Name: isolation of preadipocytes from broiler chick embryos
Uploaded: 2022-08-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos at JoVE.com

Forfatterne takker UT AgResearch og Institutt for dyrevitenskap for å støtte og optimalisere denne protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av USDA grant.

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av University of Tennessee Institutional Animal Care and Use Committee. Nybefruktede kommersielle broileregg (Cobb 500) ble hentet fra et lokalt klekkeri. Egg ble inkubert ved 38 °C med 60 % relativ luftfuktighet frem til disseksjoner på embryonale dager 16-18 (E16-E18). Fettvev ble samlet inn fra det subkutane (femorale) depotet.
1. Forberedelse til isolasjon og kultur
<ol><li>Forbered kulturhetten og instrumentene.<ol>
<li>Før du starter...

<ol>
	<li>Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).</li><li>Siegel, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+modern+broiler+and+feed+efficiency.">Evolution of the modern broiler and feed efficiency.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).</li><li>Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth,+efficiency,+and+yield+of+commercial+broilers+from+1957,+1978,+and+2005.">Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005.</a> Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).</li><li>Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+models+for+differentiation:+preadipocytes+and+adipocytes.">Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes.</a> Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).</li><li>Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+influence+on+stromal+vascular+fraction+cell+yield+obtained+from+human+lipoaspirates.">Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).</li><li>Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+changes+in+lipid+composition+and+lipoprotein+lipase+activity+during+the+development+of+the+chick+embryo.">Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).</li><li>Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+adipose+tissue+growth+through+hyperplasia+and+hypertrophy+in+the+embryonic+Leghorn+and+broiler.">Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler.</a> Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).</li><li>Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+size+and+docosahexaenoic+acid+content+of+adipocytes+during+chick+embryo+development.">Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development.</a> Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).</li><li>Claver, J. A., Quaglia, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphology,+development,+and+function+of+blood+cells+in+nonmammalian+vertebrates.">Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates.</a> Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).</li><li>. Corning Cell Counter Demo Video Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg">https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg</a> (2022)</li><li>Nema, R., Khare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+cell+culture:+Advance+technology+for+modern+research.">An animal cell culture: Advance technology for modern research.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).</li><li>Regassa, A., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oleic+acid+and+chicken+serum+on+the+expression+of+adipogenic+transcription+factors+and+adipogenic+differentiation+in+hen+preadipocytes.">Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes.</a> Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).</li><li>Temkin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crude+oil/dispersant+mixture+and+dispersant+components+on+PPAR+&#947;+activity+in+vitro+and+in+vivo:+identification+of+dioctyl+sodium+sulfosuccinate+(DOSS;+CAS#+577-11-7)+as+a+probable+obesogen.">Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR &#947; activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen.</a> Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).</li><li>Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+protocol+to+maximize+differentiation+of+human+preadipocytes+and+improve+metabolic+phenotypes.">A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes.</a> Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+adipocyte-derived+extracellular+vesicles+using+filtration+and+ultracentrifugation.">Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).</li><li>Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fungizone+in+control+of+fungi+and+yeasts+in+tissue+culture.">Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).</li><li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture.">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+swimming+dots+in+cell+culture:+the+identity,+detection+method+and+judging+criteria.">Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria.</a> bioRxiv. , 366906 (2018).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).</li></ol>

Selv om flere godt beskrevne protokoller har rapportert isolering av preadipocytter 14,15,16,17, isolasjon for embryonale preadipocytter har blitt optimalisert, som kan brukes til funksjonelle analyser av tidlig liv fett vekst og utvikling i broiler kyllinger. Denne protokollen gir høy levedyktighet embryonale adipocytt forfedre med høyt differensieringspotensial. Videre er den presenterte pr...

