Name: reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

Denne studien ble støttet av tilskudd fra Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) til N.U. (19K23758, 21K06295) og K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), fra Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) til K.W., og fra Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) til N.U. og K.W. Vi takker Ms. Miyuki Shinohara (Hosei Univ.) for hennes hjelp til å forberede tallene.

En villstamme av Chlamydomonas reinhardtii, CC-125, ble brukt til den nåværende studien. CC-125 ble hentet fra Chlamydomonas Resource Center (se Materialfortegnelser) og vedlikeholdt på et Tris-acetatfosfat (TAP)16, 1,5% agarose medium ved 20-25 °C.
1. Cellekultur
<ol><li>Kultur Chlamydomonas reinhardtii (CC-125) i TAP medium16 i en 12 t/12 t lys-mørk periode (lysforhold for lysperioden: ...

<ol>
	<li>Szent-Gyorgyi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-energy+relations+and+contraction+of+actomyosin.">Free-energy relations and contraction of actomyosin.</a> Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).</li><li>Hoffman-Berling, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosintriphosphat+als+betriebsstoff+von+zellbewegungen.">Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).</li><li>Naitoh, Y., Kaneko, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivated+Triton-extracted+models+of+Paramecium:+modification+of+ciliary+movement+by+calcium+ions.">Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions.</a> Science. 176 (4034), 523-524 (1972).</li><li>Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+flagellar+mutants+lacking+radial+spokes+and+central+tubules.+Structure,+composition,+and+function+of+specific+axonemal+components.">Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components.</a> Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).</li><li>R&#252;ffer, U., Nultsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+coordination+in+Chlamydomonas+cells+held+on+micropipettes.">Flagellar coordination in Chlamydomonas cells held on micropipettes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 41 (4), 297-307 (1998).</li><li>Sale, W. S., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+active+sliding+of+microtubules+in+Tetrahymena+cilia.">Direction of active sliding of microtubules in Tetrahymena cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (5), 2045-2049 (1977).</li><li>Fox, L. A., Sale, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+force+generated+by+the+inner+row+of+dynein+arms+on+flagellar+microtubules.">Direction of force generated by the inner row of dynein arms on flagellar microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 105 (4), 1781-1787 (1987).</li><li>Kamiya, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+assessed+by+in+vitro+and+in+vivo+motility+assays+of+Chlamydomonas+mutants.">Functional diversity of axonemal dyneins as assessed by in vitro and in vivo motility assays of Chlamydomonas mutants.</a> Zoolog Science. 31 (10), 633-644 (2014).</li><li>Kamiya, R., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicromolar+levels+of+calcium+control+the+balance+of+beating+between+the+two+flagella+in+demembranated+models+of+Chlamydomonas.">Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).</li><li>Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototactic+activity+in+Chlamydomonas+'non-phototactic'+mutants+deficient+in+Ca2+-dependent+control+of+flagellar+dominance+or+in+inner-arm+dynein.">Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein.</a> Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).</li><li>Hyams, J. S., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+flagellar+apparatus+of+Chlamydomonas:+characterization+of+forward+swimming+and+alteration+of+waveform+and+reversal+of+motion+by+calcium+ions+in+vitro.">Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro.</a> Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).</li><li>Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+CAV2+encodes+a+voltage-+dependent+calcium+channel+required+for+the+flagellar+waveform+conversion.">Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion.</a> Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).</li><li>Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+control+of+waveform+in+isolated+flagellar+axonemes+of+Chlamydomonas.">Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).</li><li>Wakabayashi, K., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+flagellar+motility+by+redox+poise.">Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise.</a> Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).</li><li>Saegusa, Y., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+controls+the+balance+of+the+propulsive+forces+generated+by+the+two+flagella+of+Chlamydomonas.">cAMP controls the balance of the propulsive forces generated by the two flagella of Chlamydomonas.</a> Cytoskeleton. 72 (8), 412-421 (2015).</li><li>Gorman, D. S., Levine, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+f+and+plastocyanin:+their+sequence+in+the+photosynthetic+electron+transport+chain+of+Chlamydomonas+reinhardi.">Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).</li><li>Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+estimation+of+cytosolic+ATP+concentration+from+the+ciliary+beating+frequency+in+the+green+alga+Chlamydomonas+reinhardtii.">Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).</li><li>Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+waveform+conversion+in+the+flagellar+axoneme+of+Chlamydomonas+mutants+lacking+the+central-pair/radial+spoke+system.">Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).</li><li>Yueh, Y. G., Crain, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deflagellation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+follows+a+rapid+transitory+accumulation+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+requires+Ca2++entry.">Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry.</a> Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).</li><li>Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+flagellar+motility+activation+in+Chlamydomonas+reinhardtii+in+response+to+mechanical+agitation.">Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).</li><li>Ueki, N., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-extracted+Volvox+model+exhibits+an+anterior-posterior+gradient+in+flagellar+Ca2.">Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1061-1068 (2018).</li><li>Tanno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four-celled+Volvocales+green+alga+Tetrabaena+socialis+exhibits+weak+photobehavior+and+high-photoprotection+ability.">The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability.</a> PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).</li></ol>

Det er to kritiske trinn i denne protokollen. Den første er en prosess kjent som demembranering, som må utføres forsiktig, men grundig. Desilitering (dvs. løsrivelse av cilia fra cellekroppen) induseres ved kraftig pipettering eller virveling, noe som gjør cellemodellene immobile selv etter tilsetning av ATP. Vanligvis er 5 × 107 celler suspendert i ~ 0,5 ml demembraneringsbuffer (endelig celletetthet: 1 × 108 celler / ml). Reaktiveringshastigheten til cellemodellene vil reduseres hvis cellem...

