Name: reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
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Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) a N.U. (19K23758, 21K06295) y K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), de la Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) a K.W., y de la Alianza Dinámica para la Innovación Abierta Uniendo Humanos, Medio Ambiente y Materiales (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) a N.U. y K.W. Agradecemos a la Sra. Miyuki Shinohara (Hosei Univ.) por su ayuda en la preparación de las cifras.

Para el presente estudio se utilizó una cepa de tipo salvaje de Chlamydomonas reinhardtii, CC-125. CC-125 se obtuvo del Centro de Recursos de Chlamydomonas (ver Tabla de Materiales) y se mantuvo en un medio de Tris-acetato-fosfato (TAP)16, 1.5% agarosa a 20-25 °C.
1. Cultivo celular
<ol><li>Cultivo de Chlamydomonas reinhardtii (CC-125) en el medio TAP16 en un período de luz-oscuridad de 12 ...

<ol>
	<li>Szent-Gyorgyi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-energy+relations+and+contraction+of+actomyosin.">Free-energy relations and contraction of actomyosin.</a> Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).</li><li>Hoffman-Berling, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosintriphosphat+als+betriebsstoff+von+zellbewegungen.">Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).</li><li>Naitoh, Y., Kaneko, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivated+Triton-extracted+models+of+Paramecium:+modification+of+ciliary+movement+by+calcium+ions.">Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions.</a> Science. 176 (4034), 523-524 (1972).</li><li>Witman, G. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicromolar+levels+of+calcium+control+the+balance+of+beating+between+the+two+flagella+in+demembranated+models+of+Chlamydomonas.">Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).</li><li>Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototactic+activity+in+Chlamydomonas+'non-phototactic'+mutants+deficient+in+Ca2+-dependent+control+of+flagellar+dominance+or+in+inner-arm+dynein.">Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein.</a> Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).</li><li>Hyams, J. S., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+flagellar+apparatus+of+Chlamydomonas:+characterization+of+forward+swimming+and+alteration+of+waveform+and+reversal+of+motion+by+calcium+ions+in+vitro.">Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro.</a> Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).</li><li>Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+CAV2+encodes+a+voltage-+dependent+calcium+channel+required+for+the+flagellar+waveform+conversion.">Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion.</a> Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).</li><li>Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+control+of+waveform+in+isolated+flagellar+axonemes+of+Chlamydomonas.">Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).</li><li>Wakabayashi, K., King, S. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+f+and+plastocyanin:+their+sequence+in+the+photosynthetic+electron+transport+chain+of+Chlamydomonas+reinhardi.">Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).</li><li>Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+estimation+of+cytosolic+ATP+concentration+from+the+ciliary+beating+frequency+in+the+green+alga+Chlamydomonas+reinhardtii.">Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).</li><li>Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+waveform+conversion+in+the+flagellar+axoneme+of+Chlamydomonas+mutants+lacking+the+central-pair/radial+spoke+system.">Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).</li><li>Yueh, Y. G., Crain, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deflagellation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+follows+a+rapid+transitory+accumulation+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+requires+Ca2++entry.">Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry.</a> Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).</li><li>Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+flagellar+motility+activation+in+Chlamydomonas+reinhardtii+in+response+to+mechanical+agitation.">Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).</li><li>Ueki, N., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-extracted+Volvox+model+exhibits+an+anterior-posterior+gradient+in+flagellar+Ca2.">Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1061-1068 (2018).</li><li>Tanno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four-celled+Volvocales+green+alga+Tetrabaena+socialis+exhibits+weak+photobehavior+and+high-photoprotection+ability.">The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability.</a> PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).</li></ol>

Hay dos pasos críticos en este protocolo. El primero es un proceso conocido como demembranación, que debe llevarse a cabo de manera suave pero exhaustiva. La deciliación (es decir, la separación de los cilios del cuerpo celular) es inducida por pipeteos vigorosos o vórtices, lo que hace que los modelos celulares queden inmóviles incluso después de la adición de ATP. Típicamente, 5 × 107 células están suspendidas en ~0.5 mL de tampón de demembranación (densidad celular final: 1 × 108 c...

