Name: reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) إلى جامعة الأمم المتحدة (19K23758 ، 21K06295) و K.W. (19H03242 ، 20K21420 ، 21H00420) ، من مؤسسة Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) إلى K.W. ، ومن التحالف الديناميكي للابتكار المفتوح الذي يربط بين الإنسان والبيئة والمواد (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) إلى N.U. و K.W. ونشكر السيدة ميوكي شينوهارا (جامعة هوسي) على مساعدتها في إعداد الأرقام.

تم استخدام سلالة من النوع البري من Chlamydomonas reinhardtii ، CC-125 ، لهذه الدراسة. تم الحصول على CC-125 من مركز موارد الكلاميدوموناس (انظر جدول المواد) واحتفظ به على ترايس أسيتات فوسفات (TAP) 16 ، 1.5٪ من وسط الأغاروز عند 20-25 درجة مئوية.
1. زراعة الخلايا
<ol><li>ث?...

<ol>
	<li>Szent-Gyorgyi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-energy+relations+and+contraction+of+actomyosin.">Free-energy relations and contraction of actomyosin.</a> Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).</li><li>Hoffman-Berling, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosintriphosphat+als+betriebsstoff+von+zellbewegungen.">Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).</li><li>Naitoh, Y., Kaneko, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivated+Triton-extracted+models+of+Paramecium:+modification+of+ciliary+movement+by+calcium+ions.">Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions.</a> Science. 176 (4034), 523-524 (1972).</li><li>Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+flagellar+mutants+lacking+radial+spokes+and+central+tubules.+Structure,+composition,+and+function+of+specific+axonemal+components.">Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components.</a> Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).</li><li>R&#252;ffer, U., Nultsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+coordination+in+Chlamydomonas+cells+held+on+micropipettes.">Flagellar coordination in Chlamydomonas cells held on micropipettes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 41 (4), 297-307 (1998).</li><li>Sale, W. S., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+active+sliding+of+microtubules+in+Tetrahymena+cilia.">Direction of active sliding of microtubules in Tetrahymena cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (5), 2045-2049 (1977).</li><li>Fox, L. A., Sale, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+force+generated+by+the+inner+row+of+dynein+arms+on+flagellar+microtubules.">Direction of force generated by the inner row of dynein arms on flagellar microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 105 (4), 1781-1787 (1987).</li><li>Kamiya, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+assessed+by+in+vitro+and+in+vivo+motility+assays+of+Chlamydomonas+mutants.">Functional diversity of axonemal dyneins as assessed by in vitro and in vivo motility assays of Chlamydomonas mutants.</a> Zoolog Science. 31 (10), 633-644 (2014).</li><li>Kamiya, R., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicromolar+levels+of+calcium+control+the+balance+of+beating+between+the+two+flagella+in+demembranated+models+of+Chlamydomonas.">Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).</li><li>Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototactic+activity+in+Chlamydomonas+'non-phototactic'+mutants+deficient+in+Ca2+-dependent+control+of+flagellar+dominance+or+in+inner-arm+dynein.">Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein.</a> Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).</li><li>Hyams, J. S., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+flagellar+apparatus+of+Chlamydomonas:+characterization+of+forward+swimming+and+alteration+of+waveform+and+reversal+of+motion+by+calcium+ions+in+vitro.">Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro.</a> Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).</li><li>Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+CAV2+encodes+a+voltage-+dependent+calcium+channel+required+for+the+flagellar+waveform+conversion.">Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion.</a> Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).</li><li>Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+control+of+waveform+in+isolated+flagellar+axonemes+of+Chlamydomonas.">Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).</li><li>Wakabayashi, K., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+flagellar+motility+by+redox+poise.">Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise.</a> Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).</li><li>Saegusa, Y., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+controls+the+balance+of+the+propulsive+forces+generated+by+the+two+flagella+of+Chlamydomonas.">cAMP controls the balance of the propulsive forces generated by the two flagella of Chlamydomonas.</a> Cytoskeleton. 72 (8), 412-421 (2015).</li><li>Gorman, D. S., Levine, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+f+and+plastocyanin:+their+sequence+in+the+photosynthetic+electron+transport+chain+of+Chlamydomonas+reinhardi.">Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).</li><li>Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+estimation+of+cytosolic+ATP+concentration+from+the+ciliary+beating+frequency+in+the+green+alga+Chlamydomonas+reinhardtii.">Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).</li><li>Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+waveform+conversion+in+the+flagellar+axoneme+of+Chlamydomonas+mutants+lacking+the+central-pair/radial+spoke+system.">Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).</li><li>Yueh, Y. G., Crain, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deflagellation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+follows+a+rapid+transitory+accumulation+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+requires+Ca2++entry.">Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry.</a> Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).</li><li>Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+flagellar+motility+activation+in+Chlamydomonas+reinhardtii+in+response+to+mechanical+agitation.">Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).</li><li>Ueki, N., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-extracted+Volvox+model+exhibits+an+anterior-posterior+gradient+in+flagellar+Ca2.">Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1061-1068 (2018).</li><li>Tanno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four-celled+Volvocales+green+alga+Tetrabaena+socialis+exhibits+weak+photobehavior+and+high-photoprotection+ability.">The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability.</a> PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).</li></ol>

