר שומנים ממה שנחוץ מבחינה פיזיולוגית 2,3. נטייה זו מתחילה זמן קצר לאחר הבקיעה ולמעשה מבזבזת מזון, מרכיב הייצור היקר ביותר, על ידי הקצאתו הרחק מצמיחת השרירים. לכן, הן עבור ילדים והן עבור תרנגולות broiler, אם כי מסיבות שונות מאוד, יש צורך להבין גורמים המשפיעים על התפתחות רקמת השומן ולזהות דרכים להגביל את התפשטות השומן בשלב מוקדם בחיים.
אדיפוציטים נוצרים מפראדיפוציטים, תאי גזע שמקורם ברקמת השומן שעוברים התמיינות כדי לפתח תאי שומן בוגרים המאחסנים שומנים. לפיכך, פראדיפוציטים במבחנה הם מודל ניסיוני רב ערך למחקרי השמנת יתר. תאים אלה, המבודדים מחלק כלי הדם הסטרומיים של מחסני השומן, יכולים לספק הבנה בסיסית של מסלולים מולקולריים השולטים בהתמיינות האדיפוציטים ובחילוף החומרים 4,5. עוברי אפרוחים הם מודל ניסיוני נוח במחקרים התפתחותיים מכיוון שצבירת ביציות בלוח הזמנים הרצוי מקלה על מניפולציה ניסיונית, שכן היא מאפשרת להשיג עוברים ללא הקרבה של האם כדי לצפות בסדרה של שלבים התפתחותיים של עוברים. יתר על כן, הליכים כירורגיים מסובכים ותקופות זמן ממושכות אינם נדרשים כדי להשיג עוברים ביחס למודלים גדולים יותר של בעלי חיים. לכן, עובר האפרוח מציג הזדמנות להשיג פרדיפוציטים מהשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות רקמת השומן. רקמת שומן תת עורית נראית באפרוח סביב היום העוברי 12 (E12) כמחסן מוגדר בבירור הממוקם סביב הירך. מחסן זה מועשר בפראדיפוציטים מתרבים מאוד שעוברים באופן פעיל התמיינות תחת רמזים התפתחותיים ליצירת אדיפוציטים בוגרים 6,7. תהליך ההבחנה האדיפוגנית דומה בין תרנגולות לבני אדם. לכן, פראדיפוציטים המבודדים מעוברי אפרוחים יכולים לשמש כמודל דו-תכליתי למחקרים הרלוונטיים לבני אדם ועופות. עם זאת, התשואה של preadipocytes יורד עם ההזדקנות ככל שהתאים גדלים לתוך אדיפוציטים בוגרים5.
הפרוטוקול הנוכחי מייעל את הבידוד של פראדיפוציטים מרקמת השומן במהלך השלב (E16-E18) שבו התמיינות אדיפוגנית והיפרטרופיה של אדיפוציטים נמצאים בשיאם בעוברי אפרוחי ברוילר8. הליך זה יכול להעריך את ההשפעות של גורמים שאליהם העובר המתפתח נחשף באובו, כגון תזונת התרנגולת, על התפתחות אדיפוציטים ופוטנציאל אדיפוגני ex vivo. הוא יכול גם לבחון את ההשפעה של מניפולציות שונות (למשל, היפוקסיה, תוספות מזינות, אגוניסטים פרמקולוגיים ואנטגוניסטים) על אדיפוגנזה או על ה'אומות' השונות (למשל, תעתיק, מטבוליום, מתילום) של אבות אדיפוציטים. כייצוג של השלב המוקדם ביותר של היווצרות השומן, תאים המתקבלים באמצעות פרוטוקול זה הם מודלים חשובים למחקרים הרלוונטיים לעופות ולבני אדם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683825</td>
			<td>Single Channel Pipette, 100 - 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette Tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A426P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Flask</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4980-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F75P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>Tissue Culture-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Assay Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Plate, Black Bottom</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue Culture-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Wiper (Kimtechwiper)</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Up &#38; Up</td>
			<td>NDC 1167300334</td>
			<td>20% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 40 &#181;m</td>
			<td>SPL</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugaton</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes, 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>343958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps, 100 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Surgical Scissors, 115 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SYNSV0000</td>
			<td>Despensed as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30023.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td>70% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Evos</td>
			<td>M7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td></td>
			<td>Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Container</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>4055</td>
			<td>2% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocytometer (Counting Chamber)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>480200</td>
			<td>0.1 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Sterilizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>B1205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9655</td>
			<td>1x Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Evos</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Channel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661070</td>
			<td>12-Channel Pipetters, 30 - 300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>KS130BS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towel</td>
			<td>Tork</td>
			<td>RK8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Steptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>1x Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 100 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 60 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservior</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Beaker, 100 mL</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>762703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps, 120 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-4960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Scissors, 140 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>Tissue Culture-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Strainer, 250 &#181;m</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>87791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>0.1% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, 110 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of preadipocytes from broiler chick embryos

