Name: reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

Bu çalışma, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği KAKENHI'den (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) N.U. (19K23758, 21K06295) ve K.W.'ye (19H03242, 20K21420, 21H00420), Ohsumi Frontier Science Foundation'dan (https://www.ofsf.or.jp/en/) K.W.'ye ve İnsan, Çevre ve Malzeme Köprüsü için Dinamik İttifak'tan (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) N.U. ve K.W.'ye hibelerle desteklenmiştir. Bayan Miyuki Shinohara'ya (Hosei Univ.) figürlerin hazırlanmasındaki yardımı için teşekkür ederiz.

Bu çalışmada Chlamydomonas reinhardtii'nin vahşi tip bir suşu olan CC-125 kullanılmıştır. CC-125, Chlamydomonas Kaynak Merkezi'nden elde edildi ( bakınız Malzeme Tablosu) ve 20-25 ° C'de bir Tris-asetat-fosfat (TAP)16,% 1.5 agaroz ortamında tutuldu.
1. Hücre kültürü
<ol><li>Kültür Chlamydomonas reinhardtii (CC-125) TAP orta16'da 12 saat / 12 saat açık-karanlık dönemde (?...

<ol>
	<li>Szent-Gyorgyi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-energy+relations+and+contraction+of+actomyosin.">Free-energy relations and contraction of actomyosin.</a> Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).</li><li>Hoffman-Berling, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosintriphosphat+als+betriebsstoff+von+zellbewegungen.">Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).</li><li>Naitoh, Y., Kaneko, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivated+Triton-extracted+models+of+Paramecium:+modification+of+ciliary+movement+by+calcium+ions.">Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions.</a> Science. 176 (4034), 523-524 (1972).</li><li>Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+flagellar+mutants+lacking+radial+spokes+and+central+tubules.+Structure,+composition,+and+function+of+specific+axonemal+components.">Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components.</a> Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).</li><li>R&#252;ffer, U., Nultsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+coordination+in+Chlamydomonas+cells+held+on+micropipettes.">Flagellar coordination in Chlamydomonas cells held on micropipettes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 41 (4), 297-307 (1998).</li><li>Sale, W. S., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+active+sliding+of+microtubules+in+Tetrahymena+cilia.">Direction of active sliding of microtubules in Tetrahymena cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (5), 2045-2049 (1977).</li><li>Fox, L. A., Sale, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+force+generated+by+the+inner+row+of+dynein+arms+on+flagellar+microtubules.">Direction of force generated by the inner row of dynein arms on flagellar microtubules.</a> Journal of Cell Biology. 105 (4), 1781-1787 (1987).</li><li>Kamiya, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+assessed+by+in+vitro+and+in+vivo+motility+assays+of+Chlamydomonas+mutants.">Functional diversity of axonemal dyneins as assessed by in vitro and in vivo motility assays of Chlamydomonas mutants.</a> Zoolog Science. 31 (10), 633-644 (2014).</li><li>Kamiya, R., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicromolar+levels+of+calcium+control+the+balance+of+beating+between+the+two+flagella+in+demembranated+models+of+Chlamydomonas.">Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).</li><li>Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototactic+activity+in+Chlamydomonas+'non-phototactic'+mutants+deficient+in+Ca2+-dependent+control+of+flagellar+dominance+or+in+inner-arm+dynein.">Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein.</a> Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).</li><li>Hyams, J. S., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+flagellar+apparatus+of+Chlamydomonas:+characterization+of+forward+swimming+and+alteration+of+waveform+and+reversal+of+motion+by+calcium+ions+in+vitro.">Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro.</a> Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).</li><li>Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+CAV2+encodes+a+voltage-+dependent+calcium+channel+required+for+the+flagellar+waveform+conversion.">Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion.</a> Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).</li><li>Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+control+of+waveform+in+isolated+flagellar+axonemes+of+Chlamydomonas.">Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).</li><li>Wakabayashi, K., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+flagellar+motility+by+redox+poise.">Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise.</a> Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).</li><li>Saegusa, Y., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+controls+the+balance+of+the+propulsive+forces+generated+by+the+two+flagella+of+Chlamydomonas.">cAMP controls the balance of the propulsive forces generated by the two flagella of Chlamydomonas.</a> Cytoskeleton. 72 (8), 412-421 (2015).</li><li>Gorman, D. S., Levine, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+f+and+plastocyanin:+their+sequence+in+the+photosynthetic+electron+transport+chain+of+Chlamydomonas+reinhardi.">Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).</li><li>Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+estimation+of+cytosolic+ATP+concentration+from+the+ciliary+beating+frequency+in+the+green+alga+Chlamydomonas+reinhardtii.">Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).</li><li>Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+waveform+conversion+in+the+flagellar+axoneme+of+Chlamydomonas+mutants+lacking+the+central-pair/radial+spoke+system.">Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).</li><li>Yueh, Y. G., Crain, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deflagellation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+follows+a+rapid+transitory+accumulation+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+requires+Ca2++entry.">Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry.</a> Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).</li><li>Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+flagellar+motility+activation+in+Chlamydomonas+reinhardtii+in+response+to+mechanical+agitation.">Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).</li><li>Ueki, N., Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-extracted+Volvox+model+exhibits+an+anterior-posterior+gradient+in+flagellar+Ca2.">Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1061-1068 (2018).</li><li>Tanno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four-celled+Volvocales+green+alga+Tetrabaena+socialis+exhibits+weak+photobehavior+and+high-photoprotection+ability.">The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability.</a> PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).</li></ol>

