Name: reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
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Este estudo foi apoiado por subsídios da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) para a ONU (19K23758, 21K06295) e K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), da Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) à K.W., e da Aliança Dinâmica para Inovação Aberta conectando Humanos, Ambientais e Materiais (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) para a N.U. e K.W. Agradecemos à Sra. Miyuki Shinohara (Hosei Univ.) por sua ajuda na preparação dos números.

Uma cepa selvagem de Chlamydomonas reinhardtii, CC-125, foi utilizada para o presente estudo. O CC-125 foi obtido do Centro de Recursos clamídias (ver Tabela de Materiais) e mantido em um tris-acetato-fosfato (TAP)16, 1,5% médio agarose a 20-25 °C.
1. Cultura celular
<ol><li>Cultura Chlamydomonas reinhardtii (CC-125) em tap médio16 em um período claro-escuro de 12 h/12 h (condições de l...

<ol>
	<li>Szent-Gyorgyi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-energy+relations+and+contraction+of+actomyosin.">Free-energy relations and contraction of actomyosin.</a> Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).</li><li>Hoffman-Berling, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosintriphosphat+als+betriebsstoff+von+zellbewegungen.">Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).</li><li>Naitoh, Y., Kaneko, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivated+Triton-extracted+models+of+Paramecium:+modification+of+ciliary+movement+by+calcium+ions.">Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions.</a> Science. 176 (4034), 523-524 (1972).</li><li>Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+flagellar+mutants+lacking+radial+spokes+and+central+tubules.+Structure,+composition,+and+function+of+specific+axonemal+components.">Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components.</a> Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).</li><li>R&#252;ffer, U., Nultsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+coordination+in+Chlamydomonas+cells+held+on+micropipettes.">Flagellar coordination in Chlamydomonas cells held on micropipettes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 41 (4), 297-307 (1998).</li><li>Sale, W. S., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+active+sliding+of+microtubules+in+Tetrahymena+cilia.">Direction of active sliding of microtubules in Tetrahymena cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (5), 2045-2049 (1977).</li><li>Fox, L. A., Sale, W. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicromolar+levels+of+calcium+control+the+balance+of+beating+between+the+two+flagella+in+demembranated+models+of+Chlamydomonas.">Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).</li><li>Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototactic+activity+in+Chlamydomonas+'non-phototactic'+mutants+deficient+in+Ca2+-dependent+control+of+flagellar+dominance+or+in+inner-arm+dynein.">Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein.</a> Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).</li><li>Hyams, J. S., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+flagellar+apparatus+of+Chlamydomonas:+characterization+of+forward+swimming+and+alteration+of+waveform+and+reversal+of+motion+by+calcium+ions+in+vitro.">Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro.</a> Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).</li><li>Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+CAV2+encodes+a+voltage-+dependent+calcium+channel+required+for+the+flagellar+waveform+conversion.">Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion.</a> Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).</li><li>Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+control+of+waveform+in+isolated+flagellar+axonemes+of+Chlamydomonas.">Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).</li><li>Wakabayashi, K., King, S. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+f+and+plastocyanin:+their+sequence+in+the+photosynthetic+electron+transport+chain+of+Chlamydomonas+reinhardi.">Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).</li><li>Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+estimation+of+cytosolic+ATP+concentration+from+the+ciliary+beating+frequency+in+the+green+alga+Chlamydomonas+reinhardtii.">Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).</li><li>Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+waveform+conversion+in+the+flagellar+axoneme+of+Chlamydomonas+mutants+lacking+the+central-pair/radial+spoke+system.">Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).</li><li>Yueh, Y. G., Crain, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deflagellation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+follows+a+rapid+transitory+accumulation+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+requires+Ca2++entry.">Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry.</a> Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).</li><li>Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+flagellar+motility+activation+in+Chlamydomonas+reinhardtii+in+response+to+mechanical+agitation.">Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).</li><li>Ueki, N., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-extracted+Volvox+model+exhibits+an+anterior-posterior+gradient+in+flagellar+Ca2.">Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1061-1068 (2018).</li><li>Tanno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four-celled+Volvocales+green+alga+Tetrabaena+socialis+exhibits+weak+photobehavior+and+high-photoprotection+ability.">The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability.</a> PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).</li></ol>

Há dois passos críticos neste protocolo. O primeiro é um processo conhecido como demembranation, que precisa ser realizado suavemente, mas minuciosamente. A deciliação (ou seja, o descolamento de cílios do corpo celular) é induzida por tubulação vigorosa ou vórtice, tornando os modelos celulares imóveis mesmo após a adição de ATP. Normalmente, 5 × 107 células estão suspensas em ~0,5 mL de tampão de demembranação (densidade celular final: 1 × 108 células/mL). A taxa de reativaç...

