Name: reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים של האגודה היפנית לקידום המדע KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) ל- N.U. (19K23758, 21K06295) ו- K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), מקרן המדע של Ohsumi Frontier Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) ל- K.W., ומהברית הדינמית לחדשנות פתוחה המגשרת בין האדם, הסביבה והחומרים (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) ל- N.U. ו- K.W. אנו מודים לגב' מיוקי שינוהארה (Hosei Univ.) על עזרתה בהכנת הדמויות.

זן פראי של Chlamydomonas reinhardtii, CC-125, שימש למחקר הנוכחי. CC-125 התקבל ממרכז המשאבים של כלמידומונס (ראה טבלת חומרים) ונשמר על טריס-אצטט-פוספט (TAP)16, 1.5% בינוני אגרוז ב 20-25 מעלות צלזיוס.
1. תרבית תאים
<ol><li>תרבית Chlamydomonas reinhardtii (CC-125) במדיום TAP16<...

<ol>
	<li>Szent-Gyorgyi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-energy+relations+and+contraction+of+actomyosin.">Free-energy relations and contraction of actomyosin.</a> Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).</li><li>Hoffman-Berling, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosintriphosphat+als+betriebsstoff+von+zellbewegungen.">Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).</li><li>Naitoh, Y., Kaneko, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivated+Triton-extracted+models+of+Paramecium:+modification+of+ciliary+movement+by+calcium+ions.">Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions.</a> Science. 176 (4034), 523-524 (1972).</li><li>Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+flagellar+mutants+lacking+radial+spokes+and+central+tubules.+Structure,+composition,+and+function+of+specific+axonemal+components.">Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components.</a> Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).</li><li>R&#252;ffer, U., Nultsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+coordination+in+Chlamydomonas+cells+held+on+micropipettes.">Flagellar coordination in Chlamydomonas cells held on micropipettes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 41 (4), 297-307 (1998).</li><li>Sale, W. S., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+active+sliding+of+microtubules+in+Tetrahymena+cilia.">Direction of active sliding of microtubules in Tetrahymena cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (5), 2045-2049 (1977).</li><li>Fox, L. A., Sale, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+force+generated+by+the+inner+row+of+dynein+arms+on+flagellar+microtubules.">Direction of force generated by the inner row of dynein arms on flagellar microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 105 (4), 1781-1787 (1987).</li><li>Kamiya, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+assessed+by+in+vitro+and+in+vivo+motility+assays+of+Chlamydomonas+mutants.">Functional diversity of axonemal dyneins as assessed by in vitro and in vivo motility assays of Chlamydomonas mutants.</a> Zoolog Science. 31 (10), 633-644 (2014).</li><li>Kamiya, R., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicromolar+levels+of+calcium+control+the+balance+of+beating+between+the+two+flagella+in+demembranated+models+of+Chlamydomonas.">Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).</li><li>Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototactic+activity+in+Chlamydomonas+'non-phototactic'+mutants+deficient+in+Ca2+-dependent+control+of+flagellar+dominance+or+in+inner-arm+dynein.">Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein.</a> Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).</li><li>Hyams, J. S., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+flagellar+apparatus+of+Chlamydomonas:+characterization+of+forward+swimming+and+alteration+of+waveform+and+reversal+of+motion+by+calcium+ions+in+vitro.">Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro.</a> Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).</li><li>Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+CAV2+encodes+a+voltage-+dependent+calcium+channel+required+for+the+flagellar+waveform+conversion.">Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion.</a> Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).</li><li>Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+control+of+waveform+in+isolated+flagellar+axonemes+of+Chlamydomonas.">Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).</li><li>Wakabayashi, K., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+flagellar+motility+by+redox+poise.">Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise.</a> Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).</li><li>Saegusa, Y., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+controls+the+balance+of+the+propulsive+forces+generated+by+the+two+flagella+of+Chlamydomonas.">cAMP controls the balance of the propulsive forces generated by the two flagella of Chlamydomonas.</a> Cytoskeleton. 72 (8), 412-421 (2015).</li><li>Gorman, D. S., Levine, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+f+and+plastocyanin:+their+sequence+in+the+photosynthetic+electron+transport+chain+of+Chlamydomonas+reinhardi.">Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).</li><li>Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+estimation+of+cytosolic+ATP+concentration+from+the+ciliary+beating+frequency+in+the+green+alga+Chlamydomonas+reinhardtii.">Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).</li><li>Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+waveform+conversion+in+the+flagellar+axoneme+of+Chlamydomonas+mutants+lacking+the+central-pair/radial+spoke+system.">Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).</li><li>Yueh, Y. G., Crain, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deflagellation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+follows+a+rapid+transitory+accumulation+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+requires+Ca2++entry.">Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry.</a> Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).</li><li>Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+flagellar+motility+activation+in+Chlamydomonas+reinhardtii+in+response+to+mechanical+agitation.">Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).</li><li>Ueki, N., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-extracted+Volvox+model+exhibits+an+anterior-posterior+gradient+in+flagellar+Ca2.">Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1061-1068 (2018).</li><li>Tanno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four-celled+Volvocales+green+alga+Tetrabaena+socialis+exhibits+weak+photobehavior+and+high-photoprotection+ability.">The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability.</a> PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).</li></ol>

ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הראשון הוא תהליך המכונה demembranation, אשר צריך להתבצע בעדינות אך ביסודיות. דציליה (כלומר, התנתקות של ריסונים מגוף התא) נגרמת על ידי צנרת נמרצת או מערבולת, מה שהופך את מודלי התאים לבלתי משותקים גם לאחר הוספת ATP. בדרך כלל, 5 × 107 תאים מושעים בכ-0.5 מ"ל של מאגר ד?...

הפעלה מחדש במבחנה של תאי תנועתיות שעברו דה-ממברנות היא כלי רב ערך לחקר הבסיס המולקולרי למנגנון הוויסות של תנועתיות התא. Szent-Györgyi הדגים לראשונה התכווצות במבחנה של סיבי שרירי השלד של ארנב המופקים מ-50% גליצרול על ידי הוספת אדנוזין טריפוספט (ATP)1. ניסוי זה היה הראשון שהוכיח כי ATP ממריץ התכווצות שרירים. המתודולוגיה יושמה במהרה בחקר תנועתיות סילארית/פלאגלרית המופעלת על ידי ATP, כגון פלגלה זרע2, ריסונים Paramecium 3, ו- Chlamydomonas reinhardtii cilia (הנקראת גם פלגלה)4 תוך שימוש בדטרגנטים לא יוניים לדה-ממברנציה.
האצה הירוקה החד-תאית C. reinhardtii היא אורגניזם מודל לחקר ריסונים: היא שוחה עם שני ריסונים על ידי הכאתם כמו מכת חזה של אדם5. תנועה סילארית מונעת על ידי dynein, חלבון מוטורי מבוסס מיקרוטובול מכוון קצה מינוס 6,7. ניתן לסווג את הדיינינים הסילאריים לדיינינים בעלי זרוע חיצונית ולדיינינים בעלי זרוע פנימית. מוטנטים שחסרים להם כל סוג של דיינין בודדו כמוטנטים שוחים לאט עם הפרעות שונות בתנועתיות. ניתוח תנועתיות מבחנה מפורט של מוטנטים אלה קידם באופן משמעותי את מחקר הדיינין8.
ממצאים חשובים רבים הושגו תוך שימוש בשיטה זו ובנגזרותיה מאז הוקם ניסוי ההפעלה מחדש במבחנה של תאי C. reinhardtii (מודלים של תאים) שעברו דה-ממברנטציה. הפעלה מחדש של מודלים של תאים בסדרה של מאגרי Ca2+, למשל, הראתה9 ששתי ריסונים מווסתים באופן שונה על ידי תת-מיקרומולאר Ca2+, ובקרת ריסונים אסימטרית זו מאפשרת את הכיוון הפוטוטקטי של C. reinhardtii10. יתר על כן, שתי הריסונים מראים המרה של צורת גל ממצב השחייה הקדמית (הנקראת צורת גל אסימטרית) למצב השחייה לאחור (הנקרא צורת גל סימטרית המופיעה לתקופה קצרה כאשר התאים הם בהלם פוטו או מכני)11,12. המרת צורת גל זו מווסתת על ידי תת-מילימולאר Ca2+, אשר הודגם על ידי הפעלה מחדש של מה שמכונה מנגנון נוקלאופלגלר (קומפלקס המכיל שני ריסונים, הגופים הבסיסיים, המבנים המקשרים בין הגופים הבסיסיים לגרעין, ושריד הגרעין)11 או אקסונמים מתפרקים של ריסונים מבודדים13. מלבד Ca2+, חמצון-חיזור (חמצון-הפחתה) הוא אות המווסת את תדירות הפעימה הציליארית, אשר הוכחה על ידי הפעלה מחדש של מודלים תאיים במאגרי חמצון-חיזור המכילים יחסים שונים של גלוטתיון מופחת לעומת גלוטתיון מחומצן14. בנוסף, אדנוזין מונופוספט מחזורי (cAMP) מווסת באופן אסימטרי שני ריסונים, אשר הודגם על ידי הפעלה מחדש של אקסונמים עם cAMP15 כלוב פוטו-מחשוף. ממצאים אלה במבחנה, בשילוב עם ממצאים גנטיים, הובילו להבנה מעמיקה יותר של המנגנונים המולקולריים של ויסות הריסונים ב- C. reinhardtii.
פרוטוקול להפעלה מחדש של מודלי התאים מתואר כאן. השיטה היא פשוטה, מאפשרת שינויים שונים, וניתן ליישם אותה על אורגניזמים מרובים הנעים עם ריסונים. עם זאת, מאחר שתאים שעברו דה-ממברניזציה הם שבריריים, זה דורש כמה טיפים כדי להפעיל מחדש את התנועתיות של מודלים של תאים ביעילות טובה תוך מניעת דצילציה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL plastic tube</td>
			<td>QSP</td>
			<td>502-PLN-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sima-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>KUBOTA</td>
			<td>2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas strain CC-125</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td></td>
			<td>https://www.chlamycollection.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CK-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CRPHO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEDTA(EGTA)</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>G002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>GB70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>21002-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, Mr 20,000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18897.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>28434-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii

מאז הניסוי ההיסטורי על התכווצות שריר גליצרין על ידי הוספת ATP, אותו הדגים Szent-Györgyi באמצע המאה ה-20, הפעלה מחדש במבחנה של תאים שעברו דה-ממבראן הייתה דרך מסורתית ורבת עוצמה לבחון את תנועתיות התאים. היתרון הבסיסי של שיטת ניסוי זו הוא כי הרכב של פתרון ההפעלה מחדש עשוי להשתנות בקלות. לדוגמה, ניתן לשכפל במעבדה סביבת ריכוז גבוהה של Ca2+ המתרחשת רק באופן זמני עקב עירור ממברנה in vivo . ריסונים אאוקריוטיים (באנגלית: Eukaryotic cilia) הם מכונות תנועתיות משוכללות שמנגנוני הוויסות שלהן עדיין לא ברורים. האצה הירוקה החד-תאית Chlamydomonas reinhardtii היא אורגניזם מודל מצוין בתחום המחקר של הריסונים. ניסויי ההפעלה מחדש באמצעות מודלים של תאים שעברו דה-ממברניזציה של C. reinhardtii ונגזרותיהם, כגון אקסונמות מדולדלות של ריסונים מבודדים, תרמו באופן משמעותי להבנת המנגנונים המולקולריים של תנועתיות סילארית. ניסויים אלה הבהירו כי ATP ממריץ תנועתיות ציליארית וכי אותות תאיים שונים, כולל Ca2+, cAMP ומיני חמצן תגובתי, מווסתים תנועות סילאריות. השיטה המדויקת לדה-ממברנציה של תאי C. reinhardtii ולהפעלה מחדש של מודלי התאים מתוארת כאן.

תהליך הדה-ממברנציה וההפעלה מחדש בזן הבר C. reinhardtii (CC-125) מוצג כאן. התרבות יומיים לאחר החיסון הפכה לצבע ירוק בהיר (שלב 1.1) (איור 1). התאים נאספו (שלב 2.1), נשטפו (שלב 2.2) והושמדו (שלב 2.5). לאחר הדה-ממברנציה, כל המודלים התאיים הפכו לאימוטיליים (שלב 2.7). הריסונים המדולדלים (הנקראים אקס?...

Watch this Scientific Journal Video about Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

הפעלה מחדש במבחנה של תאי תנועתיות היא ניסוי מכריע בהבנת המנגנונים של תנועתיות התאים. הפרוטוקול מתאר הפעלה מחדש של מודלי התאים המדולדלים של Chlamydomonas reinhardtii, אורגניזם מודל לחקר ריסונים/פלגלה.

הפעלה מחדש של מודלים של תאים מדולדלים בכלמידומונס ריינהרדטי

Since the historical experiment on the contraction of glycerinated muscle by adding ATP, which Szent-Gy&#246;rgyi demonstrated in the mid-20th century, in ...

