Name: reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) an N.U. (19K23758, 21K06295) und K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), von der Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) an K.W. und von der Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) an N.U. und K.W. unterstützt. Wir danken Frau Miyuki Shinohara (Hosei Univ.) für ihre Hilfe bei der Vorbereitung der Figuren.

Ein Wildtypstamm von Chlamydomonas reinhardtii, CC-125, wurde für die vorliegende Studie verwendet. CC-125 wurde vom Chlamydomonas Resource Center (siehe Tabelle der Materialien) gewonnen und auf einem Tris-Acetat-Phosphat (TAP)16, 1,5% Agarosemedium bei 20-25 °C gehalten.
1. Zellkultur
<ol><li>Kultur Chlamydomonas reinhardtii (CC-125) in TAP medium 16 in einer 12 h/12 h Hell-Dunkel-Per...

<ol>
	<li>Szent-Gyorgyi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-energy+relations+and+contraction+of+actomyosin.">Free-energy relations and contraction of actomyosin.</a> Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).</li><li>Hoffman-Berling, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosintriphosphat+als+betriebsstoff+von+zellbewegungen.">Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).</li><li>Naitoh, Y., Kaneko, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivated+Triton-extracted+models+of+Paramecium:+modification+of+ciliary+movement+by+calcium+ions.">Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions.</a> Science. 176 (4034), 523-524 (1972).</li><li>Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+flagellar+mutants+lacking+radial+spokes+and+central+tubules.+Structure,+composition,+and+function+of+specific+axonemal+components.">Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components.</a> Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).</li><li>R&#252;ffer, U., Nultsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+coordination+in+Chlamydomonas+cells+held+on+micropipettes.">Flagellar coordination in Chlamydomonas cells held on micropipettes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 41 (4), 297-307 (1998).</li><li>Sale, W. S., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+active+sliding+of+microtubules+in+Tetrahymena+cilia.">Direction of active sliding of microtubules in Tetrahymena cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (5), 2045-2049 (1977).</li><li>Fox, L. A., Sale, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+force+generated+by+the+inner+row+of+dynein+arms+on+flagellar+microtubules.">Direction of force generated by the inner row of dynein arms on flagellar microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 105 (4), 1781-1787 (1987).</li><li>Kamiya, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+assessed+by+in+vitro+and+in+vivo+motility+assays+of+Chlamydomonas+mutants.">Functional diversity of axonemal dyneins as assessed by in vitro and in vivo motility assays of Chlamydomonas mutants.</a> Zoolog Science. 31 (10), 633-644 (2014).</li><li>Kamiya, R., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicromolar+levels+of+calcium+control+the+balance+of+beating+between+the+two+flagella+in+demembranated+models+of+Chlamydomonas.">Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).</li><li>Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototactic+activity+in+Chlamydomonas+'non-phototactic'+mutants+deficient+in+Ca2+-dependent+control+of+flagellar+dominance+or+in+inner-arm+dynein.">Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein.</a> Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).</li><li>Hyams, J. S., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+flagellar+apparatus+of+Chlamydomonas:+characterization+of+forward+swimming+and+alteration+of+waveform+and+reversal+of+motion+by+calcium+ions+in+vitro.">Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro.</a> Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).</li><li>Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+CAV2+encodes+a+voltage-+dependent+calcium+channel+required+for+the+flagellar+waveform+conversion.">Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion.</a> Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).</li><li>Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+control+of+waveform+in+isolated+flagellar+axonemes+of+Chlamydomonas.">Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).</li><li>Wakabayashi, K., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+flagellar+motility+by+redox+poise.">Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise.</a> Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).</li><li>Saegusa, Y., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+controls+the+balance+of+the+propulsive+forces+generated+by+the+two+flagella+of+Chlamydomonas.">cAMP controls the balance of the propulsive forces generated by the two flagella of Chlamydomonas.</a> Cytoskeleton. 72 (8), 412-421 (2015).</li><li>Gorman, D. S., Levine, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+f+and+plastocyanin:+their+sequence+in+the+photosynthetic+electron+transport+chain+of+Chlamydomonas+reinhardi.">Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).</li><li>Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+estimation+of+cytosolic+ATP+concentration+from+the+ciliary+beating+frequency+in+the+green+alga+Chlamydomonas+reinhardtii.">Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).</li><li>Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+waveform+conversion+in+the+flagellar+axoneme+of+Chlamydomonas+mutants+lacking+the+central-pair/radial+spoke+system.">Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).</li><li>Yueh, Y. G., Crain, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deflagellation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+follows+a+rapid+transitory+accumulation+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+requires+Ca2++entry.">Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry.</a> Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).</li><li>Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+flagellar+motility+activation+in+Chlamydomonas+reinhardtii+in+response+to+mechanical+agitation.">Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).</li><li>Ueki, N., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-extracted+Volvox+model+exhibits+an+anterior-posterior+gradient+in+flagellar+Ca2.">Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1061-1068 (2018).</li><li>Tanno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four-celled+Volvocales+green+alga+Tetrabaena+socialis+exhibits+weak+photobehavior+and+high-photoprotection+ability.">The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability.</a> PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).</li></ol>

