Name: reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

Denna studie stöddes av bidrag från Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) till N.U. (19K23758, 21K06295) och K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), från Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) till K.W., och från Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) till N.U. och K.W. Vi tackar Miyuki Shinohara (Hosei Univ.) för hennes hjälp med att förbereda figurerna.

En vildtypsstam av Chlamydomonas reinhardtii, CC-125, användes för den aktuella studien. CC-125 erhölls från Chlamydomonas Resource Center (se materialtabell) och upprätthölls på ett Tris-acetatfosfat (TAP)16, 1,5% agarosmedium vid 20-25 °C.
1. Cellodling
<ol><li>Kultur Chlamydomonas reinhardtii (CC-125) i TAP medium16 i en 12 h/12 h ljus-mörk period (ljusförhållanden för ljusperio...

<ol>
	<li>Szent-Gyorgyi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-energy+relations+and+contraction+of+actomyosin.">Free-energy relations and contraction of actomyosin.</a> Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).</li><li>Hoffman-Berling, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosintriphosphat+als+betriebsstoff+von+zellbewegungen.">Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).</li><li>Naitoh, Y., Kaneko, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivated+Triton-extracted+models+of+Paramecium:+modification+of+ciliary+movement+by+calcium+ions.">Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions.</a> Science. 176 (4034), 523-524 (1972).</li><li>Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+flagellar+mutants+lacking+radial+spokes+and+central+tubules.+Structure,+composition,+and+function+of+specific+axonemal+components.">Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components.</a> Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).</li><li>R&#252;ffer, U., Nultsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+coordination+in+Chlamydomonas+cells+held+on+micropipettes.">Flagellar coordination in Chlamydomonas cells held on micropipettes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 41 (4), 297-307 (1998).</li><li>Sale, W. S., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+active+sliding+of+microtubules+in+Tetrahymena+cilia.">Direction of active sliding of microtubules in Tetrahymena cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (5), 2045-2049 (1977).</li><li>Fox, L. A., Sale, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+force+generated+by+the+inner+row+of+dynein+arms+on+flagellar+microtubules.">Direction of force generated by the inner row of dynein arms on flagellar microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 105 (4), 1781-1787 (1987).</li><li>Kamiya, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+assessed+by+in+vitro+and+in+vivo+motility+assays+of+Chlamydomonas+mutants.">Functional diversity of axonemal dyneins as assessed by in vitro and in vivo motility assays of Chlamydomonas mutants.</a> Zoolog Science. 31 (10), 633-644 (2014).</li><li>Kamiya, R., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicromolar+levels+of+calcium+control+the+balance+of+beating+between+the+two+flagella+in+demembranated+models+of+Chlamydomonas.">Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).</li><li>Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototactic+activity+in+Chlamydomonas+'non-phototactic'+mutants+deficient+in+Ca2+-dependent+control+of+flagellar+dominance+or+in+inner-arm+dynein.">Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein.</a> Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).</li><li>Hyams, J. S., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+flagellar+apparatus+of+Chlamydomonas:+characterization+of+forward+swimming+and+alteration+of+waveform+and+reversal+of+motion+by+calcium+ions+in+vitro.">Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro.</a> Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).</li><li>Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+CAV2+encodes+a+voltage-+dependent+calcium+channel+required+for+the+flagellar+waveform+conversion.">Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion.</a> Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).</li><li>Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+control+of+waveform+in+isolated+flagellar+axonemes+of+Chlamydomonas.">Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).</li><li>Wakabayashi, K., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+flagellar+motility+by+redox+poise.">Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise.</a> Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).</li><li>Saegusa, Y., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+controls+the+balance+of+the+propulsive+forces+generated+by+the+two+flagella+of+Chlamydomonas.">cAMP controls the balance of the propulsive forces generated by the two flagella of Chlamydomonas.</a> Cytoskeleton. 72 (8), 412-421 (2015).</li><li>Gorman, D. S., Levine, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+f+and+plastocyanin:+their+sequence+in+the+photosynthetic+electron+transport+chain+of+Chlamydomonas+reinhardi.">Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).</li><li>Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+estimation+of+cytosolic+ATP+concentration+from+the+ciliary+beating+frequency+in+the+green+alga+Chlamydomonas+reinhardtii.">Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).</li><li>Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+waveform+conversion+in+the+flagellar+axoneme+of+Chlamydomonas+mutants+lacking+the+central-pair/radial+spoke+system.">Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).</li><li>Yueh, Y. G., Crain, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deflagellation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+follows+a+rapid+transitory+accumulation+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+requires+Ca2++entry.">Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry.</a> Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).</li><li>Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+flagellar+motility+activation+in+Chlamydomonas+reinhardtii+in+response+to+mechanical+agitation.">Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).</li><li>Ueki, N., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-extracted+Volvox+model+exhibits+an+anterior-posterior+gradient+in+flagellar+Ca2.">Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1061-1068 (2018).</li><li>Tanno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four-celled+Volvocales+green+alga+Tetrabaena+socialis+exhibits+weak+photobehavior+and+high-photoprotection+ability.">The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability.</a> PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).</li></ol>