هناك خطوتان حاسمتان في هذا البروتوكول. الأول هو عملية تعرف باسم إزالة النخاع ، والتي يجب تنفيذها بلطف ولكن بدقة. يحدث التفكيك (أي فصل الأهداب عن جسم الخلية) عن طريق السحب القوي أو الدوامة ، مما يجعل نماذج الخلايا غير متحركة حتى بعد إضافة ATP. عادة ، يتم تعليق 5 × 107 خلايا في ~ 0.5 مل من المخز?...

تعد إعادة تنشيط الخلايا المتحركة المزخرفة في المختبر أداة قيمة لدراسة الأساس الجزيئي للآلية التنظيمية لحركية الخلية. أظهر Szent-Györgyi لأول مرة في المختبر تقلص ألياف العضلات الهيكلية للأرانب المستخرجة من الجلسرين بنسبة 50٪ عن طريق إضافة الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)1. كانت هذه التجربة هي الأولى التي تثبت أن ATP ينشط تقلص العضلات. وسرعان ما طبقت المنهجية على دراسة الحركة الهدبية/السوطية المنشطة من قبل ATP، مثل سوط الحيوانات المنوية2، وأهداب باراميسيوم 3، وأهداب الكلاميدوموناس رينهاردتي (وتسمى أيضا السوط)4 باستخدام منظفات غير أيونية لإزالة الثقب.
الطحالب الخضراء أحادية الخلية C. reinhardtii هي كائن حي نموذجي لدراسة الأهداب: فهي تسبح مع اثنين من الأهداب عن طريق ضربها مثل ضربة صدر الإنسان5. يتم تشغيل الحركة الهودية بواسطة الداينين ، وهو بروتين حركي قائم على الأنابيب الدقيقة موجه في النهاية 6,7. يمكن تصنيف الداينات الهدبية إلى داينيات خارجية الذراع وداينات داخل الذراع. تم عزل المتحورات التي تفتقر إلى كل نوع من أنواع الداينين كمتحولات بطيئة السباحة مع تشوهات حركية مختلفة. وقد أدى التحليل الحركي المفصل في المختبر لهذه الطفرات إلى تقدم كبير في أبحاث الداينين8.
تم التوصل إلى العديد من النتائج الهامة باستخدام هذه الطريقة ومشتقاتها منذ إنشاء تجربة إعادة التنشيط في المختبر لخلايا C. reinhardtii (نماذج الخلايا). على سبيل المثال ، أظهرت إعادة تنشيط نماذج الخلايا في سلسلة من المخازن المؤقتة Ca 2 +9 أن اثنين من الأهداب يتم تنظيمهما بشكل مختلف بواسطة ca2 + تحت micromolar ، وهذا التحكم غير المتماثل في الأهداب يمكن من التوجيه الضوئي ل C. reinhardtii10. علاوة على ذلك، تظهر كل من الأهداب تحويل الشكل الموجي من وضع السباحة الأمامي (يسمى الشكل الموجي غير المتماثل) إلى وضع السباحة الخلفي (يسمى الشكل الموجي المتماثل الذي يظهر لفترة قصيرة عندما تكون الخلايا مصدومة) 11،12. يتم تنظيم هذا التحويل الموجي بواسطة Ca2+ تحت الملليمولي ، والذي ظهر من خلال إعادة تنشيط ما يسمى بجهاز السوط النووي (وهو مجمع يحتوي على أهداب ، والأجسام القاعدية ، والهياكل التي تربط الأجسام القاعدية بالنواة ، وبقايا النواة)11 أو المحاور غير المخروطنة للأهداب المعزولة13. بخلاف Ca2+ ، فإن اتزان الأكسدة والاختزال (الحد من الأكسدة) هو إشارة تنظم تردد الضرب الهدبي ، والذي تم إظهاره من خلال إعادة تنشيط نماذج الخلايا في مخازن الأكسدة والاختزال التي تحتوي على نسب مختلفة من الجلوتاثيون المنخفض مقابل الجلوتاثيون المؤكسد14. بالإضافة إلى ذلك ، ينظم أحادي فوسفات الأدينوسين الدوري (cAMP) بشكل غير متماثل اثنين من الأهداب ، والتي ظهرت من خلال إعادة تنشيط axonemes مع cAMP15 المحبوس القابل للانقسام الضوئي. وقد أدت هذه النتائج في المختبر ، جنبا إلى جنب مع النتائج الجينية ، إلى فهم أعمق للآليات الجزيئية لتنظيم الأهداب في C. reinhardtii.
يتم وصف بروتوكول لإعادة تنشيط نماذج الخلايا هنا. هذه الطريقة بسيطة ، وتسمح بإجراء تعديلات مختلفة ، ويمكن تطبيقها على كائنات حية متعددة تتحرك مع الأهداب. ومع ذلك ، نظرا لأن الخلايا المزروعة هشة ، فإنها تتطلب بعض النصائح لإعادة تنشيط حركة نماذج الخلايا بكفاءة جيدة مع منع الإهلاك.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL plastic tube</td>
			<td>QSP</td>
			<td>502-PLN-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sima-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>KUBOTA</td>
			<td>2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas strain CC-125</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td></td>
			<td>https://www.chlamycollection.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CK-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CRPHO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEDTA(EGTA)</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>G002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>GB70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>21002-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, Mr 20,000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18897.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>28434-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii

منذ التجربة التاريخية على تقلص العضلات المغلورة عن طريق إضافة ATP ، والتي أظهرها Szent-Györgyi في منتصف القرن 20th ، في المختبر إعادة تنشيط الخلايا المخربة كانت طريقة تقليدية وقوية لفحص حركة الخلية. الميزة الأساسية لهذه الطريقة التجريبية هي أن تكوين حل إعادة التنشيط يمكن تغييره بسهولة. على سبيل المثال ، يمكن تكرار بيئة تركيز Ca2+ عالية المستوى تحدث مؤقتا فقط بسبب إثارة الغشاء في الجسم الحي في المختبر. الأهداب حقيقية النواة (المعروفة أيضا باسم السوط) هي آلية حركية معقدة لا يزال يتعين توضيح آلياتها التنظيمية. الطحالب الخضراء أحادية الخلية Chlamydomonas reinhardtii هي كائن حي نموذجي ممتاز في مجال أبحاث الأهداب. وقد ساهمت تجارب إعادة التنشيط باستخدام نماذج الخلايا غير المخربة من C. reinhardtii ومشتقاتها ، مثل axonemes deembranated من الأهداب المعزولة ، بشكل كبير في فهم الآليات الجزيئية للحركة الهدبية. أوضحت تلك التجارب أن ATP ينشط الحركة الهدبية وأن الإشارات الخلوية المختلفة ، بما في ذلك Ca2 + و cAMP وأنواع الأكسجين التفاعلية ، تعدل الحركات الهدبية. يتم وصف الطريقة الدقيقة لإزالة الترشيح لخلايا C. reinhardtii وإعادة تنشيط نماذج الخلايا هنا.

تظهر هنا عملية إزالة الترشيح وإعادة التنشيط في سلالة C. reinhardtii البرية (CC-125). أصبحت الثقافة بعد يومين من التلقيح لونا أخضر فاتحا (الخطوة 1.1) (الشكل 1). تم جمع الخلايا (الخطوة 2.1) ، وغسلها (الخطوة 2.2) ، وإزالة الترسبات (الخطوة 2.5). بعد إزالة الترسبات ، أصبحت جميع نماذج الخلايا غي?...

Watch this Scientific Journal Video about Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

إعادة تنشيط الخلايا المتحركة في المختبر هي تجربة حاسمة في فهم آليات حركة الخلايا. يصف البروتوكول إعادة تنشيط نماذج الخلايا المخروطنة من Chlamydomonas reinhardtii ، وهو كائن حي نموذجي لدراسة الأهداب / السوط.