שיטה זו יכולה לעזור להבין אילו גורמים משפיעים על תנועתיות הריסונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי תופעות המתרחשות רק באופן זמני in vivo, היפוך כזה של ריכוזי יוני סידן בריסונים ניתן לראות ברציפות במבחנה. שיטה זו תורמת במיוחד לתחום המחקר של ריסונים תנועתיים.זה יהיה קשה למתחילים לבצע את שלב demembranation. לפיכך, מומלץ מאוד לבצע את הצעדים בעדינות אך במדויק. התחילו בצנטריפוגה של כ-10 מיליליטרים של תרבות כלמידומונס ריינהרדטי ב-1, 000 RCF ב-20 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.דקאנט את הסופרנאטנט ושואף את השריד על ידי פיפטה של פסטר. יש להחיות את המשקעים בכ-5 מיליליטרים של חיץ כביסה. תאי צנטריפוגה במאגר הכביסה ב 1, 000 RCF במשך שלוש דקות ב 20 מעלות צלזיוס.השליכו את הסופרנאטנט בזהירות עם פיפטה. הוסף כ-0.5 מיליליטרים של מאגר דה-ממברנציה לכדור התא. לנער את הצינור בעדינות כדי להשעות בערך את התאים במאגר, ואז לשים את הצינור על קרח.תלו את כדור התא הנותר בעדינות עם פיפטה והניחו שוב את הצינור על הקרח. קחו 5 עד 10 מיקרוליטרים של מודל התא, דיללו פי עשרה עם מאגר הדילול, והתבוננו מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שכל המודלים התאיים מתפרקים ולא שוחים. בצינור 0.5 מיליליטר, מערבבים 80 מיקרוליטרים של תמיסת הפעלה מחדש, 10 מיקרוליטרים של תמיסת ATP ו-10 מיקרוליטרים של מודלים של תאים על ידי הקשה על הצינור.שים כ-30 מיקרוליטרים של התמיסה המעורבת על מגלשת זכוכית והנח עליה בעדינות החלקת כיסוי עם ספייסרים כדי למנוע זעזוע מכני לדגם התא. התבונן במודלים התאיים שהופעלו מחדש תחת מיקרוסקופ. לאחר הדה-ממברנציה של תרבית C.reinhardtii, כל המודלים של התאים הפכו לאימוטיליים והריסונים המדולדלים נשארו מחוברים לגוף התא, מה שאישר כי חוסר תנועתיות של המודלים התאיים לא נגרם על ידי דה-ציליאציה.לאחר ערבוב המודלים של התאים עם מאגר ההפעלה מחדש ב-ATP, יותר מ-50% ממודלים של תאים הפכו לתנועתיים. גם ללא מערכת ההתחדשות של ה-ATP, התאים שהופעלו מחדש המשיכו לנוע במשך כ-90 דקות עם ריכוז ATP סופי של מילימולר אחד לפני שנעצרו בהדרגה. שלב הדה-ממברנציה הוא קריטי.כל התאים צריכים להפסיק לשחות, אבל הם לא צריכים להיות מעורבים כל כך חזק כי de-ciliation מתרחשת. חוקרים יכולים לשנות פרוטוקול זה כך שיכלול ריאגנטים כגון יוני סידן או AMP מחזורי, או לבצע ניסויים עם מוטציה חסרה חלבון מסוים כדי לזהות את תפקידם הביולוגי.

Research

JoVE Journal

Biology

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

הזדווגות והפרדה של הטטרדה Chlamydomonas reinhardtii עבור ניתוח גנטי

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

השתלת קנה הנשימה Heterotopic ו orthotopic ב עכברים משמשים מודלים לחקר התפתחות המחלה Airway סותם

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

וידאו ביואינפורמטיקה ניתוח גדילה אנושי בתאי גזע עובריים קולוני

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

עקרונות של ניתוח מכרסמים למנתח חדש

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats

איפוק ידני ומסלולי מנהל מתחם נפוצים בעכברים וחולדות

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research.  Working confidently and humanely with mice and ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

Necropsy לאבחון רקמות אוסף נבחר מדגם של חולדות ועכברים

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

הכינון ביוכימיים של קולטן סטרואידים • Hsp90 קומפלקסים חלבונים ו מחדש של ליגנד הכבילה

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models

Culturing ויישומים של סיבוב bioreactor וול כלי נגזר מודלים 3D תא אפיתל

Cells and tissues in the body experience environmental conditions that influence their architecture, intercellular communications, and overall functions. ...