In vitro reaktivering av demembranerte motile celler er et verdifullt verktøy for å studere molekylært grunnlag for reguleringsmekanismen for cellemotilitet. Szent-Györgyi viste først in vitro sammentrekning av kanin skjelettmuskulaturfibre ekstrahert med 50% glyserol ved å legge til adenosin triphosfat (ATP)1. Dette eksperimentet var det første som beviste at ATP energizes muskel sammentrekning. Metodikken ble snart brukt på studiet av ATP-energisk ciliary / flagellar motility, som sperm flagella2, Paramecium cilia3, og Chlamydomonas reinhardtii cilia (også kalt flagella)4 ved hjelp av ikke-ionic vaskemidler for demembranering.
Den unicellular grønne algen C. reinhardtii er en modellorganisme for å studere cilia: den svømmer med to cilia ved å slå dem som et menneskes brystslag5. Ciliary bevegelse er drevet av dynein, en minus-end rettet mikrotubule-basert motorprotein 6,7. Ciliary dyneins kan klassifiseres i ytre armdyneiner og indre armdyneliner. Mutanter som mangler hver type dynein har blitt isolert som sakte svømmende mutanter med forskjellige motilitetsavvik. Detaljert in vitro motility analyse av disse mutantene har betydelig avansert dynein forskning8.
Mange viktige funn har blitt oppnådd ved hjelp av denne metoden og dens derivater siden in vitro reaktiveringseksperimentet av demembranerte C. reinhardtiiceller (cellemodeller) ble etablert. Reaktivering av cellemodeller i en serie med Ca2+ buffere, for eksempel, viste9 at to cilia er forskjellig regulert av submicromolar Ca2+, og denne asymmetriske cilia-kontrollen muliggjør fototaktisk orientering av C. reinhardtii10. Videre viser begge cilia bølgeformkonvertering fra fremoversvømmingsmodus (kalt asymmetrisk bølgeform) til bakoversvømmingsmodus (kalt symmetrisk bølgeform som vises i en kort periode når cellene er foto- eller mekano-sjokkerte)11,12. Denne bølgeformkonverteringen er regulert av submillimolar Ca2+, som ble vist ved reaktivering av det såkalte nukleoflagellarapparatet (et kompleks som inneholder to cilia, basale legemer, strukturene som forbinder basale legemer med kjernen, og restene av kjernen)11 eller demembranerte axoner av isolert cilia13. Annet enn Ca2+, er redoks (reduksjonsoksidasjon) poise et signal som regulerer ciliary slåfrekvensen, som ble vist ved reaktivering av cellemodeller i redoksbuffere som inneholder forskjellige forhold mellom redusert glutathione vs. oksidert glutathione14. I tillegg regulerer syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) asymmetrisk to cilia, som ble vist ved reaktivering av axoner med fotokleavable bur cAMP15. Disse in vitro funnene, kombinert med genetiske funn, har ført til en dypere forståelse av molekylære mekanismer for cilia regulering i C. reinhardtii.
En protokoll for reaktivering av cellemodellene er beskrevet her. Metoden er enkel, tillater ulike modifikasjoner, og kan brukes på flere organismer som beveger seg med cilia. Men fordi demembranerte celler er skjøre, krever det noen tips for å reaktivere motiliteten til cellemodeller med god effektivitet samtidig som dedikasjon forhindres.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL plastic tube</td>
			<td>QSP</td>
			<td>502-PLN-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sima-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>KUBOTA</td>
			<td>2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas strain CC-125</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td></td>
			<td>https://www.chlamycollection.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CK-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CRPHO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEDTA(EGTA)</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>G002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>GB70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>21002-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, Mr 20,000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18897.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>28434-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii

Siden det historiske eksperimentet på sammentrekningen av glyserinerte muskler ved å legge til ATP, som Szent-Györgyi demonstrerte på midten av 1900-tallet, har in vitro reaktivering av demembranerte celler vært en tradisjonell og potent måte å undersøke cellemotilitet på. Den grunnleggende fordelen med denne eksperimentelle metoden er at sammensetningen av reaktiveringsløsningen lett kan endres. For eksempel kan et høy-Ca2 + konsentrasjonsmiljø som bare oppstår midlertidig på grunn av membraneksitasjon in vivo , replikeres i laboratoriet. Eukaryotisk cilia (også kjent som flagella) er forseggjorte motilitetsmaskiner hvis regulatoriske mekanismer fortsatt skal avklares. Den unicellular grønne alge Chlamydomonas reinhardtii er en utmerket modellorganisme innen ciliaforskning. Reaktiveringseksperimentene ved hjelp av demembranerte cellemodeller av C. reinhardtii og deres derivater, som demembranerte axoner av isolert cilia, har bidratt betydelig til å forstå de molekylære mekanismene for ciliary motility. Disse eksperimentene presiserte at ATP energizes ciliary motility og at ulike cellulære signaler, inkludert Ca2 +, cAMP, og reaktive oksygenarter, modulerer ciliary bevegelser. Den nøyaktige metoden for demembranering av C. reinhardtii celler og reaktivering av cellemodellene er beskrevet her.

