Name: purification and quality control of recombinant septin complexes for cell-free reconstitution
Uploaded: 2022-06-23T13:00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution at JoVE.com

نشكر سيسيليا دي أجريلا بينتو وتوماس دي غاراي وكاتارينا هاوسيرمان على مساعدتهم في تجارب القياس الضوئي الشامل (iSCAT). آرجين جاكوبي وويل إيفرز لمساعدتهما في TEM ؛ لوسيا بالداوف لمساعدتها في TIRF ؛ باسكال فيردييه بينارد لنصيحته بشأن الرحلان الكهربائي الأصلي ؛ أغاتا زوبا ومارجولين فينكينوغ لمساعدتهما في إعداد جهود تنقية ذبابة الفاكهة ، وتصوير الخلايا والأنسجة (PICT-IBiSA) ، معهد كوري ، عضو في البنية التحتية الوطنية الفرنسية للبحوث في فرنسا - التصوير الحيوي (ANR10-INBS-04). تلقى هذا البحث تمويلا من المنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO / OCW) من خلال منحة الجاذبية "BaSyC-Building a Synthetic Cell" (024.003.019) ومن الوكالة الوطنية للبحوث (منح ANR ANR-17-CE13-0014: "SEPTIMORF" ؛ ANR-13-JSV8-0002-01: "SEPTIME" ؛ و ANR-20-CE11-0014-01: "SEPTSCORT").

يعلن المؤلفون عن عدم وجود مصالح متنافسة أو مالية.

تسمح الطريقة الموصوفة هنا بالتنقية القوية ومراقبة الجودة لأوليغومرات سيبتين غير المتجانسة المشكلة مسبقا. فيما يلي بعض القضايا الرئيسية التي يجب مراعاتها من أجل التطبيق الصحيح للطريقة. أثناء خطوات الشطف في عمليات الفصل الكروماتوغرافية ، من المهم استخدام معدل التدفق الموصى به (أو الأقل) لتقليل تخفيف مجمعات السيبتين. بالإضافة إلى ذلك ، لتحقيق أقصى قدر من استعادة البروتين خلال خطوة التركيز النهائية ، يتم توجيه عمود المكثف بطريقة لا يتم فيها دفع المحلول ضد المرشح (عندما يكون هناك مرشح فقط على جانب واحد). إذا ذهب المحلول مباشرة إلى المرشح ، فإن البروتين يلتصق به أكثر بكثير ، مما يقلل بشكل كبير من العائد النهائي. من المهم أيضا مراعاة أن خطوة التركيز ليست ضرورية دائما. عادة ما يعطي انتقاء الكسور فقط من نطاق ضيق حول الذروة في مخطط الكروماتوجرام تركيزا عاليا بدرجة كافية (>3000 نانومتر) للعديد من تطبيقات إعادة التكوين (والتي تعمل عادة بين 10-300 نانومتر). أخيرا ، من أجل مراقبة جودة وظائف مجمعات السيبتين بواسطة الفحص المجهري الفلوري ، من المهم تخميل سطح شرائح الفحص المجهري بشكل صحيح ، لأن مجمعات السيبتين تلتصق بشدة بالزجاج. يمكن إجراء تخميل الشرائح الزجاجية إما عن طريق وظيفة PLL-PEG أو عن طريق تشكيل طبقات ثنائية دهنية محايدة (100٪ DOPC) مدعومة11,32.
مقارنة ببروتوكول التنقية الأصلي الموصوف لأول مرة في Iv et al.10 ، هناك تغيير في تركيبات المخزن المؤقت (الجدول 2). تم تقليل تركيز MgCl 2 من 5 mM إلى2 mM ، وتم تقليل تركيز ودرجة الحموضة من Tris-HCl من 50 mM إلى 20 mM ومن 8.0 إلى 7.4 ، على التوالي. تم إجراء هذه التغييرات لجعل الظروف العازلة متوافقة مع دراسات تفاعلات السيبتين البشري مع الطبقات الثنائية الدهنية وخيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة10،11،32. وذلك لأن المؤلفين شكلوا طبقات ثنائية دهنية مدعومة وأكتين مبلمر في F-buffer ، الذي يتطابق تكوينه مع تركيبة darkSPB ، بصرف النظر عن وجود ATP في F-buffer. لم ينتج عن تغيير المخزن المؤقت أي تغييرات في جودة أو عمر السيبتين المنقى مقارنة بالمخازن المؤقتة الأصلية.
طريقة التنقية هذه لا تزال لديها العديد من القيود. أولا ، يمكن أن تختلف محاولات التنقية المختلفة في العائد (0.5-1 مل من مجمعات السيبتين 2-5 ميكرومتر) والجودة الوظيفية ، كما يتم فحصها من خلال قدرة تكوين الحزمة لمجمعات السيبتين المنقى. هذا هو السبب في أنه من المهم للغاية إجراء فحوصات الجودة الموضحة في هذه الورقة باستمرار. يمكن أن يساعد التحكم الجيد في أوقات التعبير والكثافة البصرية للثقافة البكتيرية في تخفيف الفرق في المحصول. ثانيا ، لا يمكن لخط أنابيب التنقية هذا التمييز بين أدوات التشذيب والسداسي أو بين رباعي وأوكتامير (الشكل 1 ب). ومع ذلك ، يمكن استخدام تجارب مراقبة الجودة لإثبات أن غالبية مجمعات السيبتين هي في شكلها الأوليغومر الطويل. في حالة الحاجة إلى توزيع حجم oligomer أضيق ، يمكن إدراج كروماتوغرافيا استبعاد الحجم بين الخطوة 1.6. والخطوة 1.7. من بروتوكول التنقية. ومع ذلك ، فإن هذه الخطوة الاختيارية تقلل بشكل كبير من العائد ، ولا ينصح بها ما لم تكن هناك حاجة ماسة إليها. يأتي القيد الأخير الأكثر جوهرية من استخدام الإشريكية القولونية كنظام تعبير لمجمعات السيبتين المؤتلفة. بطبيعة الحال ، لا يسمح هذا النظام بإجراء تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) ، والتي تم الإبلاغ عنها في الخلايا الحيوانية ، مثل الفسفرة ، والأستيل ، والسومويل6،51،52،53. يمكن إضافة هذه التعديلات بعد الترجمة من خلال تنفيذ استراتيجية تنقية مماثلة في الحشرات أو الخلايا البشرية. علاوة على ذلك ، ناقشت هذه الورقة فقط إعادة تكوين السيبتين من تلقاء نفسها ، لكن الدراسات التي أجريت على الخلايا تشير إلى أن البروتينات التنظيمية مثل البروتينات من عائلة بورغ 54،55 وأنيلين24،25،56 يمكن أن يكون لها تأثيرات كبيرة ولكنها غير مفهومة بشكل جيد على تجميع ووظائف السيبتين ، وبالتالي ، من المهم دمجها في نهاية المطاف في المختبر. الدراسات. تم الإبلاغ عن بروتوكولات لتنقية بروتينات بورغ وأنيلين54,57.
يوفر بروتوكول تنقية السيبتين المذكور هنا طريقة موحدة لتنقية السيبتين في شكل أوليغومر مع القياس الكيميائي الصحيح للوحدة الفرعية ، مما يوفر تقدما مهما على العديد من الدراسات السابقة في المختبر التي تعتمد على وحدات فرعية واحدة من السيبتين. على الرغم من أن بعض السيبتين في سياقات محددة يمكن أن تعمل كوحدة فرعية واحدة2 ، إلا أن مجموعة الأدبيات الحالية تشير بقوة إلى أنه في الخلايا الحيوانية ، تعمل السيبتين في الغالب في المجمعات 9,58. لذلك ، فإن استخدام oligomers-hetero-oligomerss سابقة التكوين ، مثل تلك الموصوفة في هذه الورقة وغيرها10،11،18،32،35،36،37 ، له أهمية كبيرة لدراسة الخصائص الهيكلية والفيزيائية الحيوية للسبتين عبر المختبر إعادة التكوين لتشريح وظائفهم في الخلية. علاوة على ذلك ، فإن السيبتين عبارة عن بروتينات ذاتية التجميع مع العديد من شركاء التفاعل ، بما في ذلك الغشاء والهيكل الخلوي ، مما يجعلها ذات أهمية كبيرة للبيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى59،60،61 ودراسات التغيرات التي يسببها البروتين في الخصائص الفيزيائية الحيوية للغشاء مثل الانحناء42،62،63.