Fedme er en global helsetrussel for både voksne og barn. Barn som er overvektige eller overvektige er omtrent fem ganger mer sannsynlig å være overvektige som voksne, noe som gir dem betydelig økt risiko for kardiovaskulær sykdom, diabetes og mange andre komorbiditeter. Omtrent 13,4% av amerikanske barn i alderen 2-5 har fedme1, noe som illustrerer at tendensen til å akkumulere overflødig kroppsfett kan settes i gang veldig tidlig i livet. Av svært forskjellige grunner er opphopning av overflødig fettvev en bekymring for broiler (kjøtttype) kyllinger. Moderne broilere er utrolig effektive, men akkumulerer fortsatt mer lipid enn det som er fysiologisk nødvendig 2,3. Denne tendensen begynner kort tid etter luke og kaster effektivt bort fôr, den dyreste produksjonskomponenten, ved å tildele den bort fra muskelvekst. Derfor, for både barn og kyllingekyllinger, om enn av svært forskjellige grunner, er det behov for å forstå faktorer som påvirker fettvevsutvikling og identifisere måter å begrense fettutvidelse tidlig i livet.
Adipocytter dannes fra preadipocytter, fettvevsavledede stamceller som gjennomgår differensiering for å utvikle modne, lipidlagring av fettceller. Følgelig er preadipocytter in vitro en verdifull eksperimentell modell for fedmestudier. Disse cellene, isolert fra den stromale vaskulære brøkdelen av fettdepoter, kan gi en grunnleggende forståelse av molekylære veier som kontrollerer adipocytdifferensiering og metabolisme 4,5. Chick embryoer er en gunstig eksperimentell modell i utviklingsstudier fordi dyrking av egg på ønsket tidsplan gjør eksperimentell manipulasjon enklere, da det gjør det mulig å skaffe embryoer uten mors offer for å observere en rekke utviklingsstadier av embryoer. Videre er det ikke nødvendig med kompliserte kirurgiske prosedyrer og lange tidsperioder for å oppnå embryoer i forhold til større dyremodeller. Derfor presenterer kyllingembryoen en mulighet til å oppnå preadipocytter fra de tidligste stadiene av fettvevsutvikling. Subkutant fettvev blir synlig hos kyllingen rundt embryonal dag 12 (E12) som et klart definert depot som ligger rundt låret. Dette depotet er beriket i svært proliferative preadipocytter som aktivt gjennomgår differensiering under utviklingssignaler for å danne modne adipocytter 6,7. Prosessen med adipogene differensiering er sammenlignbar mellom kyllinger og mennesker. Derfor kan preadipocytter isolert fra kyllingembryoer brukes som en dual-purpose modell for studier som er relevante for mennesker og fjærfe. Imidlertid avtar utbyttet av preadipocytter med aldring etter hvert som cellene vokser til modne adipocytter5.
Den nåværende protokollen optimaliserer isolasjonen av preadipocytter fra fettvev i løpet av scenen (E16-E18) der adipogene differensiering og adipocytthypertrofi er på topp i broiler chick embryoer8. Denne prosedyren kan vurdere effekten av faktorer som det utviklende embryoet er utsatt for i ovo, for eksempel hønediett, på adipocyttutvikling og adipogene potensielle ex vivo. Det kan også teste virkningen av ulike manipulasjoner (f.eks. hypoksi, næringstilsetninger, farmakologiske agonister og antagonister) på adipogenese eller de forskjellige 'omes (f.eks. transkripsjonom, metabolom, metylom) av adipocyttgenitorer. Som en representasjon av det tidligste stadiet av fettdannelse, er celler oppnådd ved hjelp av denne protokollen verdifulle modeller for studier som er relevante for fjærfe og mennesker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683825</td>
			<td>Single Channel Pipette, 100 - 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette Tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A426P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Flask</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4980-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F75P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>Tissue Culture-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Assay Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Plate, Black Bottom</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue Culture-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Wiper (Kimtechwiper)</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Up &#38; Up</td>
			<td>NDC 1167300334</td>
			<td>20% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 40 &#181;m</td>
			<td>SPL</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugaton</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes, 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>343958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps, 100 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Surgical Scissors, 115 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SYNSV0000</td>
			<td>Despensed as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30023.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td>70% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Evos</td>
			<td>M7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td></td>
			<td>Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Container</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>4055</td>
			<td>2% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocytometer (Counting Chamber)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>480200</td>
			<td>0.1 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Sterilizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>B1205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9655</td>
			<td>1x Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Evos</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Channel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661070</td>
			<td>12-Channel Pipetters, 30 - 300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>KS130BS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towel</td>
			<td>Tork</td>
			<td>RK8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Steptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>1x Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 100 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 60 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservior</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Beaker, 100 mL</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>762703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps, 120 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-4960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Scissors, 140 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>Tissue Culture-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Strainer, 250 &#181;m</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>87791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>0.1% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, 110 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of preadipocytes from broiler chick embryos

