Name: purification and quality control of recombinant septin complexes for cell-free reconstitution
Uploaded: 2022-06-23T13:00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution at JoVE.com

Vi takker Cecilia de Agrela Pinto, Tomás de Garay og Katharina Häußermann for deres hjælp med eksperimenter med massefotometri (iSCAT); Arjen Jakobi og Wiel Evers for deres hjælp med TEM; Lucia Baldauf for hendes hjælp med TIRF; Pascal Verdier-Pinard for hans råd om indfødt elektroforese; Agata Szuba og Marjolein Vinkenoog for deres hjælp til at oprette Drosophila septinrensningsindsatsen og Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, medlem af den franske nationale forskningsinfrastruktur France-BioImaging (ANR10-INBS-04). Denne forskning modtog finansiering fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO/OCW) gennem 'BaSyC-Building a Synthetic Cell' gravitationsbevilling (024.003.019) og fra Agence Nationale pour la Recherche (ANR-tilskud ANR-17-CE13-0014: "SEPTIMORF"; ANR-13-JSV8-0002-01: "SEPTIME"; og ANR-20-CE11-0014-01: "SEPTSCORT").

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende eller økonomiske interesser.

Den her beskrevne metode giver mulighed for robust oprensning og kvalitetskontrol af præformede septin hetero-oligomerer. Nogle af de centrale spørgsmål, der skal overvejes for korrekt anvendelse af metoden, er som følger. Under elueringstrinnene i de kromatografiske separationer er det vigtigt at anvende den anbefalede (eller lavere) strømningshastighed for at minimere fortyndingen af septinkomplekserne. For at maksimere genvindingen af protein under det sidste koncentrationstrin er koncentratorkolonnen desuden orienteret på en sådan måde, at opløsningen ikke skubbes mod filteret (når der kun er et filter på den ene side). Hvis opløsningen går direkte til filteret, klæber proteinet meget mere til det, hvilket reducerer det endelige udbytte betydeligt. Det er også vigtigt at overveje, at koncentrationstrinnet ikke altid er nødvendigt. Plukning af fraktioner kun fra et snævert område omkring toppen i kromatogrammet giver normalt en høj nok lagerkoncentration (>3.000 nM) til mange rekonstitutionsapplikationer (som normalt fungerer mellem 10-300 nM). Endelig er det vigtigt at passivere overfladen af mikroskopierne korrekt til kvalitetskontrol af septinkompleksernes funktionalitet ved fluorescensmikroskopi, da septinkomplekser ivrigt klæber til glas. Passivering af glasdiasene kan ske enten via PLL-PEG-funktionalisering eller ved dannelse af neutrale (100% DOPC) understøttede lipid dobbeltlag11,32.
Sammenlignet med den oprindelige rensningsprotokol, der først blev beskrevet i Iv et al.10, er der en ændring i buffersammensætningerne (tabel 2). Koncentrationen af MgCl 2 er reduceret fra 5 mM til2 mM, og koncentrationen og pH i Tris-HCI er reduceret fra henholdsvis 50 mM til 20 mM og fra 8,0 til 7,4. Disse ændringer blev foretaget for at gøre bufferbetingelserne kompatible med undersøgelser af interaktionerne mellem humane septiner og lipiddobbeltlag, actinfilamenter og mikrotubuli10,11,32. Dette skyldes, at forfatterne dannede understøttede lipiddobbeltlag og polymeriseret actin i F-bufferen, hvis sammensætning er identisk med darkSPB, bortset fra tilstedeværelsen af ATP i F-bufferen. Bufferændringen medførte ingen ændringer i kvaliteten eller levetiden for de rensede septiner sammenlignet med de oprindelige buffere.
Denne rensningsmetode har stadig flere begrænsninger. For det første kan forskellige rensningsforsøg variere i udbytte (0,5-1 ml 2-5 μM septinkomplekser) og funktionel kvalitet, som kontrolleret af bundtdannelsesevnen for de oprensede septinkomplekser. Derfor er det meget vigtigt konsekvent at udføre de kvalitetskontroller, der er beskrevet i dette papir. Styring meget godt af ekspressionstiderne og bakteriekulturens optiske tæthed kan hjælpe med at afbøde forskellen i udbytte. For det andet kan denne rensningsrørledning ikke skelne mellem trimere og hexamerer eller mellem tetramerer og oktamere (figur 1B). Kvalitetskontrolforsøgene kan dog bruges til at bevise, at størstedelen af septinkomplekserne er i deres lange oligomerform. Hvis der kræves en endnu smallere oligomerstørrelsesfordeling, kan størrelsesekskluderingskromatografi indsættes mellem trin 1.6. og trin 1.7. af renselsesprotokollen. Dette valgfrie trin reducerer imidlertid udbyttet dramatisk, og det anbefales ikke, medmindre det er strengt nødvendigt. En sidste, mere grundlæggende, begrænsning kommer fra brugen af E. coli som et udtrykssystem til rekombinante septinkomplekser. Dette system tillader naturligvis ikke posttranslationelle modifikationer (PTM'er), som er blevet rapporteret i dyreceller, såsom phosphorylering, acetylering og sumoylation 6,51,52,53. Disse posttranslationelle ændringer kan tilføjes ved at implementere en lignende rensningsstrategi i insekt- eller humane celler. Desuden har dette papir kun diskuteret rekonstitutionen af septiner alene, men undersøgelser i celler indikerer, at regulatoriske proteiner som proteiner fra Borg-familien 54,55 og anillin24,25,56 kan have betydelige, men dårligt forståede virkninger på samlingen og funktionerne af septiner og derfor er vigtige for i sidste ende at inkorporere in vitro Undersøgelser. Protokoller for oprensning af Borg-proteiner og anillin er rapporteret54,57.