تم وصف الهيكل الخلوي بشكل كلاسيكي بأنه نظام مكون من ثلاثة مكونات يتكون من خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة والخيوط الوسيطة 1 ، ولكن في الآونة الأخيرة ، تم الاعتراف بالسيبتين كمكون رابع للهيكل الخلوي1. Septins هي عائلة من البروتينات المرتبطة ب GTP المحفوظة في حقيقيات النوى2. تشارك Septins في العديد من الوظائف الخلوية مثل انقسام الخلية3 ، والتصاق الخلية4 ، وحركة الخلية5 ، والتشكل6 ، والعدوى الخلوية7 ، وإنشاء وصيانة قطبية الخلية8. على الرغم من وظائفها المهمة ، فإن كيفية مشاركة السيبتين في مثل هذه العمليات غير مفهومة بشكل جيد.
تنقسم عائلة بروتينات السيبتين إلى عدة مجموعات فرعية (أربعة أو سبعة ، حسب التصنيف) بناء على تشابه تسلسل البروتين2. يمكن لأعضاء العائلات الفرعية المختلفة تشكيل مجمعات قليلة القسيمات غير متجانسة ، وهي اللبنات الأساسية للخيوط والتي بدورها تتجمع في هياكل أعلى مرتبة مثل الحزم والحلقات والشبكات1،9،10،11،12. ينشأ المزيد من التعقيد الجزيئي من وجود متغيرات لصق مختلفة ، مثال على ذلك هو SEPT9 البشري ، حيث يوجد دليل على وظائف محددة لمتغيرات لصق مختلفة13،14،15. بالإضافة إلى ذلك ، يعتمد طول oligomers غير المتجانسة على الأنواع ونوع الخلية. على سبيل المثال ، تشكل Caenorhabditis elegans septins tetramers 16 ، وتشكل سبتين ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر سداسيات 17 (الشكل 1A) ، وتشكل Saccharomyces cerevisiae septins أوكتامير18 ، وتشكل السيبتين البشرية كلا من السداسي والأوكتامات 19 (الشكل 1 أ). إن قدرة أشكال السيبتين ، ومتغيرات اللصق ، والسيبتين المعدلة بعد الترجمة من نفس الفصيلة الفرعية على استبدال بعضها البعض في المركب والوجود (المشترك) للأوليغومرات غير المتجانسة ذات الحجم المختلف جعلت من الصعب تحديد الوظائف الخلوية لمختلف مجمعات قلة القلة-غير المتجانسة12.
قدرة أخرى مثيرة للاهتمام من septins هي قدرتها على التفاعل مع العديد من الشركاء ملزمة في الخلية. تربط Septins غشاء البلازما والعضيات الغشائية أثناء الطور البيني وانقسام الخلايا20،21،22. في الخلايا المنقسمة ، تتعاون السيبتين مع أنيلين 23،24،25 والأكتين والميوسين أثناء السيتوكينات26،27. في المراحل المتأخرة من التحلل الخلوي ، يبدو أن السيبتين ينظم مجمعات الفرز الاندوسومية المطلوبة لنظام النقل (ESCRT) لانقطاع منتصف الجسم28. بالإضافة إلى ذلك ، هناك أيضا دليل على وجود السيبتين الموجود على قشرة الأكتين وألياف إجهاد الأكتين للخلايا في خلايا الطورالبيني 29،30،31. في أنواع معينة من الخلايا ، يربط السيبتين أيضا الهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة32,33 وينظمه.
كل هذه الميزات تجعل السيبتين نظام بروتين مثير للاهتمام للغاية للدراسة ، ولكنه أيضا نظام صعب. إن الجمع بين العدد الكبير من الوحدات الفرعية للسيبتين (13 جينا في البشر دون احتساب متغيرات لصق2) مع إمكانية وحدات فرعية من السيبتين من نفس الفصيلة الفرعية لاستبدال بعضها البعض وتشكيل أوليغومرات غير متجانسة مختلفة الحجم يجعل من الصعب استخلاص استنتاج حول الوظيفة الخلوية لسيبتين معين عن طريق التلاعب الجيني. علاوة على ذلك ، فإن التفاعلات المتعددة للسبتين تجعل تفسير تأثيرات أدوات البحث الشائعة مثل الأدوية34 الموجهة إلى مكونات الهيكل الخلوي أو الغشاء مهمة صعبة.
تتمثل إحدى طرق التغلب على هذا الموقف في استكمال البحث في الخلايا بإعادة تكوين السيبتين في المختبر (بدون خلايا). تسمح إعادة التكوين في المختبر بعزل نوع واحد من أوليغومرات السيبتين غير المتجانسة مع تكوين وحدة فرعية محددة وطول18،35،36،37. يمكن بعد ذلك دراسة هذا المركب في بيئة خاضعة للرقابة ، إما بمفردها لاكتشاف الخصائص الهيكلية والفيزيائية الكيميائية الأساسية للسبتين 38،39،40 ، أو بالاشتراك مع الشركاء المرغوبين مثل الأغشية الحيوية النموذجية 11،41،42 ، أو خيوط الأكتين 10،27 ، أو الأنابيب الدقيقة 32،36 لفك تشفير طبيعة التفاعلات.
لذلك ، فإن الطريقة الموثوقة لتنقية مجمعات السيبتين المختلفة بكفاءة أمر حيوي لأبحاث السيبتين. ومع ذلك ، حتى باستخدام نفس البروتوكول ، يمكن أن تعطي عمليات التنقية المختلفة بروتينات ذات نشاط / وظيفة مختلفة أو حتى سلامتها. بالنسبة للبروتينات المتاحة تجاريا مثل الإنزيمات ، يتم التحقق من صحة الوظيفة والنشاط الأنزيمي بعناية43. قد يكون تنفيذ مراقبة الجودة الدقيقة للبروتينات الهيكلية الخلوية أو الهيكلية مثل السيبتين أمرا صعبا ، ولكن من الضروري إجراء تجارب عبر المختبرات قابلة للمقارنة.
تصف هذه الورقة طريقة قوية لتنقية السيبتين المؤتلف عالي الجودة في شكلها غير المتجانس قليل القسيمات بناء على التعبير المتزامن لمتجهين يحتويان على تركيبات أحادية أو ثنائية السيسترونيك (الجدول 1) في خلايا الإشريكية القولونية. تتكون الطريقة من نهج كروماتوغرافي تقارب من خطوتين لالتقاط أوليغومرات سيبتين غير متجانسة تحتوي على كل من سيبتين 6 علامات وسيبتين Strep-II (الشكل 1B ، C). تم استخدام هذا البروتوكول ، الذي تم وصفه لأول مرة في Iv et al.10 ، لتنقية سداسي سبتين ذبابة الفاكهة 11،27،35 ، وسداسي سيبتين البشري10 ، والعديد من أوكتامات السيبتين البشرية التي تحتوي على أشكال أصلية مختلفة (isoform 1 و 3 و 5) 10،32 أو أشكال SEPT9 المتحولة 32 . علاوة على ذلك ، يتم تقديم وصف لمجموعة من التقنيات لتقييم جودة السيبتين المنقى. أولا ، يتم التحقق من سلامة والقياس المتكافئ الصحيح للوحدات الفرعية للحاجز باستخدام تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي والمجهر الإلكتروني للإرسال (TEM). بعد ذلك ، يتم فحص وجود oligomers غير المتجانسة للكتلة الجزيئية الصحيحة ووجود المونومرات أو oligomers الأصغر التي تشير إلى عدم الاستقرار المعقد عن طريق الرحلان الكهربائي الأصلي والقياس الضوئي الشامل عبر الفحص المجهري للتشتت التداخلي (iSCAT). أخيرا ، تتكون الخطوة الأخيرة من تقييم نشاط البلمرة للسبتين باستخدام الفحص المجهري الفلوري و TEM.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2.jpg"> الشكل 1: استراتيجية التنقية. (أ) مخططات أوليغومرات سيبتين غير المتجانسة الموجودة في الخلايا البشرية (اليسرى) وذبابة الفاكهة (اليمنى). تشير الأرقام إلى وحدات فرعية من septin من المجموعات المشار إليها ، وتشير P إلى الفول السوداني. يمكن أن يكون SEPT9 البشري أيا من أشكاله المتساوية. الوحدات الفرعية septin لها شكل غير متماثل وترتبط طوليا بواجهتين متميزتين ، NC: NC وواجهة G: G ، كما يشار إليها ب NC و G ، على التوالي ، أعلى السداسي البشري. (ب، ج) رسم تخطيطي لاستراتيجية الكروماتوغرافيا المكونة من خطوتين ، موضحة ل (B) سداسيات السيبتين البشرية و (C) الأوكتامرات. يشير H إلى علاماته ، بينما يشير S إلى علامات Strep-II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>488nm laser combiner iLAS2</td>