Es gibt zwei kritische Schritte in diesem Protokoll. Der erste ist ein Prozess, der als Demembranation bekannt ist und sanft, aber gründlich durchgeführt werden muss. Die Deziliation (d.h. das Ablösen von Zilien vom Zellkörper) wird durch kräftiges Pipettieren oder Wirbeln induziert, wodurch die Zellmodelle auch nach der Zugabe von ATP unbeweglich werden. Typischerweise sind 5 × 107 Zellen in ~0,5 ml Demembranationspuffer suspendiert (Endzelldichte: 1 × 108 Zellen/ml). Die Reaktivierungsrate ...

Die In-vitro-Reaktivierung demembranierter beweglicher Zellen ist ein wertvolles Werkzeug, um die molekularen Grundlagen für den Regulationsmechanismus der Zellmotilität zu untersuchen. Szent-Györgyi zeigte erstmals eine In-vitro-Kontraktion von Kaninchenskelettmuskelfasern, die mit 50% Glycerin extrahiert wurden, durch Zugabe von Adenosintriphosphat (ATP)1. Dieses Experiment war das erste, das bewies, dass ATP die Muskelkontraktion mit Energie versorgt. Die Methodik wurde bald auf die Untersuchung von ATP-energetisierter Ziliar- / Flagellenmotilität angewendet, wie Spermienflagellen2, Paramecium cilia 3 und Chlamydomonas reinhardtii cilia (auch Flagellen genannt)4 unter Verwendung von nichtionischen Reinigungsmitteln zur Demembranation.
Die einzellige Grünalge C. reinhardtii ist ein Modellorganismus für die Erforschung von Zilien: Sie schwimmt mit zwei Zilien, indem sie sie wie die Brust eines Menschen schlägt5. Die Ziliarbewegung wird durch Dynein angetrieben, ein minus-end-gerichtetes Mikrotubuli-basiertes Motorprotein 6,7. Ziliare Dyneine können in Außenarm-Dynes und Innenarm-Dynein eingeteilt werden. Mutanten, denen jede Art von Dynein fehlt, wurden als langsam schwimmende Mutanten mit unterschiedlichen Motilitätsanomalien isoliert. Die detaillierte In-vitro-Motilitätsanalyse dieser Mutanten hat die Dynein-Forschung erheblich vorangebracht8.
Seit der Etablierung des In-vitro-Reaktivierungsexperiments von demembranierten C. reinhardtii-Zellen (Zellmodelle) wurden mit dieser Methode und ihren Derivaten viele wichtige Erkenntnisse erzielt. Die Reaktivierung von Zellmodellen in einer Reihe von Ca2+-Puffern zeigtebeispielsweise 9, dass zwei Zilien durch submikromolare Ca2+ unterschiedlich reguliert werden, und diese asymmetrische Zilienkontrolle ermöglicht die phototaktische Orientierung von C. reinhardtii10. Darüber hinaus zeigen beide Zilien eine Wellenformkonvertierung vom Vorwärtsschwimmmodus (asymmetrische Wellenform genannt) in den Rückwärtsschwimmmodus (symmetrische Wellenform genannt, die für einen kurzen Zeitraum auftritt, wenn Zellen photo- oder mechanoschockiert sind)11,12. Diese Wellenformumwandlung wird durch submillimolare Ca2+ reguliert, was durch die Reaktivierung des sogenannten Nukleoflagellarapparates (ein Komplex mit zwei Zilien, den Basalkörpern, den Strukturen, die die Basalkörper mit dem Kern verbinden, und dem Rest des Kerns)11 oder demembranierten Axonemen isolierter Zilien13 gezeigt wurde. Abgesehen von Ca2 + ist die Redox-Haltung (Reduktions-Oxidation) ein Signal, das die Ziliarschlagfrequenz reguliert, was durch die Reaktivierung von Zellmodellen in Redoxpuffern gezeigt wurde, die unterschiedliche Verhältnisse von reduziertem Glutathion zu oxidiertem Glutathion 14 enthalten. Darüber hinaus reguliert cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) asymmetrisch zwei Zilien, was durch die Reaktivierung von Axonemen mit photoklavierbarem cAMP15 gezeigt wurde. Diese In-vitro-Befunde, kombiniert mit genetischen Befunden, haben zu einem tieferen Verständnis der molekularen Mechanismen der Zilienregulation bei C. reinhardtii geführt.
Ein Protokoll zur Reaktivierung der Zellmodelle wird hier beschrieben. Die Methode ist einfach, ermöglicht verschiedene Modifikationen und kann auf mehrere Organismen angewendet werden, die sich mit Zilien bewegen. Da demembranierte Zellen jedoch zerbrechlich sind, sind einige Tipps erforderlich, um die Motilität von Zellmodellen mit guter Effizienz zu reaktivieren und gleichzeitig eine Dezitilisierung zu verhindern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL plastic tube</td>
			<td>QSP</td>
			<td>502-PLN-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sima-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>KUBOTA</td>
			<td>2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas strain CC-125</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td></td>
			<td>https://www.chlamycollection.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CK-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CRPHO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEDTA(EGTA)</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>G002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>GB70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>21002-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, Mr 20,000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18897.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>28434-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii

Seit dem historischen Experiment zur Kontraktion glykerinierter Muskeln durch Zugabe von ATP, das Szent-Györgyi Mitte des 20. Jahrhunderts demonstrierte, ist die In-vitro-Reaktivierung demembranierter Zellen ein traditioneller und wirksamer Weg, um die Zellmotilität zu untersuchen. Der grundlegende Vorteil dieser experimentellen Methode besteht darin, dass die Zusammensetzung der Reaktivierungslösung leicht verändert werden kann. Zum Beispiel kann eine Umgebung mit hoher Ca2 + - Konzentration, die aufgrund der Membrananregung in vivo nur vorübergehend auftritt, im Labor repliziert werden. Eukaryotische Zilien (auch bekannt als Flagellen) sind ausgeklügelte Motilitätsmechanismen, deren Regulationsmechanismen noch geklärt werden müssen. Die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ist ein hervorragender Modellorganismus im Forschungsgebiet der Zilien. Die Reaktivierungsexperimente mit demembranierten Zellmodellen von C. reinhardtii und ihren Derivaten, wie demembranierten Axonemen isolierter Zilien, haben wesentlich zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Ziliarmotilität beigetragen. Diese Experimente stellten klar, dass ATP die Ziliarmotilität anregt und dass verschiedene zelluläre Signale, einschließlich Ca2 +, cAMP und reaktive Sauerstoffspezies, Ziliarbewegungen modulieren. Die genaue Methode zur Demembranation von C. reinhardtii-Zellen und zur Reaktivierung der Zellmodelle wird hier beschrieben.

Der Demembranations- und Reaktivierungsprozess in C. reinhardtii Wildtypstamm (CC-125) ist hier dargestellt. Die Kultur wurde 2 Tage nach der Impfung hellgrün (Schritt 1.1) (Abbildung 1). Die Zellen wurden gesammelt (Schritt 2.1), gewaschen (Schritt 2.2) und demembraniert (Schritt 2.5). Nach der Demembranation wurden alle Zellmodelle unbeweglich (Schritt 2.7). Die demembranierten Zilien (Axoneme genannt) bleiben am Zellkörper haften, was zeigt, dass die Unbeweglichkeit der Zellmo...

Watch this Scientific Journal Video about Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

Die In-vitro-Reaktivierung beweglicher Zellen ist ein entscheidendes Experiment zum Verständnis der Mechanismen der Zellmotilität. Das Protokoll beschreibt die Reaktivierung der demembranierten Zellmodelle von Chlamydomonas reinhardtii, einem Modellorganismus zur Untersuchung von Zilien / Flagellen.

Reaktivierung demembranierter Zellmodelle in Chlamydomonas reinhardtii

Since the historical experiment on the contraction of glycerinated muscle by adding ATP, which Szent-Gy&#246;rgyi demonstrated in the mid-20th century, in ...