Septinrensningsprotokollen, der er rapporteret her, tilbyder en standardiseret måde at rense septiner i deres oligomerform med den korrekte underenhedsstøkiometri, hvilket giver et vigtigt fremskridt i forhold til mange tidligere in vitro-undersøgelser, der er afhængige af enkelte septin-underenheder. Selvom nogle septiner i specifikke sammenhænge kan fungere som en enkelt underenhed2, antyder den nuværende litteratur stærkt, at septiner i dyreceller for det meste fungerer i komplekser 9,58. Derfor er brugen af præformede hetero-oligomerer, som dem, der er beskrevet i dette papir og andre 10,11,18,32,35,36,37, af stor betydning for at studere septinernes strukturelle og biofysiske egenskaber via in vitro. rekonstitution for at dissekere deres funktioner i cellen. Desuden er septiner selvsamlende proteiner med mange interaktionspartnere, herunder membranen og cytoskelettet, hvilket gør dem af stor interesse for bottom-up syntetisk biologi 59,60,61 og undersøgelser af proteininducerede ændringer i membranbiofysiske egenskaber såsom krumning42,62,63.

Cytoskelettet er klassisk blevet beskrevet som et trekomponentsystem bestående af actinfilamenter, mikrotubuli og mellemliggende filamenter 1, men for nylig er septiner blevet anerkendt som en fjerde komponent i cytoskelet1. Septiner er en familie af GTP-bindende proteiner, der er konserveret i eukaryoter2. Septiner er involveret i mange cellulære funktioner såsom celledeling3, cellecelleadhæsion4, cellemotilitet5, morfogenese6, cellulær infektion7 og etablering og vedligeholdelse af cellepolaritet8. På trods af deres vigtige funktioner er det dårligt forstået, hvordan septiner er involveret i sådanne processer.
Septinfamilien af proteiner er opdelt i flere undergrupper (fire eller syv afhængigt af klassificeringen) baseret på proteinsekvenslighed2. Medlemmer af forskellige underfamilier kan danne palindromiske hetero-oligomere komplekser, som er byggestenene i filamenter, og som igen samles i højere ordens strukturer såsom bundter, ringe og meshworks 1,9,10,11,12. Yderligere molekylær kompleksitet stammer fra tilstedeværelsen af forskellige splejsningsvarianter, et eksempel er human SEPT9, hvor der er bevis for specifikke funktioner af forskellige splejsningsvarianter13,14,15. Derudover afhænger længden af hetero-oligomererne af arter og celletype. For eksempel danner Caenorhabditis elegans septiner tetramerer16, Drosophila melanogaster septiner danner hexamerer 17 (figur 1A), Saccharomyces cerevisiae septiner danner octamerer18, og humane septiner danner både hexamerer og octamers19 (figur 1A). Evnen af septinisoformer, splejsningsvarianter og posttranslationelt modificerede septiner fra samme underfamilie til at erstatte hinanden i komplekset og (sam)eksistensen af hetero-oligomerer af forskellig størrelse har gjort det vanskeligt at afgrænse de cellulære funktioner i forskellige hetero-oligomere komplekser12.
En anden interessant evne til septiner er deres evne til at interagere med mange bindende partnere i cellen. Septiner binder plasmamembranen og membranøse organeller under interfase- og celledeling20,21,22. Ved opdeling af celler samarbejder septiner med anillin 23,24,25 og actin og myosin under cytokinese 26,27. I de sene stadier af cytokinese synes septiner at regulere de endosomale sorteringskomplekser, der kræves til transportsystemet (ESCRT) til midtkropsabscission28. Derudover er der også tegn på septin placeret på actin cortex og actin stress fibre af celler i interfase celler 29,30,31. I specifikke celletyper binder og regulerer septiner også mikrotubuluscytoskelettet32,33.