			<td>Gataca</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488nm Sapphire laser lines</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4k X 4k F416 CMOS camera</td>
			<td>TVIPS</td>
			<td></td>
			<td>For JEM-1400plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x sample buffer nativePAGE</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (TROLOX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>To prevent blinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 M1</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>1680311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Type-B, 300 mesh EM grid</td>
			<td>Ted pella</td>
			<td>01813-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Type-B, 300 mesh EM grid</td>
			<td>Electron micoscopy sciences</td>
			<td>CF300-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass #1.5H</td>
			<td>Thorslabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1-M1 confocal unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desthiobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1411-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibtor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>481761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP, 5 mL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>29-0588-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iLAS2 azimuthal TIRF illumination system&#160;</td>
			<td>Gataca</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1202-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Protein Gel Stain</td>
			<td>Westburg Life Sciences</td>
			<td>EP ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>10849040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 888 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EM-CCD&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400plus</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td>TEM microscope TUDelft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kappa-cassein&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-6X1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971-10G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746452-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylecllulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8074844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ system (Integral 10)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td></td>
			<td>I-water dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean TGX gels</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativeMark unstained protein standard</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC0725</td>
			<td>For iSCAT and Native gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE 4-16% GELS</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN1002BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE Running Buffer kit</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E&#160;</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nr. 1 Menzel coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo &#215;100/1.45 NA oil immersion objective</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(L-lysine)-graft-biotinylated PEG (PLL-PEG)</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>CHF560.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution 0.01%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td>For iSCAT glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for native gels</td>
			<td>CONSORT</td>
			<td>S/N 71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWERPAC UNIVERSAL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>042BR31206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td>oxygen scavenger - enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03930590-50MG</td>
			<td>oxygen scavenger - reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quemesa camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Tecnai Spirit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refeyn OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample buffer, laemmli 2x concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-10vl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon gaskets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL103250-10EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes 30k MWCO 3mL</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>66381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1441-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap HP, 1 mL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>28-9075-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit microscope</td>
			<td>Thermo Scientific, FEI</td>
			<td></td>
			<td>TEM microscope Institute Curie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0918-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/Glyine/SDS buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6, 30,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0622</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and quality control of recombinant septin complexes for cell-free reconstitution