A reativação in vitro de células motil desmembradas é uma ferramenta valiosa para estudar a base molecular para o mecanismo regulatório da motilidade celular. Szent-Györgyi demonstrou pela primeira vez contração in vitro de fibras musculares esqueléticas de coelho extraídas com 50% de glicerol adicionando adenosina triphosfato (ATP)1. Este experimento foi o primeiro a provar que a ATP energiza a contração muscular. A metodologia logo foi aplicada ao estudo da motilidade ciliar/flagellar energizada da ATP, como a flagela2, o Paramecium cilia3 e o Chlamydomonas reinhardtii cilia (também chamado de flagela)4 usando detergentes não iônicos para demembranation.
A alga verde unicelular C. reinhardtii é um organismo modelo para estudar cílios: nada com duas cílios batendo-as como um nado de peito5 humano. O movimento ciliar é impulsionado por dynein, uma proteína motor baseada em microtúbulo sem fim 6,7. Dyneins ciliares podem ser classificados em dyneins de braço externo e dyneins de braço interno. Mutantes sem cada tipo de dynein foram isolados como mutantes de natação lenta com diferentes anormalidades de motilidade. Análise detalhada de motilidade in vitro desses mutantes tem avançado significativamente a pesquisa de dynein8.
Muitos achados importantes foram alcançados utilizando este método e seus derivados desde que o experimento de reativação in vitro de células C. reinhardtii (modelos celulares) foi estabelecido. A reativação de modelos celulares em uma série de buffers Ca2+, por exemplo, mostrou9 que dois cílios são regulados de forma diferente pelo submicromolar Ca2+, e este controle assimétrico de clia permite a orientação fototática de C. reinhardtii10. Além disso, ambos os cilia mostram a conversão de forma de onda do modo de natação para a frente (chamado de forma de onda assimétrica) para o modo de natação para trás (chamado de forma de onda simétrica que aparece por um curto período quando as células estão foto ou mecano-chocadas)11,12. Essa conversão de forma de onda é regulada pelo submillimolar Ca2+, que foi demonstrado pela reativação do chamado aparelho nucleoflagelar (complexo contendo dois cílios, os corpos basais, as estruturas que ligam os corpos basais ao núcleo, e o remanescente do núcleo)11 ou axonemes de cílias isoladas13. Além do Ca2+, a postura de redox (redução-oxidação) é um sinal que regula a frequência de batida ciliar, que foi demonstrada pela reativação de modelos celulares em buffers de redox contendo diferentes razões de glutathione reduzida versus glutationaoxidada 14. Além disso, o monofosfato de adenosina cíclica (cAMP) regula assimétricamente dois cílios, o que foi mostrado pela reativação de axonemes com cAMP15 enjaular fotocleásable. Esses achados in vitro, combinados com achados genéticos, levaram a uma compreensão mais profunda dos mecanismos moleculares da regulação da clia em C. reinhardtii.
Um protocolo para reativar os modelos de células é descrito aqui. O método é simples, permite várias modificações, e pode ser aplicado a múltiplos organismos que se movem com cílios. No entanto, como as células demembraadas são frágeis, é preciso algumas dicas para reativar a motilidade dos modelos celulares com boa eficiência, evitando a dissociação.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL plastic tube</td>
			<td>QSP</td>
			<td>502-PLN-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sima-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>KUBOTA</td>
			<td>2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas strain CC-125</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td></td>
			<td>https://www.chlamycollection.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CK-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CRPHO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEDTA(EGTA)</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>G002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>GB70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>21002-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, Mr 20,000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18897.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>28434-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii

Desde o experimento histórico sobre a contração de músculo glicerinado adicionando ATP, que Szent-Györgyi demonstrou em meados do século XX, a reativação in vitro de células demembradas tem sido uma maneira tradicional e potente de examinar a motilidade celular. A vantagem fundamental deste método experimental é que a composição da solução de reativação pode ser facilmente alterada. Por exemplo, um ambiente de concentração de alta Ca2+ que ocorre apenas temporariamente devido à excitação da membrana in vivo pode ser replicado em laboratório. A cilia eucariótica (também conhecida como flagella) são máquinas de motilidade elaboradas cujos mecanismos regulatórios ainda devem ser esclarecidos. A alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii é um excelente organismo modelo no campo de pesquisa da cília. Os experimentos de reativação utilizando modelos celulares demembrados de C. reinhardtii e seus derivados, como axonemes desmembraados de cílios isolados, contribuíram significativamente para a compreensão dos mecanismos moleculares da motilidade ciliar. Esses experimentos esclareceram que a ATP energiza a motilidade ciliar e que vários sinais celulares, incluindo ca2+, cAMP e espécies reativas de oxigênio, modulam movimentos ciliares. O método preciso para desmembranação de células C. reinhardtii e reativação dos modelos celulares é descrito aqui.