إعادة تنشيط نماذج الخلايا المخروطنة في الكلاميدوموناس reinhardtii

Since the historical experiment on the contraction of glycerinated muscle by adding ATP, which Szent-Gy&#246;rgyi demonstrated in the mid-20th century, in ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فهم العوامل التي تؤثر على حركة الأهداب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الظواهر التي تحدث مؤقتا فقط في الجسم الحي ، مثل هذا الانعكاس لتركيزات أيون الكالسيوم في الأهداب يمكن ملاحظتها باستمرار في المختبر. تساهم هذه الطريقة على وجه التحديد في مجال البحث في الأهداب المتحركة.سيكون من الصعب على المبتدئين تنفيذ خطوة إزالة الترسبات. وبالتالي ، يوصى بشدة بتنفيذ الخطوات بلطف ولكن بدقة. ابدأ بالطرد المركزي لما يقرب من 10 ملليلتر من ثقافة الكلاميدوموناس رينهاردتي عند 1000 فرنك سويسري عند 20 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.قم بتزيين السوبرناتانت وشفط البقايا بواسطة ماصة باستور. أعد تعليق الرواسب في حوالي خمسة ملليلترات من المخزن المؤقت للغسيل. خلايا الطرد المركزي في مخزن الغسيل العازل عند 1000 RCF لمدة ثلاث دقائق عند 20 درجة مئوية.تخلص من السوبرناتانت بعناية باستخدام ماصة. أضف ما يقرب من 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للإزالة إلى حبيبات الخلية. هز الأنبوب بلطف لتعليق الخلايا في المخزن المؤقت تقريبا ، ثم ضع الأنبوب على الجليد.حبيبات الخلايا المتبقية بلطف باستخدام ماصة وضع الأنبوب على الجليد مرة أخرى. خذ 5 إلى 10 ميكرولترات من نموذج الخلية ، وقم بتخفيف عشرة أضعاف باستخدام المخزن المؤقت للتخفيف ، وراقب تحت المجهر للتأكد من أن جميع نماذج الخلايا غير متجذرة ولا تسبح. في أنبوب 0.5 ملليلتر ، امزج 80 ميكرولتر من محلول إعادة التنشيط ، و 10 ميكرولترات من محلول ATP ، و 10 ميكرولترات من نماذج الخلايا عن طريق النقر على الأنبوب.ضع ما يقرب من 30 ميكرولتر من المحلول المختلط على شريحة زجاجية وضع انزلاق غطاء عليه برفق مع الفواصل لتجنب حدوث صدمة ميكانيكية لنموذج الخلية. راقب نماذج الخلايا المعاد تنشيطها تحت المجهر. بعد إزالة ترسب ثقافة C.reinhardtii ، أصبحت جميع نماذج الخلايا غير متحركة وظلت الأهداب المخربة مرتبطة بجسم الخلية ، مما يؤكد أن جمود نماذج الخلايا لم يكن ناجما عن إزالة الهدبية.بعد خلط نماذج الخلايا مع المخزن المؤقت لإعادة التنشيط في ATP ، أصبح أكثر من 50٪ من نماذج الخلايا متحركة. حتى بدون نظام تجديد ATP ، استمرت الخلايا المعاد تنشيطها في التحرك لمدة 90 دقيقة تقريبا مع تركيز ATP نهائي يبلغ ملليمولير واحد قبل التوقف تدريجيا. خطوة إزالة الترسبات أمر بالغ الأهمية.يجب أن تتوقف جميع الخلايا عن السباحة ، ولكن لا ينبغي خلطها بقوة بحيث يحدث إزالة الأهداب الهدبية. يمكن للباحثين تعديل هذا البروتوكول ليشمل كواشف مثل أيونات الكالسيوم أو AMP الدوري ، أو إجراء تجارب مع متحور يفتقر إلى بروتين معين لتحديد دوره البيولوجي.

Research

JoVE Journal

Biology

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

وفصل التزاوج من الرباعيات المتلحفة reinhardtii عن التحليل الوراثي

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

زرع القصبة الهوائية ومنتبذ مثلي في الفئران المستخدمة كنماذج لدراسة الأمراض تنمية إيرواي مسد

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

الفيديو المعلوماتية الحيوية تحليل النمو البشري الخلية الجذعية الجنينية كولوني

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

مبادئ الجراحة القوارض لجراحة جديدة

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats

دليل ضبط النفس وطرق الإدارة المشتركة في مجمع الفئران والجرذان

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research.  Working confidently and humanely with mice and ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

تقييم التنمية وظيفة الغدة الثديية في نماذج الماوس

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

التشخيص والتشريح والأنسجة عينة مختارة كوكتيل في الجرذان والفئران

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

إعادة إعماره البيوكيميائية من مستقبلات البروتين الستيرويد • المجمعات Hsp90 وإعادة تنشيط يجند تجليد

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

الماوس حفظ بالبرودة والانتعاش الحيوانات المنوية باستخدام · لقد كرو كيت

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models

المستمدة زراعة والتطبيقات تناوب الحائط تفاعلات الاحيائية سفينة 3D نماذج الخلايا الظهارية

Cells and tissues in the body experience environmental conditions that influence their architecture, intercellular communications, and overall functions. ...