Septins هي عائلة من البروتينات الملزمة ل GTP حقيقية النواة المحفوظة والتي يمكن أن تشكل خيوط هيكلية خلوية وهياكل أعلى مرتبة من مجمعات قليلة القسيمات غير المتجانسة. تتفاعل مع المكونات الهيكلية الخلوية الأخرى وغشاء الخلية للمشاركة في الوظائف الخلوية المهمة مثل الهجرة وانقسام الخلايا. نظرا لتعقيد التفاعلات العديدة للسبتين ، والعدد الكبير من جينات السيبتين (13 في البشر) ، وقدرة السيبتين على تكوين مجمعات قليلة القسيمات غير المتجانسة مع تركيبات وحدات فرعية مختلفة ، فإن إعادة التكوين الخالي من الخلايا هي استراتيجية حيوية لفهم أساسيات بيولوجيا السيبتين. تصف هذه الورقة أولا طريقة لتنقية السيبتين المؤتلف في شكلها غير المتجانس قليل القسيمات باستخدام نهج كروماتوغرافيا التقارب المكون من خطوتين. بعد ذلك ، يتم تفصيل عملية مراقبة الجودة المستخدمة للتحقق من نقاء وسلامة مجمعات السيبتين. تجمع هذه العملية بين الرحلان الكهربائي الهلامي الأصلي وتغيير طبيعته ، والمجهر الإلكتروني السلبي للبقع ، والفحص المجهري للتشتت التداخلي. أخيرا ، يتم تقديم وصف لعملية التحقق من قدرة البلمرة لمجمعات السيبتين باستخدام المجهر الإلكتروني السلبي للبقع والمجهر الفلوري. هذا يدل على أنه من الممكن إنتاج سداسي سيبتين بشري عالي الجودة وأوكتامير يحتوي على أشكال مختلفة من septin_9 ، بالإضافة إلى سداسي ذبابة الفاكهة .

