Name: reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

이 연구는 일본 과학 진흥 협회 KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html)에서 N.U. (19K23758, 21K06295) 및 K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/)에서 K.W.로, 그리고 인간, 환경 및 재료 브리징을위한 동적 얼라이언스 (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/)에서 N.U. 및 K.W.에 대한 보조금으로 지원되었습니다. 시노하라 미유키 여사(호세이 대학교)에게 피겨 준비에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다.

클라미도모나스 라인하르티이, CC-125의 야생형 균주를 본 연구에 사용하였다. CC-125를 클라미도모나스 자원 센터(표 자료 참조)로부터 수득하고, 20-25°C에서 트리스-아세테이트-포스페이트(TAP)16, 1.5% 아가로스 배지 상에서 유지시켰다.
1. 세포 배양
<ol><li>클라미도모나스 라인하르티이(CC-125)를 TAP 배지16에?...

<ol>
	<li>Szent-Gyorgyi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-energy+relations+and+contraction+of+actomyosin.">Free-energy relations and contraction of actomyosin.</a> Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).</li><li>Hoffman-Berling, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosintriphosphat+als+betriebsstoff+von+zellbewegungen.">Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).</li><li>Naitoh, Y., Kaneko, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivated+Triton-extracted+models+of+Paramecium:+modification+of+ciliary+movement+by+calcium+ions.">Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions.</a> Science. 176 (4034), 523-524 (1972).</li><li>Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+flagellar+mutants+lacking+radial+spokes+and+central+tubules.+Structure,+composition,+and+function+of+specific+axonemal+components.">Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components.</a> Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).</li><li>R&#252;ffer, U., Nultsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+coordination+in+Chlamydomonas+cells+held+on+micropipettes.">Flagellar coordination in Chlamydomonas cells held on micropipettes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 41 (4), 297-307 (1998).</li><li>Sale, W. S., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+active+sliding+of+microtubules+in+Tetrahymena+cilia.">Direction of active sliding of microtubules in Tetrahymena cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (5), 2045-2049 (1977).</li><li>Fox, L. A., Sale, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+force+generated+by+the+inner+row+of+dynein+arms+on+flagellar+microtubules.">Direction of force generated by the inner row of dynein arms on flagellar microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 105 (4), 1781-1787 (1987).</li><li>Kamiya, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+assessed+by+in+vitro+and+in+vivo+motility+assays+of+Chlamydomonas+mutants.">Functional diversity of axonemal dyneins as assessed by in vitro and in vivo motility assays of Chlamydomonas mutants.</a> Zoolog Science. 31 (10), 633-644 (2014).</li><li>Kamiya, R., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicromolar+levels+of+calcium+control+the+balance+of+beating+between+the+two+flagella+in+demembranated+models+of+Chlamydomonas.">Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).</li><li>Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototactic+activity+in+Chlamydomonas+'non-phototactic'+mutants+deficient+in+Ca2+-dependent+control+of+flagellar+dominance+or+in+inner-arm+dynein.">Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein.</a> Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).</li><li>Hyams, J. S., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+flagellar+apparatus+of+Chlamydomonas:+characterization+of+forward+swimming+and+alteration+of+waveform+and+reversal+of+motion+by+calcium+ions+in+vitro.">Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro.</a> Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).</li><li>Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+CAV2+encodes+a+voltage-+dependent+calcium+channel+required+for+the+flagellar+waveform+conversion.">Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion.</a> Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).</li><li>Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+control+of+waveform+in+isolated+flagellar+axonemes+of+Chlamydomonas.">Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).</li><li>Wakabayashi, K., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+flagellar+motility+by+redox+poise.">Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise.</a> Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).</li><li>Saegusa, Y., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+controls+the+balance+of+the+propulsive+forces+generated+by+the+two+flagella+of+Chlamydomonas.">cAMP controls the balance of the propulsive forces generated by the two flagella of Chlamydomonas.</a> Cytoskeleton. 72 (8), 412-421 (2015).</li><li>Gorman, D. S., Levine, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+f+and+plastocyanin:+their+sequence+in+the+photosynthetic+electron+transport+chain+of+Chlamydomonas+reinhardi.">Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).</li><li>Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+estimation+of+cytosolic+ATP+concentration+from+the+ciliary+beating+frequency+in+the+green+alga+Chlamydomonas+reinhardtii.">Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).</li><li>Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+waveform+conversion+in+the+flagellar+axoneme+of+Chlamydomonas+mutants+lacking+the+central-pair/radial+spoke+system.">Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).</li><li>Yueh, Y. G., Crain, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deflagellation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+follows+a+rapid+transitory+accumulation+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+requires+Ca2++entry.">Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry.</a> Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).</li><li>Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+flagellar+motility+activation+in+Chlamydomonas+reinhardtii+in+response+to+mechanical+agitation.">Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).</li><li>Ueki, N., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-extracted+Volvox+model+exhibits+an+anterior-posterior+gradient+in+flagellar+Ca2.">Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1061-1068 (2018).</li><li>Tanno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four-celled+Volvocales+green+alga+Tetrabaena+socialis+exhibits+weak+photobehavior+and+high-photoprotection+ability.">The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability.</a> PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).</li></ol>