Alle disse funktioner gør septiner til et meget interessant proteinsystem at studere, men også et udfordrende. Kombinationen af det store antal septinunderenheder (13 gener hos mennesker uden at tælle splejsningsvarianter2) med potentialet for septinunderenheder fra samme underfamilie til at erstatte hinanden og danne hetero-oligomerer af forskellig størrelse gør det vanskeligt at drage en konklusion om den cellulære funktion af en specifik septin ved genetisk manipulation. Desuden gør de mange interaktioner af septiner fortolkningen af virkningerne af almindelige forskningsværktøjer såsom lægemidler34 rettet mod cytoskeletale eller membrankomponenter til en hård opgave.
En måde at overvinde denne situation på er at supplere celleforskning med in vitro (cellefri) rekonstitution af septiner. In vitro-rekonstitution gør det muligt at isolere en enkelt type septin-hetero-oligomerer med en specifik underenhedssammensætning og længde 18,35,36,37. Dette kompleks kan derefter studeres i et kontrolleret miljø, enten alene for at opdage de grundlæggende strukturelle og fysisk-kemiske egenskaber af septiner 38,39,40 eller i kombination med ønskede partnere såsom modelbiomembraner 11,41,42, actinfilamenter 10,27 eller mikrotubuli 32,36 for at dechiffrere arten af deres Interaktioner.
Derfor er en pålidelig metode til effektiv rensning af forskellige septinkomplekser afgørende for septinforskning. Men selv ved hjælp af den samme protokol kan forskellige oprensninger give proteiner med forskellig aktivitet / funktionalitet eller endda integritet. For kommercielt tilgængelige proteiner såsom enzymer valideres funktionaliteten og den enzymatiske aktivitet omhyggeligt43. Implementering af omhyggelig kvalitetskontrol for cytoskeletale eller strukturelle proteiner såsom septiner kan være udfordrende, men det er vigtigt at gøre eksperimenter på tværs af laboratorier sammenlignelige.
Dette papir beskriver en robust metode til at rense rekombinante septiner af høj kvalitet i deres hetero-oligomere form baseret på samtidig ekspression af to vektorer indeholdende mono- eller bi-cistroniske konstruktioner (tabel 1) i Escherichia coli-celler. Metoden består af en to-trins affinitetskromatografi tilgang til at fange septin hetero-oligomerer indeholdende både enhans 6-mærkede septin og en Strep-II-mærket septin (figur 1B, C). Denne protokol, der først blev beskrevet i Iv et al.10, er blevet brugt til at rense Drosophila septin hexamerer 11,27,35, humane septinhexamerer 10 og flere humane septinoktamere indeholdende forskellige indfødte (isoform 1, 3 og 5)10,32 eller muterede SEPT9 isoformer 32 . Desuden gives en beskrivelse af et sæt teknikker til vurdering af kvaliteten af de rensede septiner. For det første kontrolleres septinunderenhedernes integritet og korrekte støkiometri ved anvendelse af denatureringselektroforese og transmissionselektronmikroskopi (TEM). Derefter undersøges tilstedeværelsen af hetero-oligomerer af den korrekte molekylmasse og tilstedeværelsen af monomerer eller mindre oligomerer, der indikerer kompleks ustabilitet, ved native elektroforese og massefotometri via interferometrisk spredningsmikroskopi (iSCAT). Endelig består det sidste trin af vurderingen af septinernes polymeriserende aktivitet ved anvendelse af fluorescensmikroskopi og TEM.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2.jpg"> Figur 1: Oprensningsstrategi . (A) Skemaer over septin hetero-oligomerer, der findes i humane (venstre) og Drosophila (højre) celler. Tal angiver septinunderenheder fra de angivne grupper, og P betegner Peanut. Human SEPT9 kan være en hvilken som helst af dens isoformer. Septin-underenhederne har en asymmetrisk form og er i længderetningen forbundet med to forskellige grænseflader, NC: NC og G: G-grænsefladen, som betegnet med henholdsvis NC og G oven på den menneskelige hexamer. (B,C) Skematisk illustration af totrinskromatografistrategien, vist for (B) humane septinhexamerer og (C) octamerer. H angiver his-tags, mens S angiver Strep-II-tags. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>488nm laser combiner iLAS2</td>
			<td>Gataca</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488nm Sapphire laser lines</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4k X 4k F416 CMOS camera</td>
			<td>TVIPS</td>
			<td></td>
			<td>For JEM-1400plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x sample buffer nativePAGE</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (TROLOX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>To prevent blinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 M1</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>1680311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Type-B, 300 mesh EM grid</td>
			<td>Ted pella</td>
			<td>01813-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Type-B, 300 mesh EM grid</td>
			<td>Electron micoscopy sciences</td>
			<td>CF300-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass #1.5H</td>
			<td>Thorslabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1-M1 confocal unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desthiobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1411-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibtor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>481761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP, 5 mL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>29-0588-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iLAS2 azimuthal TIRF illumination system&#160;</td>
			<td>Gataca</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1202-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Protein Gel Stain</td>
			<td>Westburg Life Sciences</td>
