Name: isolation of preadipocytes from broiler chick embryos
Uploaded: 2022-08-04T13:00:00
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Los autores agradecen a UT AgResearch y al Departamento de Ciencia Animal por apoyar y optimizar este protocolo. Este trabajo fue financiado por una subvención del USDA.

Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Tennessee. Los huevos de pollo de engorde comerciales recién fertilizados (Cobb 500) se obtuvieron de un criadero local. Los huevos se incubaron a 38 °C con un 60% de humedad relativa hasta las disecciones en los días embrionarios 16-18 (E16-E18). El tejido adiposo se recogió del depósito subcutáneo (femoral).
1. Preparación para el aislamiento y la ...

<ol>
	<li>Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016. , (2018).</li><li>Siegel, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+modern+broiler+and+feed+efficiency.">Evolution of the modern broiler and feed efficiency.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).</li><li>Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth,+efficiency,+and+yield+of+commercial+broilers+from+1957,+1978,+and+2005.">Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005.</a> Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).</li><li>Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+models+for+differentiation:+preadipocytes+and+adipocytes.">Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes.</a> Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).</li><li>Vilaboa, S. D. -. A., Navarro-Palou, M., Llull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+influence+on+stromal+vascular+fraction+cell+yield+obtained+from+human+lipoaspirates.">Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).</li><li>Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+changes+in+lipid+composition+and+lipoprotein+lipase+activity+during+the+development+of+the+chick+embryo.">Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).</li><li>Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+adipose+tissue+growth+through+hyperplasia+and+hypertrophy+in+the+embryonic+Leghorn+and+broiler.">Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler.</a> Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).</li><li>Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+size+and+docosahexaenoic+acid+content+of+adipocytes+during+chick+embryo+development.">Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development.</a> Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).</li><li>Claver, J. A., Quaglia, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphology,+development,+and+function+of+blood+cells+in+nonmammalian+vertebrates.">Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates.</a> Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).</li><li>. Corning Cell Counter Demo Video Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg">https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg</a> (2022)</li><li>Nema, R., Khare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+cell+culture:+Advance+technology+for+modern+research.">An animal cell culture: Advance technology for modern research.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).</li><li>Regassa, A., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oleic+acid+and+chicken+serum+on+the+expression+of+adipogenic+transcription+factors+and+adipogenic+differentiation+in+hen+preadipocytes.">Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes.</a> Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).</li><li>Temkin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crude+oil/dispersant+mixture+and+dispersant+components+on+PPAR+&#947;+activity+in+vitro+and+in+vivo:+identification+of+dioctyl+sodium+sulfosuccinate+(DOSS;+CAS#+577-11-7)+as+a+probable+obesogen.">Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR &#947; activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen.</a> Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Adipose Tissue Protocols. , 201-219 (2008).</li><li>Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+protocol+to+maximize+differentiation+of+human+preadipocytes+and+improve+metabolic+phenotypes.">A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes.</a> Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li><li>Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+adipocyte-derived+extracellular+vesicles+using+filtration+and+ultracentrifugation.">Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (170), e61979 (2021).</li><li>Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fungizone+in+control+of+fungi+and+yeasts+in+tissue+culture.">Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).</li><li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture.">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+swimming+dots+in+cell+culture:+the+identity,+detection+method+and+judging+criteria.">Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria.</a> bioRxiv. , 366906 (2018).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , 163-186 (2015).</li></ol>

Aunque varios protocolos bien descritos han reportado el aislamiento de preadipocitos 14,15,16,17, se ha optimizado el aislamiento para preadipocitos embrionarios, que pueden usarse para análisis funcionales del crecimiento y desarrollo de grasa en la vida temprana en pollitos de engorde. Este protocolo produce progenitores de adipocitos embrionarios de alta viabilidad con alto potencial de di...