La reactivación in vitro de células móviles desmembranadas es una herramienta valiosa para estudiar las bases moleculares del mecanismo regulador de la motilidad celular. Szent-Györgyi demostró por primera vez la contracción in vitro de las fibras musculares esqueléticas de conejo extraídas con 50% de glicerol mediante la adición de trifosfato de adenosina (ATP)1. Este experimento fue el primero en demostrar que el ATP energiza la contracción muscular. La metodología pronto se aplicó al estudio de la motilidad ciliar/flagelar energizada por ATP, como los flagelos 2 de los espermatozoides, los ciliosde Paramecium 3 y los cilios de Chlamydomonas reinhardtii (también llamados flagelos)4 utilizando detergentes no iónicos para la demembranación.
El alga verde unicelular C. reinhardtii es un organismo modelo para el estudio de los cilios: nada con dos cilios golpeándolos como la braza de un humano5. El movimiento ciliar es impulsado por la dineína, una proteína motora basada en microtúbulos dirigidos de extremo negativo 6,7. Las dineínas ciliares se pueden clasificar en dineínas del brazo externo y dineínas del brazo interno. Los mutantes que carecen de cada tipo de dineína se han aislado como mutantes de natación lenta con diferentes anomalías de motilidad. El análisis detallado de la motilidad in vitro de estos mutantes ha avanzado significativamente en la investigación de la dineína8.
Se han logrado muchos hallazgos importantes utilizando este método y sus derivados desde que se estableció el experimento de reactivación in vitro de células C. reinhardtii desmembranadas (modelos celulares). La reactivación de modelos celulares en una serie de tampones de Ca2+, por ejemplo, mostró9 que dos cilios están regulados de manera diferente por Ca2+ submicromolar, y este control asimétrico de los cilios permite la orientación fototáctica de C. reinhardtii10. Además, ambos cilios muestran la conversión de la forma de onda del modo de natación hacia adelante (llamado forma de onda asimétrica) al modo de natación hacia atrás (llamado forma de onda simétrica que aparece durante un corto período cuando las células están foto-o-mecano-chocadas)11,12. Esta conversión de forma de onda está regulada por Ca2+ submilimolar, que se demostró mediante la reactivación del llamado aparato nucleoflagelar (un complejo que contiene dos cilios, los cuerpos basales, las estructuras que unen los cuerpos basales con el núcleo y el remanente del núcleo)11 o axonemas demembranados de cilios aislados13. Aparte de Ca2+, el aplomo redox (reducción-oxidación) es una señal que regula la frecuencia de latido ciliar, que se demostró mediante la reactivación de modelos celulares en tampones redox que contienen diferentes proporciones de glutatión reducido vs. glutatión oxidado14. Además, el monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) regula asimétricamente dos cilios, lo que se demostró mediante la reactivación de axonemas con cAMP15 enjaulado fotocleavable. Estos hallazgos in vitro, combinados con hallazgos genéticos, han llevado a una comprensión más profunda de los mecanismos moleculares de la regulación de los cilios en C. reinhardtii.
Aquí se describe un protocolo para reactivar los modelos celulares. El método es simple, permite varias modificaciones y se puede aplicar a múltiples organismos que se mueven con cilios. Sin embargo, debido a que las células desmembranadas son frágiles, se requieren algunos consejos para reactivar la motilidad de los modelos celulares con buena eficiencia al tiempo que se evita la deciliación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL plastic tube</td>
			<td>QSP</td>
			<td>502-PLN-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sima-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>KUBOTA</td>
			<td>2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas strain CC-125</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td></td>
			<td>https://www.chlamycollection.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CK-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CRPHO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEDTA(EGTA)</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>G002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>GB70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>21002-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, Mr 20,000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18897.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>28434-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii

Desde el experimento histórico sobre la contracción del músculo glicerinado mediante la adición de ATP, que Szent-Györgyi demostró a mediados del siglo 20, la reactivación in vitro de las células desmembranadas ha sido una forma tradicional y potente de examinar la motilidad celular. La ventaja fundamental de este método experimental es que la composición de la solución de reactivación puede cambiarse fácilmente. Por ejemplo, un entorno de alta concentraciónde Ca 2+ que ocurre solo temporalmente debido a la excitación de la membrana in vivo se puede replicar en el laboratorio. Los cilios eucariotas (también conocidos como flagelos) son elaboradas máquinas de motilidad cuyos mecanismos reguladores aún no se han aclarado. El alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii es un excelente organismo modelo en el campo de investigación de los cilios. Los experimentos de reactivación utilizando modelos celulares demembranados de C. reinhardtii y sus derivados, como los axonemas demembranados de cilios aislados, han contribuido significativamente a comprender los mecanismos moleculares de la motilidad ciliar. Esos experimentos aclararon que el ATP energiza la motilidad ciliar y que varias señales celulares, incluyendo Ca2+, cAMP y especies reactivas de oxígeno, modulan los movimientos ciliares. El método preciso para la demembranación de las células de C. reinhardtii y la reactivación de los modelos celulares se describe aquí.