			<td>EP ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>10849040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 888 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EM-CCD&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400plus</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td>TEM microscope TUDelft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kappa-cassein&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-6X1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971-10G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746452-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylecllulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8074844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ system (Integral 10)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td></td>
			<td>I-water dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean TGX gels</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativeMark unstained protein standard</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC0725</td>
			<td>For iSCAT and Native gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE 4-16% GELS</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN1002BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE Running Buffer kit</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E&#160;</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nr. 1 Menzel coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo &#215;100/1.45 NA oil immersion objective</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(L-lysine)-graft-biotinylated PEG (PLL-PEG)</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>CHF560.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution 0.01%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td>For iSCAT glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for native gels</td>
			<td>CONSORT</td>
			<td>S/N 71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWERPAC UNIVERSAL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>042BR31206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td>oxygen scavenger - enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03930590-50MG</td>
			<td>oxygen scavenger - reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quemesa camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Tecnai Spirit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refeyn OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample buffer, laemmli 2x concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-10vl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon gaskets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL103250-10EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes 30k MWCO 3mL</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>66381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1441-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap HP, 1 mL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>28-9075-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit microscope</td>
			<td>Thermo Scientific, FEI</td>
			<td></td>
			<td>TEM microscope Institute Curie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0918-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/Glyine/SDS buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6, 30,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0622</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and quality control of recombinant septin complexes for cell-free reconstitution

Septiner er en familie af konserverede eukaryote GTP-bindende proteiner, der kan danne cytoskeletale filamenter og højere ordens strukturer fra hetero-oligomere komplekser. De interagerer med andre cytoskeletale komponenter og cellemembranen for at deltage i vigtige cellulære funktioner såsom migration og celledeling. På grund af kompleksiteten af septinernes mange interaktioner, det store antal septingener (13 hos mennesker) og septinernes evne til at danne hetero-oligomere komplekser med forskellige underenhedssammensætninger er cellefri rekonstitution en vigtig strategi for at forstå det grundlæggende i septinbiologi. Dette papir beskriver først en metode til at rense rekombinante septiner i deres hetero-oligomere form ved hjælp af en to-trins affinitetskromatografi tilgang. Derefter er processen med kvalitetskontrol, der bruges til at kontrollere renheden og integriteten af septinkomplekserne, detaljeret. Denne proces kombinerer native og denaturerende gelelektroforese, negativ pletelektronmikroskopi og interferometrisk spredningsmikroskopi. Endelig gives en beskrivelse af processen til kontrol af polymerisationsevnen af septinkomplekser ved anvendelse af negativ pletelektronmikroskopi og fluorescerende mikroskopi. Dette viser, at det er muligt at producere humane septinhexamerer og oktamere af høj kvalitet indeholdende forskellige isoformer af septin_9 samt Drosophila septinhexamerer.

Som nævnt i protokollen blev 5 L E. coli-celler co-transformeret med de to septin-ekspressive plasmider dyrket, og ekspressionen af septiner blev induceret ved tilsætning af IPTG. Efter 3 timer blev cellerne opsamlet ved centrifugering, resuspenderet i lysisbuffer og lyseret ved sonikering. Lysatet blev derefter klargjort ved centrifugering, og den klargjorte opløsning blev påført en HisTrap-kolonne (figur 2A). Efter den første rensning blev de septinholdige fraktioner samlet og påført en StrepTrap-søjle (figur 2B). Dette giver typisk omkring 3-5 ml ~ 1 μM septinkompleks. Før de septinholdige fraktioner samles, kan denaturerende gelelektroforese anvendes til at kontrollere integriteten af septinunderenhederne og det ækvimolære støkiometriske forhold mellem de forskellige septinunderenheder, der danner komplekset. (Figur 3A). Hvis gelen viser tilsvarende intense bånd svarende til molekylvægten (tabel 3) af septinunderenhederne, kan protokollen fortsættes. Hvis ikke, anbefales det at starte protokollen igen. I eksemplet vist for human septinoktamper med SEPT9_i1 viser figur 3A tydeligt bånd svarende til SEPT9_i1, SEPT6, SEPT7 og SEPT2 (i rækkefølge fra top til bund) med lignende intensiteter; 