Bu protokolde iki kritik adım vardır. Birincisi, nazikçe ama iyice yapılması gereken demembranasyon olarak bilinen bir işlemdir. Dekiliasyon (yani, kirpiklerin hücre gövdesinden ayrılması), güçlü pipetleme veya vorteks ile indüklenir ve hücre modellerini ATP'nin eklenmesinden sonra bile hareketsiz hale getirir. Tipik olarak, 5 × 107 hücre, ~ 0.5 mL demembranasyon tamponunda askıya alınır (son hücre yoğunluğu: 1 × 108 hücre / mL). Hücre modeli yoğunluğu bundan çok daha d?...

Hatırlanan hareketli hücrelerin in vitro reaktivasyonu, hücre hareketliliğinin düzenleyici mekanizmasının moleküler temelini incelemek için değerli bir araçtır. Szent-Györgyi ilk olarak adenozin trifosfat (ATP) ekleyerek %50 gliserol ile ekstrakte edilen tavşan iskelet kası liflerinin in vitro kasılmasını gösterdi1. Bu deney, ATP'nin kas kasılmasına enerji verdiğini kanıtlayan ilk deneydi. Metodoloji kısa bir süre sonra, sperm flagella2, Paramecium cilia3 ve Chlamydomonas reinhardtii cilia (flagella olarak da adlandırılır)4 gibi ATP enerjili siliyer / flagellar motilitenin incelenmesine, demembranasyon için iyonik olmayan deterjanlar kullanılarak uygulandı.
Tek hücreli yeşil alg C. reinhardtii, kirpikleri incelemek için model bir organizmadır: iki kirpikle yüzerek onları bir insanın kurbağalaması gibi döver5. Siliyer hareket, eksi uçlu yönlendirilmiş mikrotübül bazlı bir motor protein 6,7 olan dynein tarafından tahrik edilir. Siliyer dinyenler dış kol dineinleri ve iç kol dineinleri olarak sınıflandırılabilir. Her türlü dineinden yoksun mutantlar, farklı hareketlilik anormalliklerine sahip yavaş yüzen mutantlar olarak izole edilmiştir. Bu mutantların ayrıntılı in vitro motilite analizi, dinein araştırmalarını önemli ölçüde ilerletmiştir8.
Hatırlanan C. reinhardtii hücrelerinin (hücre modelleri) in vitro reaktivasyon deneyi kurulduğundan beri bu yöntem ve türevleri kullanılarak birçok önemli bulguya ulaşılmıştır. Örneğin, bir dizi Ca 2 + tamponunda hücre modellerinin reaktivasyonu,9'a iki kirpiklerin submikromolar Ca2 + tarafından farklı şekilde düzenlendiğini gösterdi ve bu asimetrik kirpik kontrolü, C. reinhardtii10'un fototaktik yönelimini sağlar. Ayrıca, her iki kirpik de ileri yüzme modundan (asimetrik dalga formu olarak adlandırılır) geriye doğru yüzme moduna (hücreler foto veya mekano-şok edildiğinde kısa bir süre için ortaya çıkan simetrik dalga formu olarak adlandırılır) dalga formu dönüşümü gösterir11,12. Bu dalga formu dönüşümü, nükleoflagellar aparatın (iki kirpik, bazal cisimler, bazal cisimleri çekirdeğe bağlayan yapılar ve çekirdeğin kalıntılarını içeren bir kompleks)11 veya izole kirpiklerin demembrane edilmiş aksonemlerinin reaktivasyonu ile gösterilen submilimolar Ca2 + ile düzenlenir13. Ca2+ dışında, redoks (indirgeme-oksidasyon) duruşu, indirgenmiş glutatyon ve oksitlenmiş glutatyon14'ün farklı oranlarını içeren redoks tamponlarındaki hücre modellerinin reaktivasyonu ile gösterilen siliyer atma frekansını düzenleyen bir sinyaldir. Ek olarak, siklik adenozin monofosfat (cAMP), fotobölünebilir kafesli cAMP15 ile aksonemlerin reaktivasyonu ile gösterilen iki kirpikleri asimetrik olarak düzenler. Bu in vitro bulgular, genetik bulgularla birleştiğinde, C. reinhardtii'deki kirpik regülasyonunun moleküler mekanizmalarının daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlamıştır.
Hücre modellerini yeniden etkinleştirmek için bir protokol burada açıklanmıştır. Yöntem basittir, çeşitli modifikasyonlara izin verir ve kirpiklerle hareket eden birden fazla organizmaya uygulanabilir. Bununla birlikte, demembrane edilmiş hücreler kırılgan olduğundan, hücre modellerinin hareketliliğini iyi bir verimlilikle yeniden etkinleştirmek için bazı ipuçları gerektirir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL plastic tube</td>
			<td>QSP</td>
			<td>502-PLN-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td>
			<td>Sima-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>KUBOTA</td>
			<td>2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas strain CC-125</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td></td>
			<td>https://www.chlamycollection.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CK-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CRPHO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14128-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEDTA(EGTA)</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>G002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>GB70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>21002-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, Mr 20,000</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18897.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>28434-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reactivation of demembranated cell models in chlamydomonas reinhardtii