El proceso de demembranación y reactivación en la cepa de tipo salvaje C. reinhardtii (CC-125) se muestra aquí. El cultivo 2 días después de la inoculación se convirtió en un color verde claro (paso 1.1) (Figura 1). Las células se recogieron (paso 2.1), se lavaron (paso 2.2) y se desmembranaron (paso 2.5). Después de la demembranación, todos los modelos celulares se volvieron inmóviles (paso 2.7). Los cilios desmembranados (llamados axonemas) permanecen adheridos al cuer...

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Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

La reactivación in vitro de las células móviles es un experimento crucial para comprender los mecanismos de la motilidad celular. El protocolo describe la reactivación de los modelos de células desmembranadas de Chlamydomonas reinhardtii, un organismo modelo para estudiar los cilios/flagelos.

Reactivación de modelos celulares desmembranados en Chlamydomonas reinhardtii

Since the historical experiment on the contraction of glycerinated muscle by adding ATP, which Szent-Gy&#246;rgyi demonstrated in the mid-20th century, in ...

Este método puede ayudar a comprender qué factores afectan la motilidad de los cilios. La principal ventaja de esta técnica es que los fenómenos que ocurren solo temporalmente in vivo, dicha inversión de las concentraciones de iones de calcio en los cilios se puede observar continuamente in vitro. Este método contribuye específicamente al campo de investigación de los cilios móviles.Sería difícil para los principiantes realizar el paso de demembranación. Por lo tanto, es muy recomendable llevar a cabo los pasos con suavidad pero precisión. Comience centrifugando aproximadamente 10 mililitros de cultivo de Chlamydomonas reinhardtii a 1, 000 RCF a 20 grados Celsius durante tres minutos.Decantar el sobrenadante y aspirar el remanente mediante una pipeta Pasteur. Resuspend los precipitados en aproximadamente cinco mililitros de tampón de lavado. Centrífugas en el tampón de lavado a 1.000 RCF durante tres minutos a 20 grados centígrados.Deseche el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta. Agregue aproximadamente 0,5 mililitros de tampón de demembranación al pellet celular. Agite el tubo suavemente para suspender aproximadamente las células en el tampón, luego coloque el tubo en hielo.Suspenda el gránulo de celda restante suavemente con una pipeta y coloque el tubo sobre el hielo nuevamente. Tome de 5 a 10 microlitros del modelo celular, diluya diez veces con el tampón de dilución y observe bajo el microscopio para confirmar que todos los modelos celulares están desmembranados y no nadan. En un tubo de 0,5 mililitros, mezcle 80 microlitros de solución de reactivación, 10 microlitros de solución de ATP y 10 microlitros de modelos celulares tocando el tubo.Coloque aproximadamente 30 microlitros de la solución mixta en un portaobjetos de vidrio y coloque suavemente un deslizamiento de cubierta sobre él con espaciadores para evitar un choque mecánico en el modelo de celda. Observe los modelos celulares reactivados bajo un microscopio. Después de la demembranación del cultivo de C.reinhardtii, todos los modelos celulares se volvieron inmóviles y los cilios desmembranados permanecieron unidos al cuerpo celular, confirmando que la inmotilidad de los modelos celulares no fue causada por la desciliación.Después de mezclar los modelos celulares con el búfer de reactivación en ATP, más del 50% de los modelos celulares se volvieron móviles. Incluso sin el sistema de regeneración de ATP, las células reactivadas continuaron moviéndose durante aproximadamente 90 minutos con una concentración final de ATP de un milimolar antes de detenerse gradualmente. El paso de demembranación es crítico.Todas las células deben dejar de nadar, pero no deben mezclarse tan fuertemente que se produzca la descilación. Los investigadores pueden modificar este protocolo para incluir reactivos como iones de calcio o AMP cíclico, o realizar experimentos con un mutante que carece de una proteína en particular para identificar su papel biológico.

Research

JoVE Journal

Biology

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

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