O processo de demembranação e reativação em C. reinhardtii tipo de cepa selvagem (CC-125) é mostrado aqui. A cultura 2 dias após a inoculação tornou-se uma cor verde clara (passo 1.1) (Figura 1). Foram coletadas células (etapa 2.1), lavadas (etapa 2.2) e desmembradas (etapa 2.5). Após a desmembranação, todos os modelos celulares tornaram-se immotile (passo 2.7). Os cilias demembradas (chamados axonemes) permanecem ligados ao corpo celular, o que mostra que a imotilidade...

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Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

A reativação in vitro de células motil é um experimento crucial na compreensão dos mecanismos da motilidade celular. O protocolo descreve a reativação dos modelos de células demembradas de Chlamydomonas reinhardtii, um organismo modelo para estudar cílio/flagela.

Reativação de Modelos celulares desmembrados em Chlamydomonas reinhardtii

Since the historical experiment on the contraction of glycerinated muscle by adding ATP, which Szent-Gy&#246;rgyi demonstrated in the mid-20th century, in ...

Este método pode ajudar a entender quais fatores afetam a mobilidade cilia. A principal vantagem dessa técnica é que os fenômenos que ocorrem apenas temporariamente in vivo, tais inversão de concentrações de íons de cálcio em cílios podem ser continuamente observados in vitro. Este método contribui especificamente para o campo de pesquisa da cílio motile.Seria difícil para os iniciantes realizarem o passo de desmembranação. Por isso, é altamente recomendável realizar as etapas suavemente, mas com precisão. Comece por centrifugar aproximadamente 10 mililitros de cultura Chlamydomonas reinhardtii a 1.000 RCF a 20 graus Celsius por três minutos.Decante o supernatante e aspire o remanescente por uma pipeta Pasteur. Resuspenda os precipitados em aproximadamente cinco mililitros de tampão de lavagem. Células centrífugas no tampão de lavagem a 1.000 RCF por três minutos a 20 graus Celsius.Descarte o supernatante cuidadosamente com uma pipeta. Adicione aproximadamente 0,5 mililitros de tampão de demembranação à pelota celular. Agite o tubo suavemente para suspender as células do buffer e, em seguida, coloque o tubo no gelo.Suspenda a pelota de célula restante suavemente com uma pipeta e coloque o tubo no gelo novamente. Pegue de 5 a 10 microlitros do modelo celular, diluir dez vezes com o tampão de diluição e observar sob o microscópio para confirmar que todos os modelos celulares estão desmembraados e não nadando. Em um tubo de 0,5 mililitro, misture 80 microliters de solução de reativação, 10 microliters de solução ATP e 10 microliters de modelos celulares tocando no tubo.Coloque aproximadamente 30 microlitros da solução mista em um escorregador de vidro e coloque delicadamente um deslizamento de tampa sobre ele com espaçadores para evitar um choque mecânico no modelo celular. Observe os modelos celulares reativados sob um microscópio. Após a desmembranação da cultura C.reinhardtii, todos os modelos celulares tornaram-se imotile e a ília demembraada permaneceu presa ao corpo celular, confirmando que a imotilidade dos modelos celulares não foi causada pela desliação.Depois de misturar os modelos celulares com o tampão de reativação em ATP, mais de 50% dos modelos de células tornaram-se motile. Mesmo sem o sistema de regeneração ATP, as células reativadas continuaram a se mover por aproximadamente 90 minutos com uma concentração final de ATP de um mililitro antes de parar gradualmente. O passo de demembranation é crítico.Todas as células devem parar de nadar, mas não devem ser misturadas tão fortemente que ocorre a desciliação. Os pesquisadores podem modificar este protocolo para incluir reagentes como íons de cálcio ou AMP cíclico, ou realizar experimentos com um mutante sem uma proteína específica para identificar seu papel biológico.

Research

JoVE Journal

Biology

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

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