Réactivation de modèles cellulaires démonembranés chez Chlamydomonas reinhardtii

Cette méthode peut aider à comprendre quels facteurs affectent la motilité des cils. Le principal avantage de cette technique est que les phénomènes qui ne se produisent que temporairement in vivo, une telle inversion des concentrations d’ions calcium dans les cils peuvent être observés en continu in vitro. Cette méthode contribue spécifiquement au domaine de recherche des cils mobiles.

Il serait difficile pour les débutants d’effectuer l’étape de démembranation. Par conséquent, il est fortement recommandé d’effectuer les étapes doucement mais avec précision. Commencez par centrifuger environ 10 millilitres de culture de Chlamydomonas reinhardtii à 1 000 FCR à 20 degrés Celsius pendant trois minutes.

Décantez le surnageant et aspirez le reste par une pipette Pasteur. Remettre en suspension les précipités dans environ cinq millilitres de tampon de lavage. Centrifuger les cellules dans le tampon de lavage à 1 000 RCF pendant trois minutes à 20 degrés Celsius.

Jetez soigneusement le surnageant avec une pipette. Ajouter environ 0,5 millilitre de tampon de démembranation à la pastille cellulaire. Secouez doucement le tube pour suspendre grossièrement les cellules dans le tampon, puis mettez le tube sur de la glace.

Suspendez doucement la pastille de cellule restante avec une pipette et placez à nouveau le tube sur la glace. Prendre 5 à 10 microlitres du modèle cellulaire, diluer dix fois avec le tampon de dilution et observer au microscope pour confirmer que tous les modèles cellulaires sont démembranés et ne nagent pas. Dans un tube de 0,5 millilitre, mélanger 80 microlitres de solution de réactivation, 10 microlitres de solution d’ATP et 10 microlitres de modèles cellulaires en tapotant le tube.

Placez environ 30 microlitres de la solution mélangée sur une lame de verre et placez doucement un couvercle avec des entretoises pour éviter un choc mécanique sur le modèle de cellule. Observez les modèles de cellules réactivées au microscope. Après la démembranation de la culture de C. reinhardtii, tous les modèles cellulaires sont devenus immotiles et les cils démembranés sont restés attachés au corps cellulaire, confirmant que l’immotilité des modèles cellulaires n’était pas causée par la déciliation.

Après avoir mélangé les modèles cellulaires avec le tampon de réactivation dans l’ATP, plus de 50% des modèles cellulaires sont devenus mobiles. Même sans le système de régénération de l’ATP, les cellules réactivées ont continué à se déplacer pendant environ 90 minutes avec une concentration finale d’ATP d’un millimolaire avant de s’arrêter progressivement. L’étape de la démonembranation est critique.

Toutes les cellules doivent cesser de nager, mais elles ne doivent pas être mélangées si fortement que la déciliation se produit. Les chercheurs peuvent modifier ce protocole pour inclure des réactifs tels que les ions calcium ou l’AMP cyclique, ou effectuer des expériences avec un mutant dépourvu d’une protéine particulière pour identifier leur rôle biologique.