פרדיפוציטים ראשוניים הם מערכת ניסויים רבת ערך להבנת המסלולים המולקולריים השולטים בהתמיינות אדיפוציטים ובחילוף החומרים. עוברי עוף מספקים את ההזדמנות לבודד פראדיפוציטים מהשלב המוקדם ביותר של התפתחות השומן. תא ראשוני זה יכול לשמש לזיהוי גורמים המשפיעים על התפשטות פראדיפוציטים והתמיינות אדיפוגנית, מה שהופך אותם למודל רב ערך למחקרים הקשורים להשמנת יתר בילדות ושליטה בתצהיר שומן עודף בעופות. הצמיחה המהירה של רקמת השומן לאחר הלידה מבזבזת למעשה את ההזנה על ידי הקצאתה הרחק מצמיחת השרירים בתרנגולות ברוילר. לכן, שיטות להבנת השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות רקמת השומן עשויות לספק רמזים לווסת נטייה זו ולזהות דרכים להגביל את התפשטות השומן בשלב מוקדם בחיים. המחקר הנוכחי נועד לפתח שיטה יעילה לבידוד, לתרבית ראשונית ולהבחנה אדיפוגנית של פראדיפוציטים שבודדו מרקמת שומן מתפתחת של עוברי אפרוחים מסחריים מסוג ברוילר (סוג בשר). ההליך עבר אופטימיזציה כדי להניב תאים עם כדאיות גבוהה (~ 98%) ויכולת מוגברת להתמיין לאדיפוציטים בוגרים. שיטה פשוטה זו של בידוד, תרבית והתמיינות של פראדיפוציטים עובריים תומכת בניתוחים פונקציונליים של גדילת השומן והתפתחותו בתחילת החיים.

פראדיפוציטים ראשוניים דומים מבחינה מורפולוגית לפיברובלסטים, עם צורות לא סדירות דמויות כוכבים וגרעין מרכזי (איור 2A-C). התאים נצמדים בקלות לפלסטיק תרבית רקמה ומתחילים להתרבות זמן קצר לאחר ההתקשרות. הם מתמיינים במהירות וצוברים טיפות שומנים (איו?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos at JoVE.com

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה לבידוד פראדיפוציטים מרקמת שומן בעוברי ברוילר. שיטה זו מאפשרת בידוד עם תפוקה גבוהה, תרבית ראשונית והתמיינות אדיפוגנית של פראדיפוציטים. צביעת O אדום שמן וכתם שומנים/דנ"א מדדו את היכולת האדיפוגנית של תאים מבודדים המושרים עם אמצעי התמיינות.