Det finns två kritiska steg i detta protokoll. Den första är en process som kallas hågkomst, som måste utföras försiktigt men noggrant. Decilation (dvs. lossning av cilia från cellkroppen) induceras genom kraftig pipettering eller virvel, vilket gör cellmodellerna orörliga även efter tillsats av ATP. Vanligtvis suspenderas 5 × 107 celler i ~ 0,5 ml demembraneringsbuffert (slutlig celltäthet: 1 × 108 celler / ml). Cellmodellernas reaktiveringshastighet skulle minska om cellmodelldensite...

In vitro-reaktivering av demembranerade rörliga celler är ett värdefullt verktyg för att studera den molekylära grunden för regleringsmekanismen för cellmotilitet. Szent-Györgyi visade först in vitro-sammandragning av kaninskelettmuskelfibrer extraherade med 50% glycerol genom tillsats av adenosintrifosfat (ATP)1. Detta experiment var det första som bevisade att ATP ger energi till muskelkontraktion. Metoden tillämpades snart på studien av ATP-energisk ciliär/flagellärmotilitet, såsom sperm flagella2, Paramecium cilia3 och Chlamydomonas reinhardtii cilia (även kallad flagella)4 med hjälp av icke-joniska tvättmedel för hågkomst.
Den encelliga gröna algen C. reinhardtii är en modellorganism för att studera flimmerhår: den simmar med två flimmerhår genom att slå dem som en människas bröstsim5. Ciliary rörelse drivs av dynein, ett minus-end riktat mikrotubulibaserat motorprotein 6,7. Ciliary dyneiner kan klassificeras i yttre armen dyneiner och inre arm dyneiner. Mutanter som saknar varje typ av dynein har isolerats som långsamt simmande mutanter med olika rörlighetsavvikelser. Detaljerad in vitro-motilitetsanalys av dessa mutanter har signifikant avancerad dyneinforskning8.
Många viktiga fynd har uppnåtts med hjälp av denna metod och dess derivat sedan in vitro-reaktiveringsexperimentet av demembranerade C. reinhardtii-celler (cellmodeller) etablerades. Reaktivering av cellmodeller i en serie Ca2+ buffertar visade till exempel9 att två flimmerhår regleras olika av submikromolär Ca2+, och denna asymmetriska ciliakontroll möjliggör den fototaktiska orienteringen av C. reinhardtii10. Dessutom visar båda flimmerhåren vågformsomvandling från det framåtriktade simläget (kallat asymmetrisk vågform) till bakåtsimningsläget (kallat symmetrisk vågform som visas under en kort period när celler är foto- eller mekanochockade)11,12. Denna vågformsomvandling regleras av submillimolar Ca2+, vilket visades genom reaktivering av den så kallade nukleoflagellarapparaten (ett komplex innehållande två cilia, de basala kropparna, strukturerna som förbinder basalkropparna med kärnan och återstoden av kärnan)11 eller demembranerade axonemer av isolerade cilia13. Annat än Ca2+ är redox (reduktion-oxidation) poise en signal som reglerar ciliär slagfrekvensen, vilket visades genom reaktivering av cellmodeller i redoxbuffertar innehållande olika förhållanden av reducerad glutation kontra oxiderad glutation14. Dessutom reglerar cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) asymmetriskt två cilia, vilket visades genom reaktivering av axonemer med fotocleavable caged cAMP15. Dessa in vitro-fynd, i kombination med genetiska fynd, har lett till en djupare förståelse av de molekylära mekanismerna för ciliareglering i C. reinhardtii.
Ett protokoll för att återaktivera cellmodellerna beskrivs här. Metoden är enkel, möjliggör olika modifieringar och kan tillämpas på flera organismer som rör sig med cilia. Men eftersom demembranerade celler är ömtåliga kräver det några tips för att återaktivera cellmodellernas rörlighet med god effektivitet samtidigt som de förhindrar decilation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL plastic tube</td>
			<td>QSP</td>
			<td>502-PLN-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sima-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>KUBOTA</td>
			<td>2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas strain CC-125</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td></td>
			<td>https://www.chlamycollection.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CK-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CRPHO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEDTA(EGTA)</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>G002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>GB70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>21002-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, Mr 20,000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18897.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>28434-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii

Sedan det historiska experimentet på sammandragning av glycerinerad muskel genom tillsats av ATP, som Szent-Györgyi demonstrerade i mitten av 20-talet, har in vitro-reaktivering av demembranerade celler varit ett traditionellt och potent sätt att undersöka cellmotilitet. Den grundläggande fördelen med denna experimentella metod är att sammansättningen av reaktiveringslösningen lätt kan ändras. Till exempel kan en koncentrationsmiljö med hög Ca2+ som endast uppstår tillfälligt på grund av membranexcitation in vivo replikeras i labbet. Eukaryota cilia (aka flageller) är utarbetade rörlighetsmaskiner vars regleringsmekanismer ännu inte har klargjorts. Den encelliga gröna algen Chlamydomonas reinhardtii är en utmärkt modellorganism inom forskningsfältet flimmerhår. Reaktiveringsexperimenten med hjälp av demembranerade cellmodeller av C. reinhardtii och deras derivat, såsom demembranerade axonemer av isolerade cilia, har signifikant bidragit till att förstå de molekylära mekanismerna för ciliär motilitet. Dessa experiment klargjorde att ATP ger energi till ciliär rörlighet och att olika cellulära signaler, inklusive Ca2+, cAMP och reaktiva syrearter, modulerar ciliära rörelser. Den exakta metoden för demembranering av C. reinhardtii-celler och reaktivering av cellmodellerna beskrivs här.

Demembranerings- och reaktiveringsprocessen i C. reinhardtii vildtypstam (CC-125) visas här. Kulturen 2 dagar efter inokulering blev en ljusgrön färg (steg 1.1) (Figur 1). Cellerna samlades in (steg 2.1), tvättades (steg 2.2) och demembranerades (steg 2.5). Efter hågkomst blev alla cellmodeller omogna (steg 2.7). De demembranerade cilia (kallade axonemer) förblir fästa vid cellkroppen, vilket visar att cellmodellernas omognad inte orsakas av decilation (...

Watch this Scientific Journal Video about Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

In vitro-reaktivering av rörliga celler är ett avgörande experiment för att förstå mekanismerna för cellmotilitet. Protokollet beskriver återaktivering av de demembranerade cellmodellerna av Chlamydomonas reinhardtii, en modellorganism för att studera cilia/flagella.

Återaktivering av demembranerade cellmodeller i Chlamydomonas reinhardtii

Since the historical experiment on the contraction of glycerinated muscle by adding ATP, which Szent-Gy&#246;rgyi demonstrated in the mid-20th century, in ...