99% konfidensintervallet for den normaliserede intensitet var 1,128 ± 0,048 for SEPT2, 1,092 ± 0,034 for SEPT6, 1,108 ± 0,040 for SEPT7 og 1,067 ± 0,029 for SEPT9. Hvis SEPT2 er mærket med msfGFP, vil det skifte meget tæt under SEPT9_i1. Afhængigt af det anvendte elektroforesesystem og tilstedeværelsen af C-terminal TEV-Strep-mærket for SEPT7 (hvilket får det til at migrere langsommere end umærket SEPT7), smelter SEPT7- og SEPT6-båndene undertiden sammen på grund af deres sammenlignelige molekylvægt. Det næste trin er at samle fraktionerne og dialysere dem mod septinbuffer med DTT. Efter dialysen, hvis koncentrationen er for lav (<2 μM), eller der er behov for en højere koncentration til forsøgene, kan der inkluderes et koncentrationstrin som beskrevet i protokollen. Koncentrationer under 1 μM indikerer normalt en dårlig funktionel kvalitet af septinerne. En endelig septinkompleks koncentration mellem 3,5 μM og 7 μM fungerer godt for de fleste in vitro-assays . Disse koncentrationer opnås normalt, når volumenet efter koncentration når 0,5-1 ml.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig02.jpg"> Figur 2: Eksempel på kromatogrammer svarende til rensning af mørkt humant septin octamers_9i1 . (A) HisTrap-søjlekromatogram. Efter septinelutionstoppe går absorbansen ikke tilbage til nul, sandsynligvis på grund af tilstedeværelsen af imidazol i bufferen. Den samlede fraktion gik fra starten af elutionstop, indtil absorbansen stabiliserede sig på omkring 250 ml. (B) StrepTrap søjle kromatogram. Den samlede fraktion gik fra starten af elutionstop, indtil absorbansen gik tilbage til omkring 0 ved 50 ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
For at fortsætte med kvalitetskontrollen blev der udført native elektroforese, som beskrevet i protokollen, (figur 3B). I gelerne kan der observeres et større bånd svarende til de intakte hetero-oligomerer og normalt et mindre bånd svarende til dimerer. Menneskelige hexamerer findes lidt over 242 kDa markørbåndet, mens oktamere findes over 480 kDa-båndet, over deres beregnede molekylmasse. Placeringen af disse bånd blev kontrolleret ved western blot-analyse af eukaryote celleekstrakter32. Mærkning med msfGFP parrer hver SEPT2 med et msfGFP-protein. Dette medfører en stigning i molekylvægten af septinkomplekser på 53,4 kDa (26,7 kD / msGFP-molekyle). Ikke desto mindre kan den tilsyneladende molekylvægt af de msfGFP-mærkede komplekser på den indfødte elektroforesegel ikke skelnes fra de umærkede komplekser.
En komplementær teknik til at teste, om septinkomplekserne er intakte, er massefotometri ved iSCAT-mikroskopi. iSCAT overvåger lysspredningen af molekyler, der lander på et glasdias forstærket af interferens med referencelys, typisk refleksionen af laseren på bunden af glasdiaset. Derefter bruges en baggrundssubtraktionsmetode til at give kontrast til partiklerne. På grund af denne korrektion viser signalet positive og negative værdier afhængigt af om partiklerne lander på glasset eller bevæger sig væk fra det49. Det detekterede signal er direkte proportionalt med molekylvægten af proteiner50. Derfor kan en signal-til-masse-kalibrering med en massestandard bestemme massen af prøveproteinerne. Figur 3C viser et eksempel på humane septinoktammere indeholdende SEPT9_i1. De fleste af de påviste enkeltpartikler (~50%) har en forventet molekylvægt for komplette octamere indeholdende SEPT9_i1 (423 kDa) (figur 3C). Der er også partikler med masser mellem 150-300 kDa, men der observeres ingen klar top, hvilket indikerer den mulige tilstedeværelse af andre septinarter i lav overflod. Tilsvarende er de fleste af de påviste enkeltpartikler for mEGFP-mærkede Drosophila-hexamerer af en molekylvægt, der forventes for intakte hexamerer (361 kDa) (figur 3D). En yderligere klar top ved 241 kDa indikerer tilstedeværelsen af stabile tetramerer indeholdende to jordnøddeproteiner, en DSep1 og en mEGFP-DSep2. Endelig viser både det menneskelige og flueseptinkomplekserne en top omkring 80 kDa, der kunne være en blanding af monomerer og dimerer, muligvis forstærket af et spor af DTT eller ethvert andet lille molekyle, der aggregerer, hvilket viser en top i den positive side af plot45.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2.jpg"> Figur 3: Eksempler på resultater af oligomerkvalitetskontrollen. (A) Eksempel på denatureringsgel, der viser forskellige fraktioner af elutionstoppe fra rensning af mørk human septin octamers_9i1. (B) Eksempel på indfødt elektroforese af forskellige septinkomplekser. (C,D) Forskellige eksempler på histogramresultater af massefotometri ved 12,5 nM septinkomplekser: (C) mørkt humant septin-octamers_9i1 og (D) DSep1-msfGFP Drosophila septinhexamerer. Linjer er gaussiske pasformer. (E) TEM-billede af 25 nM mørk human septin octamers_9i1 i septinbuffer. Skala bar = 200 nm. (F) Klassegennemsnitligt billede af SEPT2-msfGFP human septin octamers_9i1. MsfGFP-tags er synlige som fuzzy tætheder i de to ender. Skala bar = 10 nm. Panelerne (E) og (F) er ophavsretten til The Company of Biologists og er blevet tilpasset fra Iv et al.10 med tilladelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
I betragtning af at både indfødte geler og iSCAT kun giver ensemble-gennemsnitlig information, blev klassegennemsnit af transmissionselektronmikroskopibilleder af enkelt septinoligomerer brugt til at kontrollere kompleksernes integritet og renhed ved direkte visualisering. I TEM-billeder af septinkomplekser i septinbuffer kan stænger på 24 nm (hexamerer) eller 32 nm (octamers) i længden observeres. Et eksempel på en human septinoktamper indeholdende SEPT9_i1 kan ses i figur 3E. Når klassen i gennemsnit beregner dem, kan hver af underenhederne observeres og tælles, som det ses for den msfGFP-mærkede menneskelige oktamere med SEPT9_i1 i figur 3F. Hvis oligomeren er fluorescerende mærket, kan der observeres ekstra tætheder, der svarer til SEPT2-msfGFP i slutningen af stængerne (figur 3F).