Primære preadipocytter er et verdifullt eksperimentelt system for å forstå de molekylære veiene som styrer adipocytdifferensiering og metabolisme. Kyllingembryoer gir muligheten til å isolere preadipocytter fra det tidligste stadiet av fettutvikling. Denne primære cellen kan brukes til å identifisere faktorer som påvirker preadipocyttproliferasjon og adipogene differensiering, noe som gjør dem til en verdifull modell for studier relatert til barndommen fedme og kontroll av overflødig fettavsetning i fjærfe. Den raske veksten av postnatal fettvev kaster effektivt bort fôr ved å tildele det bort fra muskelvekst hos kyllingekyllinger. Derfor kan metoder for å forstå de tidligste stadiene av fettvevsutvikling gi ledetråder for å regulere denne tendensen og identifisere måter å begrense fettutvidelse tidlig i livet. Den nåværende studien ble designet for å utvikle en effektiv metode for isolasjon, primærkultur og adipogene differensiering av preadipocytter isolert fra å utvikle fettvev av kommersielle broilere (kjøtttype) kyllingembryoer. Prosedyren er optimalisert for å gi celler med høy levedyktighet (~ 98%) og økt kapasitet til å skille seg ut i modne adipocytter. Denne enkle metoden for embryonal preadipocyttisolasjon, kultur og differensiering støtter funksjonelle analyser av fettvekst og utvikling tidlig i livet.

Primære preadipocytter er morfologiske lik fibroblaster, med uregelmessige, stjernelignende former og en sentral kjerne (figur 2A-C). Cellene holder seg lett til vevskulturplast og begynner å spre seg kort tid etter vedlegg. De skiller raskt og akkumulerer lipiddråper (figur 3D) når de leveres med fettsyrer i media. Levedyktigheten (98%, basert på fargestoffekskludering) rapportert i isolasjonene som er representert her, er...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos at JoVE.com

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

Den nåværende protokollen beskriver en enkel metode for å isolere preadipocytter fra fettvev i broiler embryoer. Denne metoden muliggjør isolasjon med høyt utbytte, primærkultur og adipogene differensiering av preadipocytter. Oljerød O-farging og lipid/DNA-flekk målte den adipogene evnen til isolerte celler indusert med differensieringsmedier.