Szent-Györgyi'nin 20. yüzyılın ortalarında gösterdiği ATP eklenerek gliserinli kasın kasılmasına ilişkin tarihsel deneyden bu yana, demembrane hücrelerin in vitro reaktivasyonu, hücre hareketliliğini incelemek için geleneksel ve güçlü bir yol olmuştur. Bu deneysel yöntemin temel avantajı, reaktivasyon çözeltisinin bileşiminin kolayca değiştirilebilmesidir. Örneğin, in vivo membran uyarımı nedeniyle sadece geçici olarak meydana gelen yüksek Ca2+ konsantrasyon ortamı laboratuvarda çoğaltılabilir. Ökaryotik kirpikler (diğer adıyla flagella), düzenleyici mekanizmaları hala açıklığa kavuşturulması gereken ayrıntılı hareketlilik makineleridir. Tek hücreli yeşil alg Chlamydomonas reinhardtii, kirpiklerin araştırma alanında mükemmel bir model organizmadır. C. reinhardtii'nin demembrane hücre modellerini ve izole kirpiklerin demembrane aksonemleri gibi türevlerini kullanan reaktivasyon deneyleri, siliyer motilitenin moleküler mekanizmalarının anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Bu deneyler, ATP'nin siliyer hareketliliğe enerji verdiğini ve Ca2 +, cAMP ve reaktif oksijen türleri de dahil olmak üzere çeşitli hücresel sinyallerin siliyer hareketleri modüle ettiğini açıklığa kavuşturdu. C. reinhardtii hücrelerinin demembranasyonu ve hücre modellerinin reaktivasyonu için kesin yöntem burada açıklanmıştır.

C. reinhardtii vahşi tip suşunda (CC-125) demembranasyon ve reaktivasyon süreci burada gösterilmiştir. Aşılamadan 2 gün sonra kültür açık yeşil bir renk haline geldi (adım 1.1) (Şekil 1). Hücreler toplandı (adım 2.1), yıkandı (adım 2.2) ve demembrane edildi (adım 2.5). Demembranasyondan sonra, tüm hücre modelleri hareketsiz hale geldi (adım 2.7). Membrane edilmiş kirpikler (aksonemler olarak adlandırılır) hücre gövdesine bağlı kalır, bu da hücre m...

Watch this Scientific Journal Video about Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

Hareketli hücrelerin in vitro reaktivasyonu, hücre hareketliliğinin mekanizmalarını anlamada çok önemli bir deneydir. Protokol, kirpikler / flagella'yı incelemek için bir model organizma olan Chlamydomonas reinhardtii'nin demembrane edilmiş hücre modellerinin yeniden aktive edilmesini açıklar.

Chlamydomonas reinhardtii'de Demembrane Hücre Modellerinin Reaktivasyonu

Since the historical experiment on the contraction of glycerinated muscle by adding ATP, which Szent-Gy&#246;rgyi demonstrated in the mid-20th century, in ...