Denna metod kan hjälpa till att förstå vilka faktorer som påverkar cilia motilitet. Den största fördelen med denna teknik är att de fenomen som endast uppträder tillfälligt in vivo, sådan inversion av kalciumjonkoncentrationer i cilia kan observeras kontinuerligt in vitro. Denna metod bidrar specifikt till forskningsfältet motila cilia.Det skulle vara svårt för nybörjare att utföra hågkomststeget. Därför rekommenderas det starkt att utföra stegen försiktigt men exakt. Börja med att centrifugera cirka 10 ml Chlamydomonas reinhardtii-kultur vid 1 000 RCF vid 20 grader Celsius i tre minuter.Dekantera supernatanten och aspirera resterna med en Pasteur-pipett. Återsuspendera utfällningarna i cirka fem milliliter tvättbuffert. Centrifugera celler i tvättbufferten vid 1 000 RCF i tre minuter vid 20 grader Celsius.Kassera supernatanten försiktigt med en pipett. Tillsätt cirka 0,5 ml hågkomstbuffert till cellpelleten. Skaka röret försiktigt för att grovt suspendera cellerna i bufferten och lägg sedan röret på is.Suspendera den återstående cellpelleten försiktigt med en pipett och placera röret på isen igen. Ta 5 till 10 mikroliter av cellmodellen, späd tiofaldigt med utspädningsbufferten och observera under mikroskopet för att bekräfta att alla cellmodeller är demembranerade och inte simmar. Blanda 80 mikroliter reaktiveringslösning, 10 mikroliter ATP-lösning och 10 mikroliter cellmodeller i ett 0,5-milliliterrör genom att knacka på röret.Lägg cirka 30 mikroliter av den blandade lösningen på en glasskiva och placera försiktigt en täckglidning på den med distanser för att undvika en mekanisk stöt på cellmodellen. Observera de återaktiverade cellmodellerna under ett mikroskop. Efter hågkomsten av C.reinhardtii-kulturen blev alla cellmodeller omogna och de hågkomsterna förblev fästa vid cellkroppen, vilket bekräftade att cellmodellernas omogenhet inte orsakades av de-ciliation.Efter att ha blandat cellmodellerna med reaktiveringsbufferten i ATP blev mer än 50% av cellmodellerna rörliga. Även utan ATP-regenereringssystemet fortsatte de reaktiverade cellerna att röra sig i cirka 90 minuter med en slutlig ATP-koncentration på en millimolar innan de gradvis stannade. Hågkomststeget är kritiskt.Alla celler ska sluta simma, men de ska inte blandas så starkt att de-ciliation sker. Forskare kan modifiera detta protokoll för att inkludera reagenser som kalciumjoner eller cyklisk AMP, eller utföra experiment med en mutant som saknar ett visst protein för att identifiera deras biologiska roll.

Research

JoVE Journal

Biology

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Parning och tetrad Separation av Chlamydomonas reinhardtii För genetisk analys

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Heterotopisk och Orthotopic Trakealtuber transplantation på möss används som modeller för att studera utvecklingen av Obliterativ luftvägssjukdom

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatik Analys av mänskliga embryonala stamceller Colony Tillväxt

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

Principer för Gnagare Kirurgi för Ny Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats

Manuell Restraint och gemensamma Compound Rutter Administration hos möss och råttor

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research.  Working confidently and humanely with mice and ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

Utvärdering av bröstkörtlarna utveckling och funktion i musmodeller

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

Diagnostiska obduktion och Selected Tissue och Provtagning på råttor och möss

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biokemiska Ombildning av steroidreceptoreffekten • Hsp90 proteinkomplex och Reaktivering av ligandbindande

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mus Spermier Frysförvaring and Recovery med I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models

Odling och tillämpningar av roterande Wall Vessel Bioreaktor Härstammar 3D epitelceller modeller

Cells and tissues in the body experience environmental conditions that influence their architecture, intercellular communications, and overall functions. ...