كما هو مذكور في البروتوكول ، تم زراعة 5 لترات من خلايا الإشريكية القولونية التي تم تحويلها مع البلازميدات المعبرة عن السيبتين ، وتم تحفيز التعبير عن السيبتين بإضافة IPTG. بعد 3 ساعات ، تم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة تعليقها في محلول التحلل ، وتحليلها بواسطة صوتنة. ثم تم توضيح المحللة عن طريق الطرد المركزي ، وتم تطبيق المحلول الموضح على عمود HisTrap (الشكل 2 أ). بعد التنقية الأولى ، تم تجميع الكسور المحتوية على السيبتين وتطبيقها على عمود StrepTrap (الشكل 2 ب). ينتج هذا عادة حوالي 3-5 مل من مركب السيبتين ~ 1 ميكرومتر. قبل تجميع الكسور المحتوية على السيبتين ، يمكن استخدام الرحلان الكهربائي الهلامي للتحقق من سلامة الوحدات الفرعية للسيبتين والنسبة المتكافئة بين الوحدات الفرعية المختلفة للسيبتين التي تشكل المجمع. (الشكل 3 أ). إذا أظهر الجل نطاقات مكثفة مماثلة تتوافق مع الأوزان الجزيئية (الجدول 3) للوحدات الفرعية للحاجز ، فيمكن متابعة البروتوكول. إذا لم يكن كذلك ، فمن المستحسن بدء البروتوكول مرة أخرى. في المثال الموضح لأوكتامير السيبتين البشري مع SEPT9_i1 ، يوضح الشكل 3A بوضوح النطاقات المقابلة ل SEPT9_i1 و SEPT6 و SEPT7 و SEPT2 (بالترتيب من أعلى إلى أسفل) بكثافة مماثلة ؛ كان فاصل الثقة 99٪ للكثافة الطبيعية 1.128 ± 0.048 ل SEPT2 ، و 1.092 ± 0.034 ل SEPT6 ، و 1.108 ± 0.040 ل SEPT7 ، و 1.067 ± 0.029 ل SEPT9. إذا تم وضع علامة على SEPT2 ب msfGFP ، فسوف يتحول إلى ما دون SEPT9_i1. اعتمادا على نظام الرحلان الكهربائي المستخدم ووجود علامة TEV-Strep الطرفية C ل SEPT7 (مما يجعلها تهاجر بشكل أبطأ من SEPT7 غير الموسومة) ، تندمج نطاقات SEPT7 و SEPT6 أحيانا بسبب أوزانها الجزيئية المتشابهة. الخطوة التالية هي تجميع الكسور وتحليلها ضد المخزن المؤقت للسبتين باستخدام DTT. بعد غسيل الكلى ، إذا كان التركيز منخفضا جدا (<2 ميكرومتر) أو كانت هناك حاجة إلى تركيز أعلى للتجارب ، فيمكن تضمين خطوة تركيز ، كما هو موضح في البروتوكول. عادة ما تشير التركيزات التي تقل عن 1 ميكرومتر إلى جودة وظيفية سيئة للسبتين. يعمل تركيز مركب السيبتين النهائي بين 3.5 ميكرومتر و 7 ميكرومتر بشكل جيد لمعظم المقايسات في المختبر . عادة ما يتم الحصول على هذه التركيزات عندما يصل الحجم بعد التركيز إلى 0.5-1 مل.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig02.jpg"> الشكل 2: مثال على الكروماتوجرام المقابل لتنقية octamers_9i1 الحاجز البشري الداكن . (أ) كروماتوجرام عمود HisTrap. بعد ذروة شطف السيبتين ، لا يعود الامتصاص إلى الصفر ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى وجود إيميدازول في المخزن المؤقت. ذهب الجزء المجمع من بداية ذروة الشطف حتى استقر الامتصاص عند حوالي 250 مل. (ب) كروماتوجرام عمود StrepTrap. ذهب الجزء المجمع من بداية ذروة الشطف حتى عاد الامتصاص إلى حوالي 0 عند 50 مل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
لمواصلة مراقبة الجودة ، تم إجراء رحلان كهربائي أصلي ، كما هو موضح في البروتوكول ، (الشكل 3 ب). في المواد الهلامية ، يمكن ملاحظة شريط رئيسي يتوافق مع oligomers غير المتجانسة السليمة ، وعادة ما يمكن ملاحظة شريط ثانوي يتوافق مع dimers. تم العثور على السداسيات البشرية أعلى قليلا من نطاق علامة 242 كيلو دالتون ، بينما تم العثور على الأوكتامات فوق النطاق 480 كيلو دالتون ، فوق كتلتها الجزيئية المحسوبة. تم التحقق من موقع هذه النطاقات من خلال تحليل اللطخة الغربية لمستخلصات الخلايا حقيقية النواة32. وضع العلامات مع الأزواج msfGFP كل سبتمبر 2 مع بروتين msfGFP. يؤدي هذا إلى زيادة الوزن الجزيئي لمجمعات السيبتين بمقدار 53.4 كيلو دالتون (جزيء 26.7 كيلو دالتون / مللي جاويد). ومع ذلك ، على هلام الكهربائي الأصلي ، لا يمكن تمييز الوزن الجزيئي الظاهر للمجمعات الموسومة ب msfGFP عن تلك الخاصة بالمجمعات غير الموسومة.
تقنية تكميلية لاختبار ما إذا كانت معقدات السيبتين سليمة هي القياس الضوئي الشامل بواسطة الفحص المجهري iSCAT. يراقب iSCAT تشتت الضوء للجزيئات التي تهبط على شريحة زجاجية يتم تضخيمها عن طريق التداخل مع الضوء المرجعي ، وعادة ما يكون انعكاس الليزر على الجزء السفلي من الشريحة الزجاجية. بعد ذلك ، يتم استخدام نهج طرح الخلفية لإعطاء تباين للجسيمات. بسبب هذا التصحيح ، تظهر الإشارة قيما إيجابية وسالبة اعتمادا على ما إذا كانت الجسيمات تهبط على الزجاج أو تبتعد عنه49. تتناسب الإشارة المكتشفة طرديا مع الوزن الجزيئي للبروتينات50. ومن ثم، يمكن لمعايرة الإشارة إلى الكتلة بمعيار كتلة أن تحدد كتلة بروتينات العينة. يوضح الشكل 3C مثالا على أوكتامات السيبتين البشرية التي تحتوي على SEPT9_i1. معظم الجسيمات المفردة المكتشفة (~ 50٪) ذات وزن جزيئي متوقع للأكتامات الكاملة التي تحتوي على SEPT9_i1 (423 كيلو دالتون) (الشكل 3C). هناك أيضا جزيئات ذات كتل تتراوح بين 150-300 كيلو دالتون ، ولكن لم يلاحظ وجود ذروة واضحة ، مما يشير إلى احتمال وجود أنواع أخرى من السيبتين بوفرة منخفضة. وبالمثل ، فإن معظم الجسيمات المفردة المكتشفة لسداسي ذبابة الفاكهة الموسوم ب mEGFP لها وزن جزيئي متوقع للسداسيات السليمة (361 كيلو دالتون) (الشكل 3D). تشير قمة واضحة إضافية عند 241 كيلو دالتون إلى وجود رباعيات مستقرة تحتوي على بروتينين من الفول السوداني ، أحدهما DSep1 والآخر mEGFP-DSep2. أخيرا ، تظهر كل من مجمعات سيبتين البشرية والذبابة ذروة حوالي 80 كيلو دالتون يمكن أن تكون مزيجا من المونومرات و dimers ، وربما يتم تضخيمها بواسطة أثر DTT أو أي جزيء صغير آخر يتجمع ، مما يدل على ذروة في الجانب الإيجابي من المؤامرة45.