La obesidad es una amenaza para la salud mundial tanto para adultos como para niños. Los niños con sobrepeso u obesidad tienen aproximadamente cinco veces más probabilidades de ser obesos como adultos, lo que los coloca en un riesgo significativamente mayor de enfermedad cardiovascular, diabetes y muchas otras comorbilidades. Alrededor del 13.4% de los niños estadounidenses de 2 a 5 años de edad tienen obesidad1, lo que ilustra que la tendencia a acumular exceso de grasa corporal puede ponerse en marcha muy temprano en la vida. Por razones muy diferentes, la acumulación de exceso de tejido adiposo es una preocupación para los pollos de engorde (tipo carne). Los pollos de engorde modernos son increíblemente eficientes, pero aún acumulan más lípidos de lo fisiológicamente necesario 2,3. Esta tendencia comienza poco después de la eclosión y efectivamente desperdicia el alimento, el componente de producción más caro, al asignarlo lejos del crecimiento muscular. Por lo tanto, tanto para los niños como para los pollos de engorde, aunque por razones muy diferentes, existe la necesidad de comprender los factores que influyen en el desarrollo del tejido adiposo e identificar formas de limitar la expansión adiposa temprano en la vida.
Los adipocitos se forman a partir de preadipocitos, células madre derivadas del tejido adiposo que se someten a diferenciación para desarrollar células grasas maduras que almacenan lípidos. En consecuencia, los preadipocitos in vitro son un modelo experimental valioso para los estudios de obesidad. Estas células, aisladas de la fracción vascular estromal de los depósitos adiposos, pueden proporcionar una comprensión fundamental de las vías moleculares que controlan la diferenciación y el metabolismo de los adipocitos 4,5. Los embriones de pollitos son un modelo experimental favorable en los estudios de desarrollo porque cultivar óvulos en el horario deseado facilita la manipulación experimental, ya que permite obtener embriones sin el sacrificio de la madre para observar una serie de etapas de desarrollo de los embriones. Además, no se requieren procedimientos quirúrgicos complicados y largos períodos de tiempo para obtener embriones en relación con modelos animales más grandes. Por lo tanto, el embrión de pollito presenta una oportunidad para obtener preadipocitos desde las primeras etapas del desarrollo del tejido adiposo. El tejido adiposo subcutáneo se hace visible en el pollito alrededor del día embrionario 12 (E12) como un depósito claramente definido ubicado alrededor del muslo. Este depósito está enriquecido en preadipocitos altamente proliferativos que se diferencian activamente bajo señales de desarrollo para formar adipocitos maduros 6,7. El proceso de diferenciación adipogénica es comparable entre pollos y humanos. Por lo tanto, los preadipocitos aislados de embriones de pollo se pueden utilizar como un modelo de doble propósito para estudios relevantes para humanos y aves de corral. Sin embargo, el rendimiento de los preadipocitos disminuye con el envejecimiento a medida que las células crecen en adipocitos maduros5.
El presente protocolo optimiza el aislamiento de los preadipocitos del tejido adiposo durante la etapa (E16-E18) en la que la diferenciación adipogénica y la hipertrofia de los adipocitos están en su punto máximo en embriones de pollos de engorde8. Este procedimiento puede evaluar los efectos de los factores a los que el embrión en desarrollo está expuesto in ovo, como la dieta de la gallina, sobre el desarrollo de los adipocitos y el potencial adipogénico ex vivo. También puede probar el impacto de varias manipulaciones (por ejemplo, hipoxia, adiciones de nutrientes, agonistas farmacológicos y antagonistas) en la adipogénesis o en los diversos 'omes( por ejemplo, transcriptoma, metaboloma, metiloma) de los progenitores de adipocitos. Como representación de la etapa más temprana de la formación adiposa, las células obtenidas utilizando este protocolo son modelos valiosos para estudios relevantes para aves de corral y humanos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683825</td>
			<td>Single Channel Pipette, 100 - 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette Tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A426P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Flask</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>4980-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F75P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td>Tissue Culture-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Assay Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Plate, Black Bottom</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3603</td>
			<td>Tissue Culture-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AdipoRed</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench Top Wiper (Kimtechwiper)</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Up &#38; Up</td>
			<td>NDC 1167300334</td>
			<td>20% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 40 &#181;m</td>
			<td>SPL</td>
			<td>93040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugaton</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes, 15 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes, 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>343958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps, 100 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Surgical Scissors, 115 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SYNSV0000</td>
			<td>Despensed as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30023.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td>70% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Evos</td>
			<td>M7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil</td>
			<td>Reynolds</td>
			<td></td>
			<td>Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Container</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>4055</td>
			<td>2% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocytometer (Counting Chamber)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>480200</td>
			<td>0.1 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument Sterilizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>B1205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9655</td>
			<td>1x Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Evos</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Channel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4661070</td>
			<td>12-Channel Pipetters, 30 - 300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>KS130BS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towel</td>
			<td>Tork</td>
			<td>RK8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Steptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>1x Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 100 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 60 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservior</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Beaker, 100 mL</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>762703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps, 120 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-4960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Scissors, 140 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>Tissue Culture-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Strainer, 250 &#181;m</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>87791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td>0.1% Working Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, 110 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of preadipocytes from broiler chick embryos