Kombinationen af ovennævnte teknikker viser, at octamere (eller hexamerer) med det korrekte støkiometriske forhold og høj renhed kan renses ved hjælp af den beskrevne protokol. Endelig er den sidste kvalitetskontrolkontrol for septinkompleksernes funktionalitet med hensyn til deres polymerisationsevne. I nærvær af lav saltkoncentration (<150 mM KCl med den beskrevne buffer 9), hvis septiner ikke er i nærværelse af andre proteiner eller negativt ladede lipidmembraner, samles de selv i bundter9. Septiner forhindres i polymerisation ved at holde dem i opbevaringsbufferen, som har en høj (300 mM) KCl-koncentration. Septin hetero-oligomererne fortyndes derefter ved et volumenforhold på 1:6 i en buffer med samme sammensætning, men uden KCl for at opnå en endelig KCl-koncentration på 50 mM. For at gøre fluorescensbilleddannelse suppleres denne buffer med et iltrensningssystem for at beskytte mod fotoblegning og med en blinkende suppressor. I TIRF-mikroskopi kan små klynger af proteiner observeres inden for det lave TIRF-felt (~ 100 nm; Figur 4A,B). På et konfokalt mikroskop kan store klynger af trådformede strukturer ses flydende højere op i opløsning (figur 4C). Endelig kan der med TEM observeres små bundter af septin (figur 4D), svarende til de klynger, der observeres af TIRF, og store bundter (figur 4E), svarende til de strukturer, der observeres ved konfokal mikroskopi. Indsatserne i figur 4D,E afslører, at begge typer strukturer består af lange, tynde filamenter, der løber parallelt og danner bundter med tilspidsede ender. Sammen viser fluorescens- og TEM-billederne, at de rensede septinkomplekser kan polymeriseres til filamenter, som igen samles i bundter.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig04.jpg"> Figur 4: Eksempler på resultater af kvalitetskontrol af polymerisationsevnen. (A) TIRF-billede af 300 nM humane septinhexamerer (10% msfGFP-mærkede hexamerer) i fluoSPB. (B) TIRF-billede af 300 nM humane septinoktamere indeholdende SEPT9_i1 (10% msfGFP-mærket octamers9_i1) i fluoSPB. (C) Konfokale maksimale intensitetsfremskrivninger af Z-stakke over ~ 30 μm med 0,5 μm afstand på 300 nM human septin octamers_9i3 i fluoSPB. (A-C) Skalabjælke = 10 μm og omvendt gråtoner. (D,E) Eksempel på TEM-billeder af (D) små og (E) store bundter af human septin octamers_9i1 i mørke. Indsatser viser områder, hvor klare filamenter, der løber parallelt i bundtet, kan observeres. Skala søjler = 500 nm. Paneler (C-E) er ophavsret til The Company of Biologists og er blevet tilpasset fra Iv et al.10 med tilladelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Tabel 1: Liste over plasmider. Plasmider til rensning af septinoligomerer efter denne protokol. Alle plasmider er blevet deponeret i Addgene (første kolonne). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%201_V2.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 2: Liste over buffere. Buffersammensætninger, der anvendes til oprensning og kvalitetskontrol af septinoligomerer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%202(1).xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 3: Molekylvægte og udryddelseskoefficienter. Liste over molekylvægte (MW) og optiske udryddelseskoefficienter (ε) ved en bølgelængde på 280 nm beregnet med ProtParam baseret på kompleksets sekvenser, forudsat lineær fusion af septinunderenhederne, de forskellige septinkomplekser og de unikke septinunderenheder (kun MW), der kan renses med plasmiderne anført i tabel 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%203.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution at JoVE.com

Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution

In vitro rekonstitution af cytoskeletale proteiner er et vigtigt redskab til at forstå de grundlæggende funktionelle egenskaber ved disse proteiner. Dette papir beskriver en protokol til rensning og vurdering af kvaliteten af rekombinante septinkomplekser, som spiller en central rolle i celledeling og migration.