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2.jpg"> الشكل 3: أمثلة على نتائج مراقبة جودة oligomer . (أ) مثال على جل تغيير طبيعة يوضح أجزاء مختلفة من ذروة الشطف من تنقية octamers_9i1 السيبتين البشري الداكن. (ب) مثال على الرحلان الكهربي الأصلي لمعقدات سبتين مختلفة. (ج، د) أمثلة مختلفة لنتائج الرسم البياني للقياس الضوئي الشامل عند 12.5 نانومتر من معقدات السيبتين: (ج) octamers_9i1 سيبتين الإنسان الداكن و (د) DSep1-msfGFP سداسي سبتين ذبابة الفاكهة . الخطوط هي نوبات غاوسية. (ه) صورة TEM لحاجز بشري مظلم 25 نانومتر octamers_9i1 في عازلة السيبتين. شريط المقياس = 200 نانومتر. (F) صورة متوسط الفئة ل SEPT2-msfGFP octamers_9i1 سيبتين البشري. تكون علامات msfGFP مرئية ككثافات غامضة على الطرفين. شريط المقياس = 10 نانومتر. اللوحتان (E) و (F) هما حقوق الطبع والنشر لشركة علماء الأحياء وقد تم تكييفهما من Iv et al.10 بإذن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
بالنظر إلى أن كلا من المواد الهلامية الأصلية و iSCAT توفر معلومات متوسطة المجموعة فقط ، فقد تم استخدام المتوسط الطبقي لصور المجهر الإلكتروني النافذ لأوليغومرات سيبتين واحدة للتحقق من سلامة ونقاء المعقدات عن طريق التصور المباشر. في صور TEM لمجمعات septin في المخزن المؤقت septin ، يمكن ملاحظة قضبان بطول 24 نانومتر (hexamers) أو 32 نانومتر (أوكتامات). يمكن رؤية مثال على أوكتامر سيبتين بشري يحتوي على SEPT9_i1 في الشكل 3ه. عند حساب متوسط الفئة ، يمكن ملاحظة كل وحدة فرعية وحسابها ، كما هو موضح في الأوكتامر البشري الموسوم ب msfGFP مع SEPT9_i1 في الشكل 3F. في حالة تسمية oligomer بالفلورسنت ، يمكن ملاحظة كثافات إضافية تتوافق مع SEPT2-msfGFP في نهاية القضبان (الشكل 3F).
يثبت الجمع بين التقنيات المذكورة أعلاه أنه يمكن تنقية الأوكتامرات (أو السداسيات) ذات النسبة المتكافئة الصحيحة والنقاء العالي باستخدام البروتوكول الموصوف. أخيرا ، آخر فحص لمراقبة الجودة هو لوظائف مجمعات السيبتين من حيث قدرتها على البلمرة. في وجود تركيز منخفض للملح (<150 mM KCl مع المخزن المؤقتالموصوف 9) ، إذا لم تكن السيبتين في وجود بروتينات أخرى أو أغشية دهنية سالبة الشحنة ، فإنها تتجمع ذاتيا في حزم9. يتم منع السيبتين من البلمرة عن طريق الاحتفاظ بها في مخزن التخزين المؤقت ، والذي يحتوي على تركيز عال (300 مللي مول). ثم يتم تخفيف أوليغومرات السيبتين غير المتجانسة بنسبة حجم 1: 6 في مخزن مؤقت من نفس التركيبة ولكن بدون KCl لتحقيق تركيز KCl نهائي يبلغ 50 mM. للقيام بالتصوير الفلوري ، يتم استكمال هذا المخزن المؤقت بنظام كسح الأكسجين للحماية من التبييض الضوئي وبمثبط وامض. في الفحص المجهري TIRF ، يمكن ملاحظة مجموعات صغيرة من البروتينات داخل حقل TIRF الضحل (~ 100 نانومتر; الشكل 4 أ ، ب). على المجهر متحد البؤر ، يمكن رؤية مجموعات كبيرة من الهياكل الخيطية تطفو أعلى في المحلول (الشكل 4 ج). أخيرا ، مع TEM ، يمكن ملاحظة حزم صغيرة من السيبتين (الشكل 4D) ، المقابلة للمجموعات التي لاحظها TIRF ، والحزم الكبيرة (الشكل 4E) ، المقابلة للهياكل التي لاحظها الفحص المجهري متحد البؤر. تكشف الأجزاء الداخلية من الشكل 4D ، E أن كلا النوعين من الهياكل يتكون من خيوط طويلة ورفيعة تعمل بالتوازي ، وتشكل حزما ذات نهايات مدببة. معا ، تثبت صور التألق و TEM أن مجمعات السيبتين المنقاة يمكن أن تتبلمر إلى خيوط ، والتي بدورها تتجمع ذاتيا في حزم.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig04.jpg"> الشكل 4: أمثلة على نتائج مراقبة جودة قدرة البلمرة. (أ) صورة TIRF ل 300 نانومتر من سداسي السيبتين البشري (10٪ سداسيات موسومة ب msfGFP) في fluoSPB. (ب) صورة TIRF لأوكتامات سبتين بشرية 300 نانومتر تحتوي على SEPT9_i1 (10٪ MSFGFP المسمى octamers9_i1) في fluoSPB. (C) إسقاطات الكثافة القصوى البؤرية لمداخن Z عبر ~ 30 ميكرومتر مع 0.5 ميكرومتر من تباعد 300 نانومتر من octamers_9i3 السيبتين البشري في fluoSPB. (أ - ج) شريط المقياس = 10 ميكرومتر وتدرج الرمادي المقلوب. (د، ه) مثال على صور TEM ل (D) حزم صغيرة و (E) كبيرة من octamers_9i1 السيبتين البشري في darkSPB. تظهر الأجزاء الداخلية المناطق التي يمكن فيها ملاحظة خيوط واضحة تعمل بالتوازي داخل الحزمة. قضبان المقياس = 500 نانومتر. اللوحات (C-E) هي حقوق الطبع والنشر لشركة علماء الأحياء وقد تم تكييفها من Iv et al.10 بإذن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
الجدول 1: قائمة البلازميدات. البلازميدات لتنقية أوليغومرات السيبتين باتباع هذا البروتوكول. تم إيداع جميع البلازميدات في Addgene (العمود الأول). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%201_V2.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
الجدول 2: قائمة المخازن المؤقتة. التراكيب العازلة المستخدمة لتنقية ومراقبة جودة oligomers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%202(1).xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
الجدول 3: الأوزان الجزيئية ومعاملات الانقراض. قائمة الأوزان الجزيئية (MW) ومعاملات الانقراض البصري (ε) عند طول موجي 280 نانومتر محسوبة باستخدام ProtParam بناء على تسلسل المجمع ، بافتراض الاندماج الخطي لوحدات السيبتين الفرعية ، ومعقدات السيبتين المختلفة ، والوحدات الفرعية الفريدة من نوعها (MW فقط) التي يمكن تنقيتها باستخدام البلازميدات المدرجة في الجدول 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%203.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution at JoVE.com

Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution

تعد إعادة تكوين البروتينات الهيكلية الخلوية في المختبر أداة حيوية لفهم الخصائص الوظيفية الأساسية لهذه البروتينات. تصف هذه الورقة بروتوكولا لتنقية وتقييم جودة معقدات السيبتين المؤتلفة ، والتي تلعب دورا مركزيا في انقسام الخلايا والهجرة.

تنقية ومراقبة جودة معقدات السيبتين المؤتلفة لإعادة التكوين الخالي من الخلايا

Septins are a family of conserved eukaryotic GTP-binding proteins that can form cytoskeletal filaments and higher-order structures from hetero-oligomeric ...

هذا البروتوكول يجعل من الممكن تنقية مجمعات السيبتين عالية الجودة ، وهذا ضروري لدراسة الأدوار العديدة للسبتين في الخلية. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي توليف إجراء بسيط لتنقية السيبتين عالي الجودة باستخدام بلازميدات Addgene. يصعب دراسة السيبتين في الخلايا بسبب تفاعلاتها العديدة.تساعدنا إعادة تكوين الكبريت على فصل هذا التعقيد من خلال دراستها في نظام بسيط. نوصي بإجراء تنقية في يوم واحد لمنع التدهور. في تجربتنا ، سيؤدي ذلك إلى زيادة عمر وجودة البروتين.للبدء ، قم بتنمية الثقافة البكتيرية المحولة عند 37 درجة مئوية في حاضنة شاكر حتى تصل الكثافة البصرية عند طول موجي يبلغ 600 نانومتر إلى اثنين إلى ثلاثة للسبتين غير المسمى ، أو 0.6 إلى 0.8 ل msfGFP أو mEGFP المسمى septins. بعد الحضانة ، قم بتحفيز تعبير البروتين عن طريق إضافة IPTG إلى تركيز نهائي قدره 0.5 مليمولار واحتضان الخلايا التي تعبر عن أوليغومرات السيبتين غير المصنفة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات ، أو الخلايا التي تعبر عن msfGFP المسمى oligomers غير المتجانسة عند 17 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ثم بيليه الخلايا في 4،000 مرة G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.تخلص من المادة الطافية وقم بإذابة الحبيبات في 100 ملليلتر من محلول التحلل لتحلل الخلايا. بعد ذلك ، استخدم صوتي طرف بسعة 30٪ لصوتنة الخلية. توضيح خلية المحللة عن طريق الطرد المركزي في 20،000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية وحفظ طاف.اختياريا ، خذ عينة لتغيير طبيعة الكهربائي كما هو موضح في المخطوطة. للحصول على كروماتوغرافيا تقارب للسبتين الموسومة به ، قم بموازنة عمود كروماتوغرافيا النيكل عالي الأداء المعبأ مسبقا مع جميع المخازن المؤقتة المطلوبة. قم بتحميل المادة الطافية الموضحة وصولا إلى العمود وابدأ نظام الكروماتوغرافيا.ثم قم بالتخلص من مجمعات السيبتين باستخدام محلول شطف HisTrap بنسبة 50٪ بمعدل تدفق يبلغ ملليلتر واحد في الدقيقة. للحصول على تركيز إيميدازول من 250 مليمولار ، وجمع الكسور 0.5 ملليلتر. الآن راقب الامتصاص البصري للشطف عند 280 نانومتر باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل البروتين السريع واختر الكسور التي تحتوي على مجمعات السيبتين.بالنسبة لكروماتوغرافيا التقارب للبروتينات الموسومة Strep-II ، قم بموازنة عمود كروماتوغرافيا StrepTactin sepharose عالي الأداء معبأ مسبقا مع عازلة septin. قم بتحميل السيبتين الذي يحتوي على الكسور المستردة من عمود النيكل بمعدل ملليلتر واحد في الدقيقة وابدأ نظام الكروماتوغرافيا. ثم اغسل البروتين المرتبط وقم بتخفيف مجمعات السيبتين باستخدام محلول شطف StrepTrap بنسبة 100٪ بمعدل تدفق يبلغ ملليلتر واحد في الدقيقة.للحصول على تركيز 2.5 مليمولار ديسثيوبيوتين ، اجمع 0.5 ملليلتر من الكسور. اختر الكسور التي تحتوي على معقدات السيبتين كما هو موضح بالامتصاص البصري للشطف عند 280 نانومتر يتم رصدها عبر الإنترنت باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل البروتين السريع. بعد إزالة ديسثيوبيوتين عن طريق غسيل الكلى ، قم بتجميع مجمعات البروتين إلى حجم القسمة المطلوب ، وقم بتجميد القسمة ، وقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.بالنسبة للفحص المجهري للتشتت التداخلي ، اغسل الشرائح الزجاجية رقم 1.5 عن طريق صوتنها في منظف بالموجات فوق الصوتية لمدة خمس دقائق في الماء ، الأيزوبروبانول ، ومرة أخرى في الماء منزوع الأيونات. جفف شريحتين زجاجيتين بتيار لطيف من غاز النيتروجين. ثم ضع قطرة سبعة ميكرولتر من محلول Poly-L-Lysine بنسبة 0.01٪ في وسط إحدى الشرائح وضع مركز الشريحة الأخرى أعلى قطرة Poly-L-Lysine ، مع توجيه الشريحتين بشكل متعامد لسهولة الفصل.بعد الحضانة لمدة 30 ثانية ، اغسل الشريحة عن طريق غمرها في دورق يحتوي على ماء منزوع الأيونات مرة واحدة وتطبيق تيار من الماء مباشرة مرتين. قم بتجفيفها بتدفق غاز النيتروجين ويمكن تخزين هذه الشرائح لمدة ستة أسابيع تقريبا في درجة حرارة الغرفة في الظروف الجافة. قبل التجربة ، قم بقص قطعة من اثنين في اثنين ، أو ثلاثة في اثنين ، أو ثلاثة في ثلاثة حشيات وألصقها على الجزء المعالج من Poly-L-Lysine من شريحة زجاجية ، وتجنب الشريحة الزجاجية والحشيات التي تلامس أي سطح متسخ عن طريق وضع الشريحة على مناديل ممسحة خفيفة.