Demembranerings- og reaktiveringsprosessen i C. reinhardtii wild type stamme (CC-125) er vist her. Kulturen 2 dager etter inokulering ble en lysegrønn farge (trinn 1.1) (figur 1). Celler ble samlet inn (trinn 2.1), vasket (trinn 2.2) og demembranert (trinn 2.5). Etter demembranering ble alle cellemodeller immotile (trinn 2.7). Den demembranerte ciliaen (kalt axonemes) forblir festet til cellekroppen, noe som viser at umotligheten til cellemodellene ikke er forårsaket av desiliter...

Watch this Scientific Journal Video about Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

In vitro reaktivering av motile celler er et avgjørende eksperiment for å forstå mekanismene for cellemotilitet. Protokollen beskriver reaktivering av de demembranerte cellemodellene til Chlamydomonas reinhardtii, en modellorganisme for å studere cilia/flagella.

Reaktivering av demembranerte cellemodeller i Chlamydomonas reinhardtii

Since the historical experiment on the contraction of glycerinated muscle by adding ATP, which Szent-Gy&#246;rgyi demonstrated in the mid-20th century, in ...

Denne metoden kan bidra til å forstå hvilke faktorer som påvirker ciliamotilitet. Den største fordelen med denne teknikken er at fenomenene som bare forekommer midlertidig in vivo, slik inversjon av kalsiumionkonsentrasjoner i cilia kan observeres kontinuerlig in vitro. Denne metoden bidrar spesielt til forskningsfeltet motil cilia.Det ville være vanskelig for nybegynnere å utføre demembranasjonstrinnet. Derfor anbefales det sterkt å utføre trinnene forsiktig, men presist. Begynn med å sentrifugere ca 10 milliliter Chlamydomonas reinhardtii kultur ved 1000 RCF ved 20 grader Celsius i tre minutter.Dekanter den supernatante og aspirer resten av en Pasteur pipette. Resuspend utfellingene i omtrent fem milliliter vaskebuffer. Sentrifuger celler i vaskebufferen ved 1000 RCF i tre minutter ved 20 grader Celsius.Kast supernatanten forsiktig med en pipette. Tilsett ca. 0,5 milliliter demembraneringsbuffer i cellepelleten. Rist røret forsiktig for å grovt suspendere cellene i bufferen, og legg deretter røret på is.Suspender den gjenværende cellepelleten forsiktig med en pipette og legg røret på isen igjen. Ta 5 til 10 mikroliter av cellemodellen, fortynn ti ganger med fortynningsbufferen, og observer under mikroskopet for å bekrefte at alle cellemodellene er demembranert og ikke svømmer. Bland 80 mikroliter reaktiveringsløsning, 10 mikroliter ATP-oppløsning og 10 mikroliter cellemodeller i et rør på 0,5 milliliter ved å trykke på røret.Sett omtrent 30 mikroliter av den blandede løsningen på en glasssklie og legg forsiktig en dekselglidning på den med avstandsstykker for å unngå mekanisk støt på cellemodellen. Vær oppmerksom på de reaktiverte cellemodellene under et mikroskop. Etter demembranering av C.reinhardtii-kulturen ble alle cellemodeller immotile og den demembranerte cilia forble festet til cellekroppen, og bekreftet at immotility av cellemodellene ikke var forårsaket av de-ciliation.Etter å ha blandet cellemodellene med reaktiveringsbufferen i ATP, ble mer enn 50% av cellemodellene motile. Selv uten ATP-regenereringssystemet fortsatte de reaktiverte cellene å bevege seg i omtrent 90 minutter med en endelig ATP-konsentrasjon på en millimolar før de gradvis stoppet. Demembranasjonstrinnet er kritisk.Alle cellene skal slutte å svømme, men de bør ikke blandes så sterkt at de-ciliation oppstår. Forskere kan endre denne protokollen til å inkludere reagenser som kalsiumioner eller syklisk AMP, eller utføre eksperimenter med en mutant som mangler et bestemt protein for å identifisere deres biologiske rolle.

Research

JoVE Journal

Biology

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats

Manuell Restraint og Common Compound Administrasjon Ruter i mus og rotter

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research.  Working confidently and humanely with mice and ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mus Sperm Kryokonservering og Recovery bruke I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models

Dyrking og bruk av roterende Wall Vessel bioreaktor Avledet 3D Epiteliale Cellemodeller

Cells and tissues in the body experience environmental conditions that influence their architecture, intercellular communications, and overall functions. ...