Oprensning og kvalitetskontrol af rekombinante septinkomplekser til cellefri rekonstitution

Septins are a family of conserved eukaryotic GTP-binding proteins that can form cytoskeletal filaments and higher-order structures from hetero-oligomeric ...

Denne protokol gør det muligt at rense septinkomplekser af høj kvalitet, og dette er vigtigt for at studere septinernes mange roller i cellen. Den største fordel ved denne tilgang er syntetiseringen af en simpel procedure til oprensning af septin af høj kvalitet ved anvendelse af Addgene-plasmider. Septiner er vanskelige at studere i celler på grund af deres mange interaktioner.Svovlrekonstitution hjælper os med at adskille denne kompleksitet ved at studere dem i et simpelt system. Vi anbefaler at rense på en enkelt dag for at forhindre nedbrydning. Det er vores erfaring, at dette vil øge proteinets levetid og kvalitet.Til at begynde med vokser den transformerede bakteriekultur ved 37 grader Celsius i en shakerinkubator, indtil den optiske tæthed ved en bølgelængde på 600 nanometer når to til tre for umærkede septiner eller 0,6 til 0,8 for msfGFP eller mEGFP-mærkede septiner. Efter inkubation induceres proteinekspressionen ved at tilsætte IPTG til en endelig koncentration på 0,5 millimolar og inkuberes cellerne, der udtrykker umærkede septin hetero-oligomerer ved 37 grader Celsius i tre timer, eller cellerne, der udtrykker msfGFP-mærkede hetero-oligomerer ved 17 grader Celsius natten over. Derefter pellets cellerne ved 4.000 gange G i 20 minutter ved fire grader Celsius.Kassér supernatanten og opløs pelleten i 100 ml lysisbuffer for at lyse cellerne. Brug derefter en tip sonikator ved 30% amplitude til at sonikere cellen. Klargør cellelysatet ved centrifugering ved 20.000 gange G i 30 minutter ved fire grader Celsius og gem supernatanten.Tag eventuelt en prøve til denaturering af elektroforese som beskrevet i manuskriptet. For affinitetskromatografi af his-mærkede septiner skal du ækvilibrere en færdigpakket nikkel sepharose højtydende kromatografikolonne med alle de nødvendige buffere. Indlæs den klargjorte supernatant ned til kolonnen, og start kromatografisystemet.Derefter elueres septinkomplekserne med 50% HisTrap-elueringsbuffer med en strømningshastighed på en milliliter pr. Minut. For at give en imidazolkoncentration på 250 millimolar samles 0,5 milliliter fraktioner. Overvåg nu eluatets optiske absorbans ved 280 nanometer med et hurtigt proteinvæskekromatografisystem, og vælg fraktionerne indeholdende septinkomplekser.For affinitetskromatografi af Strep-II-mærkede proteiner er lige store armerings- og tætpakkede StrepTactin sepharose højtydende kromatografikolonne med septinbuffer. Læg septinindholdet indeholdende fraktioner, der genvindes fra nikkelkolonnen, med en hastighed på en milliliter pr. Minut, og start kromatografisystemet. Vask derefter det bundne protein og eluer septinkomplekserne med 100% StrepTrap-elueringsbuffer med en strømningshastighed på en milliliter pr. Minut.For at give en koncentration på 2,5 millimolar desthiobiotin samles 0,5 milliliter fraktioner. Vælg fraktionerne indeholdende septinkomplekser som angivet ved eluatets optiske absorbans ved 280 nanometer overvåget online med et hurtigt proteinvæskekromatografisystem. Efter fjernelse af desthiobiotin ved dialyse aliquot proteinkomplekserne i den ønskede aliquotstørrelse, snap frys aliquot, og opbevar det ved minus 80 grader Celsius.Til interferometrisk spredningsmikroskopi vaskes glasglas nummer 1,5 ved at sonikere dem i en ultralydsrenser i fem minutter hver i vand, isopropanol og igen i deioniseret vand. Tør to glasglas med en blid strøm af nitrogengas. Placer derefter en syv mikroliter dråbe 0,01% Poly-L-lysinopløsning på midten af et af diasene og placer midten af det andet dias oven på Poly-L-Lysin-dråben, orienterer de to dias ortogonalt for nem adskillelse.Efter inkubation i 30 sekunder vaskes glideren ved at nedsænke i et bægerglas, der indeholder deioniseret vand en gang og direkte påføre en vandstrøm to gange. Tør dem med en nitrogengasstrøm, og disse dias kan opbevares i omkring seks uger ved stuetemperatur under tørre forhold. Før eksperimentet skal du skære et stykke af to ved to, tre ved to eller tre ved tre pakninger og sætte dem på den Poly-L-Lysinbehandlede del af et glasglas, så glasrutsjebanen og pakningerne kommer i kontakt med enhver snavset overflade ved at placere diaset på et let viskervæv.Tryk nu på pakningerne med en pipettespids for at klæbe dem med den beskyttende plast, der findes på pakningerne. Opvarm derefter septinbufferen til stuetemperatur. Tø proteinerne op i hånden og hold dem på is bagefter.Placer derefter diaset med pakninger på det kommercielle massefotometrisystem, der indeholder 19 mikroliter