الآن اضغط على الحشيات بطرف ماصة لإلصاقها بالبلاستيك الواقي الموجود على الحشيات. بعد ذلك ، قم بتسخين المخزن المؤقت للحاجز إلى درجة حرارة الغرفة. قم بإذابة البروتينات في متناول اليد واحتفظ بها على الجليد بعد ذلك.ثم ضع الشريحة مع حشيات على نظام القياس الضوئي للكتلة التجارية التي تحتوي على 19 ميكرولتر من المخزن المؤقت septin وقم بتركيز المجهر باستخدام خيار التركيز التلقائي. أعد التركيز باستخدام الإعدادات الجديدة ، باستخدام خيار التركيز البؤري التلقائي. لإنشاء مجلد مشروع، انقر فوق ملف متبوعا بمشروع جديد، ولتحميل مجلد مشروع لتخزين البيانات، انقر فوق ملف متبوعا بتحميل مشروع.ثم ماصة ميكرولتر واحد من العينة إلى 19 ميكرولتر من قطرة الحاجز المؤقت. امزج ، وأثناء الخلط ، تجنب لمس أي شيء لمنع حركة الشريحة. ثم قم بتسجيل مقطع فيديو بإطار 6،000 بالنقر فوق تسجيل.قم بتحليل مقاطع الفيديو باستخدام برنامج الشركة المصنعة للحصول على توزيع كتلة البروتين. إذا تداخلت قمم أحجام مختلفة من السيبتين غير المتجانسة كثيرا أو تم اكتشاف الكثير من الأحداث ، فقم بتقليل تركيز السيبتين النهائي وقياسه مرة أخرى. وعندما لا يتم قياس عدد كاف من الجزيئات المفردة ، قم بزيادة تركيز السيبتين والقياس مرة أخرى.لتحليل السيبتين ، قم بإعداد 5X darkSPB ومزيج سيبتين يتكون من 100٪ سيبتين داكن بتركيز أعلى بست مرات من التركيز النهائي المطلوب في محلول السيبتين وواحد مليمولار ديثيوثريتول. ثم بلمرة السيبتين عن طريق خلط الماء ، 20٪ 5X darkSPB و 16.67٪ مزيج سيبتين ، بهذا الترتيب المحدد ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف ثلاثة إلى خمسة ميكرولترات من العينة إلى شبكة مجهرية إلكترونية متوهجة مفرغة واحتضانها لمدة دقيقة واحدة.الآن ، اغسل الشبكة مرتين عن طريق إضافة قطرة من المخزن المؤقت darkSPB وامتصاص السائل بورق ترشيح. يغسل مرة واحدة بالماء ويحتضن لمدة 30 ثانية مع 2٪ أسيتات اليورانيل. بعد ذلك ، امسح البقعة وجفف العينة في الهواء لبضع دقائق.ثم تخيل حزم septin عند 120 كيلوفولت والتكبير بين 5،000X و 60،000X مع إلغاء التركيز من واحد إلى اثنين ميكرومتر. أظهر كروماتوجرام HisTrap و StrepTrap أن الجزء المجمع ذهب من بداية ذروة الشطف حتى استقر الامتصاص عند حوالي 250 ملليلتر و 50 ملليلتر على التوالي. أظهرت عصابات السيبتين شدة مماثلة في تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي الهلامي ، مما يشير إلى أن السيبتين سليمة.في الرحلان الكهربائي الأصلي ، لوحظ النطاق الرئيسي المقابل ل oligomers غير المتجانسة السليمة ونطاق ثانوي يتوافق مع التشذيب أو tetramers. لا يمكن تمييز الوزن الجزيئي الظاهر للمجمعات الموسومة msfGFP عن تلك الخاصة بالمجمعات غير الموسومة. كشف القياس الضوئي الشامل عن أوكتامات سليمة وسداسي من السيبتين.أشارت ذروة إضافية عند 241 كيلو دالتون إلى وجود بروتينين من الفول السوداني ، DSep1 و mEGFP-DSep2. أظهرت صور المجهر الإلكتروني النافذ لمجمعات السيبتين قضبان من السداسيات والأخطفات. تظهر علامات msfGFP ككثافات غامضة على الطرفين في octamers_9i1 سيبتين البشري 2 msfGFP.يمكن ملاحظة مجموعات صغيرة من البروتينات في حقل TIRF الضحل. كشف الفحص المجهري متحد البؤر عن مجموعات كبيرة من الهياكل الخيطية العائمة. أظهر المجهر الإلكتروني النافذ حزم سيبتين صغيرة وكبيرة تتوافق مع العناقيد التي لاحظها المجهر الفلوري الانعكاسي الداخلي الكلي والمجهر متحد البؤر.نوصي بالعمل على الجليد في جميع الأوقات أثناء عمليات التنقية وإضافة كواشف جديدة نحددها في البروتوكول. نحن مهتمون بتفاعلات السيبتين في سياق التحريك الخلوي. قمنا بإعادة تشكيل السيبتين مع الأغشية الحديثة الأكتين والأنابيب الدقيقة لدراستها بالفحص المجهري والعديد من المقايسات الفيزيائية الحيوية.نستخدم السيبتين المنقى لدراسة كيفية تفاعل السيبتين مع خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة والليبيدات. ونستخدم أيضا الحاجز المنقى لبناء خلايا اصطناعية حيث تسهل الحاجز الانقسام الخلوي.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

الأفقي جل الكهربائي للكشف عن تعزيز المجمعات البروتين رنا

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

إعادة تشكيل ذبذبات دورة الخلية في ميكرومولسيونس مستخرجات البيض خالية من الخلية النمو

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

انجذاب تطهير المجمعات البروتين ترانسلوكون بلاستيدات الخضراء باستخدام علامة الحنفية

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

التركيب البلوري للمجال الطرفي ن من مستقبلات ريانوديني من إكسيلوستيلا بلوتيلا

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

تنقية خطوة واحدة من المجمعات الجزيئات باستخدام الحمض النووي الريبي يعلق على البيوتين ورابط صور كليفابل

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

التركيب الحيوي للفلافونول من فلافانون عن طريق إنشاء تتالي بينزيماتي واحد وعاء

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

إعادة تشكيل المستحضرات المؤتلفة Drosophila Atlastin في Liposomes لفحوصات خلط الدهون

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...