Bu yöntem, hangi faktörlerin kirpik hareketliliğini etkilediğini anlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sadece geçici olarak in vivo olarak meydana gelen fenomenlerin, kirpiklerdeki kalsiyum iyon konsantrasyonlarının bu şekilde tersine çevrilmesinin in vitro olarak sürekli olarak gözlemlenebilmesidir. Bu yöntem özellikle hareketli kirpiklerin araştırma alanına katkıda bulunur.Yeni başlayanlar için hatırlama adımını gerçekleştirmek zor olurdu. Bu nedenle, adımların nazikçe ama kesin bir şekilde yapılması şiddetle tavsiye edilir. Yaklaşık 10 mililitre Chlamydomonas reinhardtii kültürünü üç dakika boyunca 20 santigrat derecede 1.000 RCF'de santrifüj ederek başlayın.Süpernatantı boşaltın ve kalıntıyı bir Pasteur pipetle aspire edin. Çökeltileri yaklaşık beş mililitre yıkama tamponunda yeniden askıya alın. Yıkama tamponundaki hücreleri 1.000 RCF'de 20 santigrat derecede üç dakika boyunca santrifüj yapın.Süpernatantı bir pipetle dikkatlice atın. Hücre peletine yaklaşık 0,5 mililitre demembranasyon tamponu ekleyin. Tampondaki hücreleri kabaca askıya almak için tüpü hafifçe çalkalayın, ardından tüpü buzun üzerine koyun.Kalan hücre peletini bir pipetle nazikçe askıya alın ve tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin. Hücre modelinin 5 ila 10 mikrolitresini alın, seyreltme tamponu ile on kat seyreltin ve tüm hücre modellerinin hatırlandığını ve yüzmediğini doğrulamak için mikroskop altında gözlemleyin. 0.5 mililitrelik bir tüpte, tüpe dokunarak 80 mikrolitre reaktivasyon çözeltisi, 10 mikrolitre ATP çözeltisi ve 10 mikrolitre hücre modelini karıştırın.Karışık çözeltinin yaklaşık 30 mikrolitresini bir cam slayt üzerine koyun ve hücre modeline mekanik bir şoku önlemek için ara parçalarla üzerine yavaşça bir kapak kayması yerleştirin. Yeniden aktive edilmiş hücre modellerini mikroskop altında gözlemleyin. C.reinhardtii kültürünün hatırlanmasından sonra, tüm hücre modelleri hareketsiz hale geldi ve demembrane edilen kirpikler hücre gövdesine bağlı kaldı ve hücre modellerinin hareketsizliğinin siliasyondan kaynaklanmadığını doğruladı.Hücre modellerini ATP'deki reaktivasyon tamponu ile karıştırdıktan sonra, hücre modellerinin% 50'sinden fazlası hareketli hale geldi. ATP rejenerasyon sistemi olmasa bile, yeniden aktive edilen hücreler, yavaş yavaş durmadan önce bir milimolar'lık son ATP konsantrasyonu ile yaklaşık 90 dakika boyunca hareket etmeye devam etti. Hatırlama adımı kritiktir.Tüm hücreler yüzmeyi bırakmalı, ancak siliyasyonun meydana gelmesine neden olacak kadar güçlü bir şekilde karıştırılmamalıdır. Araştırmacılar bu protokolü kalsiyum iyonları veya siklik AMP gibi reaktifleri içerecek şekilde değiştirebilir veya biyolojik rollerini tanımlamak için belirli bir proteinden yoksun bir mutantla deneyler yapabilirler.

Research

JoVE Journal

Biology

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Çiftleşme ve tetrad Ayırma Chlamydomonas reinhardtii Genetik Analiz

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Biyoloji

Heterotopic and Orthotopic Tracheal Transplantation in Mice used as Models to Study the Development of  Obliterative Airway Disease

Obliteratif Havayolu Hastalığı Geliştirme Eğitim Modeli olarak kullanılan Farelerde Heterotopik ve Ortotopik Trakeal Nakli

Obliterative airway disease (OAD) is the major complication after lung transplantations that limits long term survival (1-7).
To study the ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Biyoinformatik İnsan Embriyonik Kök Hücre Colony Büyüme Analizi

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

Yeni Cerrah Kemirgen Cerrahisi İlkeleri

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats

Manuel Tutucu ve Fare ve Sıçanlarda Ortak Bileşik İdaresi Rotalar

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research.  Working confidently and humanely with mice and ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

Fare Modeller Meme Bezi Geliştirme ve Fonksiyon Değerlendirme

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

Tanı Otopsi ve Sıçanlar ve Fareler Seçilmiş Doku ve Örnek Toplama

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Steroid Reseptör Biyokimyasal Sulandırma Ligand • Protein Hsp90 Kompleksleri ve Yeniden bağlayıcı

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

I · Cryo Kit kullanarak Fare Sperm Kriyoprezervasyon ve Kurtarma

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models

Kültüre ve Duvar Gemi Biyoreaktör Döner Uygulamaları 3D Epitel Hücre Modelleri Türetilmiş

Cells and tissues in the body experience environmental conditions that influence their architecture, intercellular communications, and overall functions. ...