Los preadipocitos primarios son un valioso sistema experimental para comprender las vías moleculares que controlan la diferenciación y el metabolismo de los adipocitos. Los embriones de pollo brindan la oportunidad de aislar los preadipocitos desde la etapa más temprana del desarrollo adiposo. Esta célula primaria se puede utilizar para identificar factores que influyen en la proliferación de preadipocitos y la diferenciación adipogénica, lo que los convierte en un modelo valioso para estudios relacionados con la obesidad infantil y el control del exceso de deposición de grasa en aves de corral. El rápido crecimiento del tejido adiposo postnatal desperdicia efectivamente el alimento al asignarlo lejos del crecimiento muscular en pollos de engorde. Por lo tanto, los métodos para comprender las primeras etapas del desarrollo del tejido adiposo pueden proporcionar pistas para regular esta tendencia e identificar formas de limitar la expansión adiposa temprano en la vida. El presente estudio fue diseñado para desarrollar un método eficiente para el aislamiento, el cultivo primario y la diferenciación adipogénica de preadipocitos aislados del tejido adiposo en desarrollo de embriones comerciales de pollos de engorde (tipo carne). El procedimiento se ha optimizado para producir células con alta viabilidad (~ 98%) y una mayor capacidad para diferenciarse en adipocitos maduros. Este método simple de aislamiento, cultivo y diferenciación de preadipocitos embrionarios apoya los análisis funcionales del crecimiento y desarrollo de la grasa en los primeros años de vida.

Los preadipocitos primarios son morfológicamente similares a los fibroblastos, con formas irregulares en forma de estrella y un núcleo central (Figura 2A-C). Las células se adhieren fácilmente al plástico de cultivo de tejidos y comienzan a proliferar poco después de la unión. Se diferencian rápidamente y acumulan gotas lipídicas (Figura 3D) cuando se les proporcionan ácidos grasos en los medios. La viabilidad (98%, ba...

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Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

El presente protocolo describe un método simple para aislar preadipocitos del tejido adiposo en embriones de pollos de engorde. Este método permite el aislamiento con alto rendimiento, cultivo primario y diferenciación adipogénica de preadipocitos. La tinción de aceite Rojo O y la tinción de lípidos /ADN midieron la capacidad adipogénica de las células aisladas inducidas con medios de diferenciación.