이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 demembranation으로 알려진 과정으로, 부드럽지만 철저하게 수행되어야합니다. 감소(즉, 세포체로부터 섬모의 분리)는 격렬한 피펫팅 또는 볼텍싱에 의해 유도되고, ATP의 첨가 후에도 세포 모델을 움직이지 않게 만든다. 전형적으로, 5 × 10,7 세포는 ~0.5 mL의 탈지 완충액에 현탁된다(최종 세포 밀도: 1 × 108 세포/mL). 세포 모델...

탈embranated 운동성 세포의 시험관내 재활성화는 세포 운동성의 조절 메카니즘에 대한 분자 기초를 연구하기 위한 유용한 도구이다. Szent-Györgyi는 아데노신 트리포스페이트(ATP)1를 첨가하여 50% 글리세롤로 추출한 토끼 골격근 섬유의 시험관내 수축을 처음으로 입증했습니다. 이 실험은 ATP가 근육 수축에 활력을 불어 넣는다는 것을 증명한 최초의 실험이었습니다. 이 방법론은 곧 정자 편모2, Paramecium cilia3 및 Chlamydomonas reinhardtii cilia (편모라고도 함)4와 같은 ATP 에너지 섬모 / 편모 운동성에 대한 연구에 적용되었습니다 demembranation을위한 비 이온성 세제를 사용합니다.
단세포 녹색 알가 C. reinhardtii는 섬모를 연구하기위한 모델 유기체입니다 : 그것은 인간의 가슴 스트로크처럼 그들을 때려 두 섬모로 수영합니다 5. 섬모 운동은 마이너스 엔드 지향 미세 소관 기반 모터 단백질 6,7 인 dynein에 의해 구동됩니다. 섬모 다이닌은 바깥쪽 팔 다이닌과 안쪽 팔 다이네인으로 분류 할 수 있습니다. 각 종류의 다이닌이 결여된 돌연변이체는 서로 다른 운동성 이상을 갖는 느린 수영 돌연변이체로서 단리되었다. 이들 돌연변이체의 상세한 시험관내 운동성 분석은 상당히 진보된 다인 연구8을 갖는다.
탈embranated C. reinhardtii 세포 (세포 모델)의 시험관내 재활성화 실험이 확립 된 이래로이 방법 및 그의 유도체를 활용하여 많은 중요한 발견이 달성되었습니다. 일련의 Ca2+ 완충제에서 세포 모델의 재활성화는, 예를 들어,2개의 섬모가 서브마이크로몰Ca2+에 의해 상이하게 조절된다는 것을 9개 보여주었고, 이러한 비대칭 섬모 조절은 C. 라인하르티이10의 광전술적 배향을 가능하게 한다. 또한, 두 섬모는 순방향 수영 모드 (비대칭 파형이라고 함)에서 후진 수영 모드 (세포가 광압 또는 메카노 충격을받을 때 짧은 기간 동안 나타나는 대칭 파형이라고 함)11,12로 파형 변환을 보여줍니다. 이러한 파형 변환은 아밀리몰Ca2+에 의해 조절되며, 이는 소위 핵편모성 장치(2개의 섬모, 기저체, 기저체와 핵을 연결하는 구조, 및 핵의 잔재를 포함하는 복합체)11 또는 분리된 섬모(13)의 탈embranated 축삭체의 재활성화에 의해 나타났다. Ca2+ 이외에, 산화환원(reduction-oxidation) 포이즈는 섬모 박동 빈도를 조절하는 신호이며, 이는 환원된 글루타티온 대 산화된 글루타티온14의 상이한 비율을 함유하는 산화환원 완충제에서 세포 모델의 재활성화에 의해 나타났다. 또한, 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP)는 두 개의 섬모를 비대칭적으로 조절하며, 이는 광절단가능한 캐싱된 cAMP15를 사용한 액소네메스의 재활성화에 의해 나타났다. 이러한 시험관 내 발견은 유전 적 발견과 결합하여 C. reinhardtii에서 섬모 조절의 분자 메커니즘에 대한 더 깊은 이해를 이끌어 냈습니다.
세포 모델을 재활성화하기 위한 프로토콜이 여기에 기술되어 있다. 이 방법은 간단하고, 다양한 변형을 허용하며, 섬모와 함께 움직이는 여러 유기체에 적용될 수 있습니다. 그러나, 탈취된 세포는 깨지기 쉽기 때문에, 붕괴를 방지하면서 좋은 효율로 세포 모델의 운동성을 재활성화하기 위한 몇 가지 팁이 필요하다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL plastic tube</td>
			<td>QSP</td>
			<td>502-PLN-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sima-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>KUBOTA</td>
			<td>2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas strain CC-125</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td></td>
			<td>https://www.chlamycollection.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CK-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CRPHO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEDTA(EGTA)</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>G002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>GB70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>21002-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, Mr 20,000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18897.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>28434-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii

Szent-Györgyi가 20 세기 중반에 입증 한 ATP를 추가하여 글리세린 화 된 근육의 수축에 대한 역사적인 실험 이후, 탈embranated 세포의 시험관 내 재활성화는 세포 운동성을 조사하는 전통적이고 강력한 방법이었습니다. 이 실험 방법의 근본적인 이점은 재활성화 용액의 조성이 쉽게 변경될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 생체 내에서 막 여기로 인해 일시적으로 발생하는 높은Ca2+ 농도 환경은 실험실에서 복제될 수 있다. 진핵 섬모 (일명 편모)는 규제 메커니즘이 여전히 명확 해져야하는 정교한 운동성 기계입니다. 단세포 녹색 alga Chlamydomonas reinhardtii는 섬모의 연구 분야에서 우수한 모델 유기체입니다. C. reinhardtii의 탈embranated 세포 모델과 단리된 섬모의 탈입된 축삭과 같은 이들의 유도체를 사용한 재활성화 실험은 섬모 운동성의 분자 메커니즘을 이해하는 데 크게 기여하였다. 이러한 실험은 ATP가 섬모 운동성에 활력을 불어 넣고Ca2+, cAMP 및 반응성 산소 종을 포함한 다양한 세포 신호가 섬모 운동을 조절한다는 것을 분명히했습니다. C. reinhardtii 세포의 탈형 및 세포 모델의 재활성화를 위한 정확한 방법이 여기에 기술되어 있다.

C. 라인하르티이 야생형 균주(CC-125)에서의 탈종 및 재활성화 과정이 여기에 도시되어 있다. 접종 2일 후 배양물은 연한 녹색이 되었다(단계 1.1). 세포를 수집하고(단계 2.1), 세척하고(단계 2.2), 탈형하였다(단계 2.5). 탈메탄화 후, 모든 세포 모델은 움직이지 않게 되었다(단계 2.7). 탈embranated 섬모 (axonemes라고 함)는 세포 몸체에 부착 된 채로 남아 있으며, 이는 세포 모델?...

Watch this Scientific Journal Video about Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

운동성 세포의 시험관내 재활성화는 세포 운동성의 메카니즘을 이해하는 데 있어서 중요한 실험이다. 이 프로토콜은 실리아 / 편모를 연구하는 모델 유기체 인 Chlamydomonas reinhardtii의 탈상 된 세포 모델을 다시 활성화하는 것을 설명합니다.

클라미도모나스 라인하르티이에서 파괴된 세포 모델의 재활성화

Since the historical experiment on the contraction of glycerinated muscle by adding ATP, which Szent-Gy&#246;rgyi demonstrated in the mid-20th century, in ...