בידוד של פרדיפוציטים מעוברי אפרוחי ברוילר

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

פרדיפוציטים ראשוניים הם מערכת ניסויים רבת ערך להבנת המסלולים המולקולריים השולטים בחילוף החומרים של אדיפוציטים. עוברי עוף מספקים את ההזדמנות לבודד פראדיפוציטים מהשלב המוקדם ביותר של התפתחות אדיפוציטים. שיטה זו עברה אופטימיזציה כדי להניב תאים עם כדאיות גבוהה ויכולת מוגברת להתמיין לאדיפוציט בוגר, אשר יכול לשמש לניתוח פונקציונלי של צמיחת שומן מוקדם בחיים ועובר התפתחות אצל אפרוחים.תהליך ההבחנה האדיפוגנית דומה מאוד בין תרנגולות לבני אדם. לכן, preadipocytes מבודדים יכולים לשמש כמודל מוצע כפול למחקרים רלוונטיים לבני אדם ועופות. כדי להתחיל לטבול את הגוף העובר עם 70% אתנול.לאחר מכן כדי למנוע הפרעות במהלך הסינון בשלבים מאוחרים יותר לאחר העיכול קרצפו בעדינות את פני העור עם גזה סטרילית כדי להסיר נוצות. לאחר מכן חתכו את העור בין הרגליים לאזור הבטן כדי לחשוף את זוג מחסני שומן הירך. השתמש במלקחיים מעוקלים ביד אחת כדי להחזיק את העור סביב הרגל ולהסיר בעדינות את השומן התת עורי הירך.עם היד השנייה. מאוחר יותר, השתמש במלקחיים מעוקלים כדי למשוך בעדינות את המחסן הרחק מהרגל. מעבירים את הרקמות לצינור 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטרים של מדיית איסוף וחוזרים על הנתיחה לצד השני של כרית השומן.כעת, העבירו את רפידות השומן שנאספו לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה תמיסת עיקור ושטפו לזמן קצר על ידי מערבולת המנה מספר פעמים. לאחר מכן יש לשטוף את תמיסת העיקור על ידי העברת רפידות השומן לצלחת פטרי 60 מילימטר המכילה PBS. סובבו בעדינות את הצלחת ושוב, התרחצו עם PBS.לעיכול של רקמות השומן, להעביר אותם לצינור 15 מילימטר המכיל תמיסה אנזימטית טרום חמה. לאחר מכן לטבול זוג מספריים ישרים ארוכים בצינור ולבסוף לטחון את רקמות השומן בתמיסה לחתיכות קטנות ככל האפשר. מעבירים את הרקמה הטחונה והתמיסה האנזימטית לבקבוקון אוטו-חלבי של 25 מיליליטר.עוטפים את הבקבוקון בסרט פרפין ומניחים את הבקבוקון באינקובטור שייקר מסלולי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לעיכול. לאחר העיכול, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. לאחר מכן הסר את כל הפיסות של רקמות ופסולת לא מעוכלות על ידי סינון דרך מסננת רקמה של 250 מיקרומטר לתוך צינור 15 מיליליטר על ידי צנרת.כעת, הסר את התאים שנדבקו לבקבוקון על ידי שטיפת הבקבוקון עם ארבעה מיליליטרים של מדיית גדילה וסנן את תרחיף התא לאותו צינור 15 מיליליטר. לאחר מכן יש לשטוף את המסננת על ידי צנרת מדיית הגדילה שוב כדי להסיר את כל התאים הלכודים במסנן. צנטריפוגה ב-300 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לפוצץ את שבר התא ולשאוף את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא.יש לבצע החייאה עדינה של הכדור במיליליטר אחד של מאגר ליזה של תאי דם אדומים, לערבב היטב על ידי צנרת ולדגום במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דיללו את התאים על ידי הוספת חמישה מיליליטרים של מדיית גדילה לצינור המכיל את התאים וערבבו אותם בעדינות על ידי צנרת. כעת, טפטפו את התאים למסננת תאים של 40 מיקרומטר וסיננו אותם לצינור חדש של 50 מיליליטר.לאחר מכן יש לשטוף את המסננת עם חמישה מיליליטרים נוספים של מדיית גדילה ולהשליך את התאים על ידי צנטריפוגה ב-300 פעמים G במשך שבע דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות לשאוף את supernatant. בצעו שימוש חוזר בכדור התא הנותר במיליליטר אחד של מדיית גדילה על ידי צנרת כדי לקבוע את צפיפות התאים ואת יכולת הכדאיות, ערבבו 10 מיקרוליטרים של כל דגימה בכחול טריפאן על ידי צנרת.טען 10 מיקרוליטרים של התערובת על ההמוציטומטר וספור את התאים. ניתוח של פראדיפוציטים לאחר 24, 48 ו-72 שעות הראה מורפולוגיה ומספר תאים תקינים. אינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים הראתה התמיינות מהירה והצטברות של טיפות שומנים.טיפול אגרסיבי בפראדיפוציטים במהלך הבידוד גרם לנזק לתאים ולמספר תאים נמוך. זיהום מיקרוביאלי ניתן לראות למרות נקיטת אמצעי מניעה. צביעת שומנים בשמן אדום O הצביעה על כך שהפרדיפוציטים מתחילים לפתח במהירות טיפות שומנים תחת תמריצים אדיפוגניים והתקדמות ההצטברות לאורך זמן כפי שנצפה תוך 24, 48 ו-72 שעות.הצטברות השומנים ביחס למספר התאים כומתה באמצעות כתמי שומנים ודנ"א. גם הצטברות השומנים וגם התפשטות התאים גדלו עם הזמן. ניתן לראות מספר תאים נמוך או תאים פגומים כאשר שברי הרקמה מתעכלים זמן רב מדי.לכן, מומלץ כי שעה וחצי של עיכול הוא לא יעלה. פראדיפוציטים מבודדים יכולים לשמש למחקרי ביטוי גנים. ניתן להשיג מספיק RNA לשימוש בסינתזת cDNA ומעקב אחר qPCR או RNAseq.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

מותאם באופן מיטבי<em&gt; Ex-אובו</em&gt; Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

גישה גנטית קדימה ללחשוף גני התנגדות מתח בעכברים - מסך תפוקה גבוהה בתאי גזע עובריים

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך<em&gt; אקס אובו</em&gt; זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ&#39;יק עובר

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

הכנת ספריות RNA קטנות לצורך רצף של עוברי עכבר מוקדם

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

דור של מסלקי בלסטודרם נאיביים מעוברי דגי זברה

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...