Diese Methode kann helfen zu verstehen, welche Faktoren die Motilität der Zilien beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Phänomene, die nur vorübergehend in vivo auftreten, wie eine Inversion der Calciumionenkonzentrationen in Zilien, kontinuierlich in vitro beobachtet werden können. Diese Methode trägt speziell zum Forschungsfeld der beweglichen Zilien bei.Für Anfänger wäre es schwierig, den Demembranierungsschritt durchzuführen. Daher ist es sehr empfehlenswert, die Schritte sanft, aber präzise durchzuführen. Beginnen Sie mit dem Zentrifugieren von etwa 10 Millilitern Chlamydomonas reinhardtii-Kultur bei 1.000 RCF bei 20 Grad Celsius für drei Minuten.Dekantieren Sie den Überstand und saugen Sie den Rest mit einer Pasteur-Pipette ab. Resuspendieren Sie die Ausscheidungen in etwa fünf Millilitern Waschpuffer. Zentrifugenzellen im Waschpuffer bei 1.000 RCF für drei Minuten bei 20 Grad Celsius.Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Geben Sie dem Zellpellet etwa 0,5 Milliliter Demembranationspuffer hinzu. Schütteln Sie die Röhre vorsichtig, um die Zellen im Puffer grob auszusetzen, und legen Sie die Röhre dann auf Eis.Suspendieren Sie das restliche Zellpellet vorsichtig mit einer Pipette und legen Sie das Rohr wieder auf das Eis. Nehmen Sie 5 bis 10 Mikroliter des Zellmodells, verdünnen Sie es zehnfach mit dem Verdünnungspuffer und beobachten Sie unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass alle Zellmodelle demembraniert sind und nicht schwimmen. Mischen Sie in einem 0,5-Milliliter-Röhrchen 80 Mikroliter Reaktivierungslösung, 10 Mikroliter ATP-Lösung und 10 Mikroliter Zellmodelle, indem Sie auf die Röhre tippen.Legen Sie etwa 30 Mikroliter der gemischten Lösung auf einen Glasobjektträger und legen Sie vorsichtig einen Deckzettel mit Abstandshaltern darauf, um einen mechanischen Schock auf das Zellmodell zu vermeiden. Beobachten Sie die reaktivierten Zellmodelle unter dem Mikroskop. Nach der Demembranation der C.reinhardtii-Kultur wurden alle Zellmodelle unbeweglich und die demembranierten Zilien blieben am Zellkörper haftbar, was bestätigt, dass die Unbeweglichkeit der Zellmodelle nicht durch Deziliierung verursacht wurde.Nach dem Mischen der Zellmodelle mit dem Reaktivierungspuffer in ATP wurden mehr als 50% der Zellmodelle beweglich. Selbst ohne das ATP-Regenerationssystem bewegten sich die reaktivierten Zellen etwa 90 Minuten lang mit einer endgültigen ATP-Konzentration von einem Millimolar, bevor sie allmählich stoppten. Der Demembranierungsschritt ist entscheidend.Alle Zellen sollten aufhören zu schwimmen, aber sie sollten nicht so stark gemischt werden, dass eine Deziliierung auftritt. Forscher können dieses Protokoll modifizieren, um Reagenzien wie Kalziumionen oder zyklisches AMP einzubeziehen, oder Experimente mit einer Mutante durchführen, der ein bestimmtes Protein fehlt, um ihre biologische Rolle zu identifizieren.

Research

JoVE Journal

Biology

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Paarung und Tetrad Trennung von Chlamydomonas reinhardtii Für genetische Analysen

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Forschung

Biologie

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Heterotope und orthotopen Tracheal Transplantation in Mäuse als Modelle benutzt, um die Entwicklung von obliterans Airway Disease Study

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video bioinformatischen Analyse von humanen embryonalen Stammzellen Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

Principles of Surgery Nager für die New Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats

Manuelle Restraint und Common Compound Verabreichungswege bei Mäusen und Ratten

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research.  Working confidently and humanely with mice and ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

Diagnostic Necropsy und ausgewählte Gewebe und Probenentnahme bei Ratten und Mäusen

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemische Rekonstitution der Steroid-Rezeptor • Hsp90-Protein-Komplexen und Reaktivierung der Ligandenbindung

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Maus Sperma Kryokonservierung und Recovery mit der I · Cryo-Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models

Die Züchtung und Anwendungen von Rotating Wand Schiff Bioreaktor Abgeleitet 3D Epithelzellen Models

Cells and tissues in the body experience environmental conditions that influence their architecture, intercellular communications, and overall functions. ...