이 방법은 어떤 요인이 섬모 운동성에 영향을 미치는지 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 생체 내에서만 일시적으로 발생하는 현상, 섬모에서의 칼슘 이온 농도의 이러한 반전이 시험관 내에서 지속적으로 관찰될 수 있다는 것이다. 이 방법은 특히 motile cilia의 연구 분야에 기여합니다.초보자가 해체 단계를 수행하는 것은 어려울 것입니다. 따라서 단계를 부드럽지만 정확하게 수행하는 것이 좋습니다. 약 10 밀리리터의 클라미도모나스 라인하르티이 배양물을 섭씨 20도에서 1, 000 RCF에서 3분 동안 원심분리하여 시작한다.상청액을 장식하고 파스퇴르 피펫으로 남은 자를 흡인합니다. 침전물을 약 다섯 밀리리터의 세척 완충액에 재현탁시킨다. 세포를 섭씨 20도에서 3분 동안 1, 000 RCF에서 세척 완충액 중의 원심분리한다.피펫으로 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 약 0.5 밀리리터의 탈형 완충액을 세포 펠릿에 첨가한다. 튜브를 부드럽게 흔들어 세포를 완충액에 대충 매달아 놓은 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다.나머지 세포 펠릿을 피펫으로 부드럽게 현탁시키고 튜브를 다시 얼음 위에 놓습니다. 세포 모델의 5 내지 10 마이크로리터를 취하고, 희석 완충액으로 10배를 희석하고, 현미경으로 관찰하여 모든 세포 모델이 탈embranated되고 수영되지 않는지 확인한다. 0.5 밀리리터 튜브에서 튜브를 탭하여 80 마이크로리터의 재활성화 용액, 10 마이크로리터의 ATP 용액 및 10 마이크로리터의 세포 모델을 혼합한다.약 30 마이크로리터의 혼합 용액을 유리 슬라이드에 놓고 스페이서로 커버 슬립을 부드럽게 올려 세포 모델에 기계적 충격을 주지 않도록 합니다. 재활성화된 세포 모델을 현미경으로 관찰한다. C.reinhardtii 배양물의 탈취 후, 모든 세포 모델은 움직이지 않게되었고, 탈취 된 섬모는 세포 몸체에 부착 된 채로 남아있어 세포 모델의 운동성이 탈섬모에 의해 유발되지 않았 음을 확인했다.세포 모델을 ATP의 재활성화 완충액과 혼합한 후, 세포 모델의 50% 이상이 운동성으로 되었다. ATP 재생 시스템이 없더라도, 재활성화된 세포는 점진적으로 정지하기 전에 한 밀리몰의 최종 ATP 농도로 대략 90분 동안 계속 이동하였다. 해체 단계는 매우 중요합니다.모든 세포는 수영을 멈춰야하지만, 너무 강하게 혼합되어 섬모가 일어나서는 안됩니다. 연구원은 칼슘 이온 또는 고리형 AMP와 같은 시약을 포함하도록 이 프로토콜을 수정하거나 특정 단백질이 결여된 돌연변이체에 대한 실험을 수행하여 생물학적 역할을 확인할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

번식과 Tetrad 분리 Chlamydomonas reinhardtii 유전자 분석을위한

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

연구

생물학

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Obliterative 에어웨이 질환의 발전을 연구하는 모델로 사용 마우스의 Heterotopic 및 Orthotopic Tracheal 이식

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

뉴 외과 의사에 대한 쥐 외과의 원칙

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats

수동 규제와 마우스 및 쥐 일반적인 합성 관리 경로

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research.  Working confidently and humanely with mice and ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

마우스 모델에서 유선 개발 및 기능 평가

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

진단 검시와 고양이와 마우스의 선택 조직 및 샘플 수집

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

스테로이드 수용체의 생화 학적 리간드의 Reconstitution • Hsp90 단백질 단지와 재가입 바인딩

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models

Culturing 및 벽면 선박 생물 반응기를 회전의 응용은 3D 상피 세포 모델을 유래

Cells and tissues in the body experience environmental conditions that influence their architecture, intercellular communications, and overall functions. ...