Aislamiento de preadipocitos de embriones de pollos de engorde

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

Los preadipocitos primarios son un valioso sistema experimental para comprender las vías moleculares que controlan el metabolismo de los adipocitos. Los embriones de pollo brindan la oportunidad de aislar los preadipocitos desde la etapa más temprana del desarrollo de los adipocitos. Este método se ha optimizado para producir células con alta viabilidad y mayor capacidad de diferenciación en adipocitos maduros, que se pueden utilizar para el análisis funcional del crecimiento y desarrollo de grasa en embriones de crecimiento y desarrollo de grasa en la vida temprana en pollitos.El proceso de diferenciación adipogénica es altamente comparable entre pollos y humanos. Por lo tanto, los preadipocitos aislados se pueden utilizar como un modelo de doble propuesta para estudios relevantes para humanos y aves de corral. Para comenzar, hisifique el cuerpo del embrión con 70% de etanol.Luego, para evitar interferencias durante la filtración en pasos posteriores después de la digestión, frote suavemente la superficie de la piel con una gasa estéril para eliminar las plumas. Luego corte la piel entre las piernas y la región abdominal para revelar el par de depósitos adiposos femorales. Use fórceps curvos con una mano para sostener la piel alrededor de la pierna y retire suavemente la grasa subcutánea femoral.con la otra mano. Más tarde, use pinzas curvas para alejar suavemente el depósito de la pierna. Transfiera los tejidos a un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de medios de recolección y repita la disección para el otro lado de la almohadilla de grasa.Ahora, transfiera las almohadillas de grasa recolectadas a una placa de Petri de 60 milímetros que contenga solución de esterilización y enjuague brevemente girando la placa varias veces. Luego enjuague la solución de esterilización transfiriendo las almohadillas de grasa a una placa de Petri de 60 milímetros que contenga PBS. Revuelva suavemente el plato y una vez más, lávese con PBS.Para la digestión de los tejidos adiposos, transfiéralos a un tubo de 15 milímetros que contenga una solución enzimática precaliente. Luego sumerja un par de tijeras largas y rectas en el tubo y finalmente pica los tejidos adiposos en la solución en pedazos lo más pequeños posible. Transfiera el tejido picado y la solución enzimática a un matraz en autoclave de 25 mililitros.Envuelva el matraz con una película de parafina y colóquelo en una incubadora de agitadores orbitales a 37 grados centígrados para la digestión. Después de la digestión, pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Luego, elimine cualquier trozo de tejido no digerido y escombros filtrando a través de un colador de tejido de 250 micrómetros en un tubo de 15 mililitros mediante pipeteo.Ahora, retire las células adheridas al matraz enjuagando el matraz con cuatro mililitros de medios de crecimiento y filtre la suspensión celular en el mismo tubo de 15 mililitros. A continuación, enjuague el colador pipeteando los medios de crecimiento nuevamente para eliminar las células atrapadas en el filtro. Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente para granular la fracción celular y aspirar el sobrenadante sin perturbar el gránulo celular.Resuspeda suavemente el pellet en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos, mezcle bien mediante pipeteo e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego diluya las células agregando cinco mililitros de medios de crecimiento al tubo que contiene las células y mézclelas suavemente mediante pipeteo. Ahora, pipetee las células en un colador de células de 40 micrómetros y filtre en un nuevo tubo de 50 mililitros.Luego enjuague el colador con cinco mililitros adicionales de medios de crecimiento y gule las células centrifugando a 300 veces G durante siete minutos a temperatura ambiente. Aspirar con cuidado el sobrenadante. Resuspend el pellet celular restante en un mililitro de medios de crecimiento mediante pipeteo Para determinar la densidad celular y la viabilidad, mezcle 10 microlitros de cada muestra en azul tripano mediante pipeteo.Cargue 10 microlitros de la mezcla en el hemocitómetro y cuente las células. El análisis de los preadipocitos después de 24, 48 y 72 horas mostró una morfología y un número celular normales. La inducción adipogénica de preadipocitos mostró una rápida diferenciación y acumulación de gotas lipídicas.El manejo agresivo de los preadipocitos durante el aislamiento resultó en daño celular y bajo número de células. La contaminación microbiana se puede observar a pesar de tomar medidas preventivas. La tinción lipídica con aceite rojo O indicó que los preadipocitos comienzan a desarrollar rápidamente gotas lipídicas bajo inducción adipogénica y la acumulación progresa con el tiempo como se observa en 24, 48 y 72 horas.La acumulación de lípidos en relación con el número de células se cuantificó utilizando tinciones de lípidos y ADN. Tanto la acumulación de lípidos como la proliferación celular aumentaron con el tiempo. Se puede observar un bajo número de células o células dañadas cuando las fracciones de tejido se digieren demasiado tiempo.Por ello, se recomienda que no se supere una hora y media de digestión. Los preadipocitos aislados se pueden utilizar para estudios de expresión génica. Se puede obtener suficiente ARN para su uso en la síntesis de ADNc y la qPCR o RNAseq de seguimiento.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimizado<em&gt; Ex-ovo</em&gt; El cultivo de embriones del polluelo a etapas avanzadas de desarrollo

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Enfoque genético adelante para descubrir Estrés Los genes de resistencia en ratones - Una pantalla de alto rendimiento en células madre embrionarias

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Endodérmico primario de células epiteliales Cultura de la membrana del saco vitelino de embriones de codorniz japonesa

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Detección de afinidad etiquetado Endógeno receptores de embriones de pez cebra

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

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Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse de pollo temprano embriones

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

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Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

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MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Generación de explantes de Blastoderm naïve a partir de embriones de pez cebra

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...