Isolering av Preadipocytes fra Broiler Chick Embryos

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

Primære preadipocytter er et verdifullt eksperimentelt system for å forstå de molekylære veiene som styrer adipocyttmetabolismen. Kyllingembryoer gir muligheten til å isolere preadipocytter fra det tidligste stadiet av adipocyttutvikling. Denne metoden er optimalisert for å gi celler med høy levedyktighet og økt kapasitet til å skille seg ut i moden adipocytt, som kan brukes til funksjonell analyse av tidlig livsfettvekst og utviklingsembryo hos kyllinger.Prosessen med adipogene differensiering er svært sammenlignbar mellom kyllinger og mennesker. Derfor kan isolerte preadipocytter brukes som en dobbelt foreslått modell for studier som er relevante for mennesker og fjærfe. For å begynne å vattpinne embryokroppen med 70% etanol.Deretter for å forhindre forstyrrelser under filtrering ved senere trinn etter fordøyelsen, skrubbet hudoverflaten forsiktig med steril gasbind for å fjerne fjær. Klipp deretter av huden mellom bena og bukområdet for å avsløre paret femorale fettdepoter. Bruk buede tang med en hånd for å holde huden rundt benet og forsiktig fjerne lårbenet subkutant fett.med den andre hånden. Senere bruker du buede tang for å forsiktig trekke depotet bort fra benet. Overfør vevet til et 15 milliliterrør som inneholder fem milliliter oppsamlingsmedier og gjenta disseksjonen for den andre siden av fettputen.Overfør nå de oppsamlede fettputene til en 60 millimeter Petri-tallerken som inneholder steriliseringsløsning og skyll kort ved å virvle parabolen et par ganger. Skyll deretter steriliseringsløsningen ved å overføre fettputene til en 60 millimeter Petri-tallerken som inneholder PBS. Virvle platen forsiktig og igjen, vask med PBS.For fordøyelsen av fettvevet, overfør dem til et 15 millimeter rør som inneholder forvarm enzymatisk løsning. Senk deretter et par lange rette saks i røret og til slutt hakk fettvevet i løsningen i stykker så små som mulig. Overfør hakket vev og enzymatisk løsning til en 25 milliliter autoklavert kolbe.Pakk kolben med parafinfilm og legg kolben i en orbital shaker inkubator ved 37 grader Celsius for fordøyelsen. Etter fordøyelsen pipettes forsiktig opp og ned for å blande godt. Fjern deretter eventuelle biter av ufordøyd vev og rusk ved å filtrere gjennom en 250 mikrometer vevsil i et 15 milliliterrør ved pipettering.Fjern nå cellene som er festet til kolben ved å skylle kolben med fire milliliter vekstmedier og filtrere cellefjæringen i samme 15 milliliterrør. Skyll deretter silen ved å pipettere vekstmediet igjen for å fjerne eventuelle celler som er fanget i filteret. Sentrifuge ved 300 ganger G i fem minutter ved romtemperatur for å pellet cellefraksjonen og aspirere supernatanten uten å forstyrre cellepellet.Resuspend pellet forsiktig i en milliliter rød blodcelle lysis buffer, bland godt ved pipettering og inkuber i fem minutter ved romtemperatur. Fortynn deretter cellene ved å legge til fem milliliter vekstmedier til røret som inneholder cellene og bland dem forsiktig ved pipettering. Nå, pipette cellene på en 40 mikrometer celle sil og filtrere dem inn i en ny 50 milliliter rør.Skyll deretter silen med ytterligere fem milliliter vekstmedier og pellet cellene ved sentrifugering ved 300 ganger G i syv minutter ved romtemperatur. Aspirer forsiktig supernatanten. Resuspender den gjenværende cellepelleten i en milliliter vekstmedier ved pipettering For å bestemme celletettheten og levedyktigheten, bland 10 mikroliter av hver prøve i trypanblå ved pipettering.Last 10 mikroliter av blandingen på hemocytometeret og tell cellene. Analyse av preadipocytter etter 24, 48 og 72 timer viste normal cellemorfologi og tall. Adipogene induksjon av preadipocytter viste rask differensiering og akkumulering av lipiddråper.Aggressiv håndtering av preadipocytter under isolasjon resulterte i celleskade og lavt cellenummer. Mikrobiell forurensning kan observeres til tross for at du tar forebyggende tiltak. Lipidfarging med oljerød O indikerte at preadipocyttene raskt begynner å utvikle lipiddråper under fettfremkallende induksjon og akkumulering utvikler seg over tid som observert i 24, 48 og 72 timer.Lipidakkumuleringen i forhold til cellenummer ble kvantifisert ved hjelp av lipid- og DNA-flekker. Både lipidakkumulering og celleproliferasjon økte over tid. Lavt cellenummer eller skadede celler kan observeres når vevsfraksjonene fordøyes for lenge.Derfor anbefales det at en og en halv time fordøyelse ikke overskrides. Isolerte preadipocytter kan brukes til genuttrykksstudier. Tilstrekkelig RNA kan oppnås for bruk i cDNA-syntese og oppfølging qPCR eller RNAseq.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimalisert<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Dyrking av Chick embryoer til avanserte stadier av utvikling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Forward Genetisk tilnærming til Avdekke Stress resistensgener i Mus - En High-throughput Screen i ES-celler

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Primær endodermal epithelial Cell Culture fra plommesekken membran av japanske Quail embryoer

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering av enkeltceller fra sebrafisk embryo

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affinity Merking Påvisning av endogene reseptorer fra Sebrafisk embryo

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

En Submerged filterpapir Sandwich for Long-term<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse Imaging of Early kyllingfoster

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Avledning av stamcelleforskningen linjer fra mus Preimplantation embryo

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Utarbeidelse av små RNA biblioteker for sekvensering fra tidlig mus embryoer

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Generasjon naiv Blastoderm Explants fra Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...