septinbuffer, og fokuser mikroskopet ved hjælp af autofokusindstillingen. Fokuser igen med de nye indstillinger ved hjælp af autofokusindstillingen. Hvis du vil oprette en projektmappe, skal du klikke på Filer efterfulgt af Nyt projekt og indlæse en projektmappe til lagring af data ved at klikke på Filer efterfulgt af Indlæs projekt.Derefter pipetteres en mikroliter prøve til 19 mikroliter septumbufferdråbe. Bland, og under blanding skal du undgå at røre ved noget for at forhindre bevægelse af diaset. Optag derefter en 6.000 rammevideo ved at klikke på Optag.Analyser videoerne ved hjælp af producentens software for at opnå proteinmassefordelingen. Hvis toppe af forskellige septin hetero-oligomerstørrelser overlapper for meget, eller der opdages for mange hændelser, reduceres den endelige septinkoncentration og måles igen. Og når der ikke måles nok antal enkeltmolekyler, øges septinkoncentrationen og måles igen.Til septinanalyse fremstilles 5X darkSPB og en septinblanding bestående af 100% mørk septin i seks gange højere koncentration end den ønskede endelige koncentration i septinbuffer og en millimolar Dithiothreitol. Derefter polymeriseres septinen ved at blande vand, 20% 5X darkSPB og 16,67% septinblanding i denne specifikke rækkefølge og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt tre til fem mikroliter prøve til et glødudladet elektronmikroskopigitter og inkuber i et minut.Vask nu gitteret to gange ved at tilføje en dråbe darkSPB-buffer og absorber væsken med et filterpapir. Vask en gang med vand og inkuber i 30 sekunder med 2% uranylacetat. Blot derefter pletten og lufttør prøven i et par minutter.Forestil dig derefter septinbundterne ved 120 kilovolt og forstørrelser mellem 5.000X og 60.000X med en defokusering på en til to mikrometer. HisTrap- og StrepTrap-kromatogrammet viste, at den samlede fraktion gik fra starten af elueringstoppen, indtil absorbansen stabiliserede sig på henholdsvis omkring 250 ml og 50 milliliter. Septinbåndene viste lignende intensiteter ved denaturering af gelelektroforese, hvilket tyder på, at septinerne er intakte.I indfødt elektroforese blev det store bånd svarende til de intakte hetero-oligomerer og et mindre bånd svarende til trimor eller tetramerer observeret. Den tilsyneladende molekylvægt af msfGFP-mærkede komplekser kan ikke skelnes fra vægten af de umærkede komplekser. Massefotometri detekterede intakte oktammere og hexamerer af septiner.En yderligere top på 241 kilodalton indikerede tilstedeværelsen af to jordnøddeproteiner, DSep1 og mEGFP-DSep2. Transmissionselektronmikroskopibilleder af septinkomplekser viste stænger af hexamerer og octamerer. MSFGFP-tags er synlige som fuzzy tætheder i de to ender i septin 2 msfGFP human septin octamers_9i1.Små klynger af proteiner kan observeres i det lave TIRF-felt. Den konfokale mikroskopi afslørede store klynger af flydende trådformede strukturer. Transmissionselektronmikroskopi viste små og store septinbundter svarende til klyngerne observeret ved total intern refleksionsfluorescensmikroskopi og konfokal mikroskopi.Vi anbefaler at arbejde på is til enhver tid under rensningerne og at tilføje friske reagenser, som vi specificerer i protokollen. Vi er interesserede i interaktioner af septiner i forbindelse med cytokinese. Vi rekonstituerede septin sammen med moderne membraner actin og mikrotubuli for at studere dem med mikroskopi og flere biofysiske assays.Vi bruger de rensede septiner til at studere, hvordan septiner interagerer med actinfilamenter, mikrotubuli og lipider. Og vi bruger også de rensede septiner til at opbygge syntetiske celler, hvor septinerne letter celledeling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affinitetsoprensning af proteinkomplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontal gelelektroforese til forbedret påvisning af protein-RNA-komplekser

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Rekonstituering af cellecyklus svingninger i Microemulsions af celle-fri Xenopus æg uddrag

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rensning af grønkorn Translocon Protein komplekser ved hjælp af tryk på Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal struktur af den N-terminale domæne af ryanodinreceptoren fra Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Enkelt-trins rensning af makromolekylære komplekser ved hjælp af RNA knyttet til Biotin og et foto-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Biosyntese af en flavonol fra en Flavanone ved at etablere en en-pot Bienzymatisk kaskade

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Vaskemiddel-assisteret rekonstitution af rekombinant Drosophila Atlastin til Liposomer til lipid-blanding assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...