Name: purification and quality control of recombinant septin complexes for cell-free reconstitution
Uploaded: 2022-06-23T13:00:00
Duration: 11 min 50 s
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Wir danken Cecilia de Agrela Pinto, Tomás de Garay und Katharina Häußermann für ihre Unterstützung bei Massenphotometrie-Experimenten (iSCAT); Arjen Jakobi und Wiel Evers für ihre Hilfe bei TEM; Lucia Baldauf für ihre Unterstützung bei TIRF; Pascal Verdier-Pinard für seinen Rat zur nativen Elektrophorese; Agata Szuba und Marjolein Vinkenoog für ihre Hilfe beim Aufbau der Drosophila-Septin-Reinigung und der Zell- und Gewebebildgebung (PICT-IBiSA), Institut Curie, Mitglied der französischen nationalen Forschungsinfrastruktur France-BioImaging (ANR10-INBS-04). Diese Forschung wurde von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO/OCW) durch das Gravitationsstipendium "BaSyC-Building a Synthetic Cell" (024.003.019) und durch die Agence Nationale pour la Recherche (ANR-Zuschüsse ANR-17-CE13-0014: "SEPTIMORF"; ANR-13-JSV8-0002-01: "SEPTIME"; und ANR-20-CE11-0014-01: "SEPTSCORT").

Die Autoren erklären keine konkurrierenden oder finanziellen Interessen.

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die robuste Reinigung und Qualitätskontrolle von vorgeformten Septin-Hetero-Oligomeren. Einige der wichtigsten Aspekte, die für die korrekte Anwendung der Methode zu berücksichtigen sind, sind wie folgt. Während der Elutionsschritte in den chromatographischen Trennungen ist es wichtig, die empfohlene (oder niedrigere) Durchflussrate zu verwenden, um die Verdünnung der Septinkomplexe zu minimieren. Um die Rückgewinnung des Proteins während des letzten Konzentrationsschritts zu maximieren, ist die Konzentratorsäule so ausgerichtet, dass die Lösung nicht gegen den Filter gedrückt wird (wenn sich nur ein Filter auf einer Seite befindet). Wenn die Lösung direkt in den Filter gelangt, haftet das Protein viel mehr daran, was die Endausbeute erheblich verringert. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass der Konzentrationsschritt nicht immer notwendig ist. Das Picken von Fraktionen nur aus einem engen Bereich um den Peak im Chromatogramm ergibt normalerweise eine ausreichend hohe Stammkonzentration (>3.000 nM) für viele Rekonstitutionsanwendungen (die normalerweise zwischen 10-300 nM arbeiten). Schließlich ist es für die Qualitätskontrolle der Funktionalität der Septinkomplexe durch Fluoreszenzmikroskopie wichtig, die Oberfläche der Mikroskopie-Objektträger korrekt zu passivieren, da Septinkomplexe eifrig an Glas haften. Die Passivierung der Glasobjektträger kann entweder durch PLL-PEG-Funktionalisierung oder durch die Bildung neutraler (100% DOPC) unterstützter Lipiddoppelschichten11,32 erfolgen.
Im Vergleich zum ursprünglichen Reinigungsprotokoll, das erstmals in Iv et al.10 beschrieben wurde, gibt es eine Änderung in den Pufferzusammensetzungen (Tabelle 2). Die Konzentration von MgCl 2 wurde von 5 mM auf2 mM reduziert, und die Konzentration und der pH-Wert von Tris-HCl wurden von 50 mM auf 20 mM bzw. von 8,0 auf 7,4 reduziert. Diese Änderungen wurden vorgenommen, um die Pufferbedingungen mit Studien über die Wechselwirkungen menschlicher Septine mit Lipiddoppelschichten, Aktinfilamenten und Mikrotubuli kompatibel zu machen10,11,32. Dies liegt daran, dass die Autoren im F-Puffer unterstützte Lipiddoppelschichten und polymerisiertes Aktin gebildet haben, dessen Zusammensetzung mit der von darkSPB identisch ist, abgesehen von der Anwesenheit von ATP im F-Puffer. Der Pufferwechsel führte zu keinen Änderungen in der Qualität oder Lebensdauer der gereinigten Septine im Vergleich zu den ursprünglichen Puffern.
Diese Reinigungsmethode hat noch einige Einschränkungen. Erstens können verschiedene Reinigungsversuche in der Ausbeute (0,5-1 ml 2-5 μM Septinkomplexe) und der funktionellen Qualität variieren, was durch die Bündelbildungsfähigkeit der gereinigten Septinkomplexe überprüft wird. Deshalb ist es sehr wichtig, die in diesem Beitrag beschriebenen Qualitätskontrollen konsequent durchzuführen. Eine sehr gute Kontrolle der Expressionszeiten und der optischen Dichte der Bakterienkultur kann dazu beitragen, den Ertragsunterschied zu mildern. Zweitens kann diese Reinigungspipeline nicht zwischen Trimeren und Hexameren oder zwischen Tetrameren und Oktameren unterscheiden (Abbildung 1B). Die Qualitätskontrollexperimente können jedoch verwendet werden, um nachzuweisen, dass die Mehrheit der Septinkomplexe in ihrer langen Oligomerform vorliegt. Falls eine noch engere Oligomergrößenverteilung erforderlich ist, kann die Größenausschlusschromatographie zwischen Schritt 1.6 eingefügt werden. und Schritt 1.7. des Reinigungsprotokolls. Dieser optionale Schritt verringert jedoch den Ertrag drastisch und wird nicht empfohlen, es sei denn, er ist unbedingt erforderlich. Eine letzte, grundlegendere Einschränkung ergibt sich aus der Verwendung von E. coli als Expressionssystem für rekombinante Septinkomplexe. Natürlich erlaubt dieses System keine posttranslationalen Modifikationen (PTMs), wie sie in tierischen Zellen berichtet wurden, wie Phosphorylierung, Acetylierung und Sumoylierung 6,51,52,53. Diese posttranslationalen Modifikationen könnten durch die Implementierung einer ähnlichen Reinigungsstrategie in Insekten- oder menschlichen Zellen hinzugefügt werden. Darüber hinaus hat diese Arbeit nur die Rekonstitution von Septinen selbst diskutiert, aber Studien an Zellen deuten darauf hin, dass regulatorische Proteine wie Proteine aus der Borg-Familie 54,55 und Anillin 24,25,56 substanzielle, aber wenig verstandene Auswirkungen auf die Assemblierung und Funktion von Septinen haben können und daher wichtig sind, um sie schließlich in vitro zu integrieren. Studium. Protokolle für die Reinigung von Borg-Proteinen und Anillin wurden berichtet54,57.
Das hier beschriebene Septin-Reinigungsprotokoll bietet eine standardisierte Möglichkeit, Septine in ihrer Oligomerform mit der korrekten Untereinheitsstöchiometrie zu reinigen, was einen wichtigen Fortschritt gegenüber vielen früheren In-vitro-Studien darstellt, die auf einzelnen Septin-Untereinheiten basieren. Obwohl einige Septine in bestimmten Kontexten als einzelne Untereinheit2 fungieren können, deutet die aktuelle Literatur stark darauf hin, dass Septine in tierischen Zellen hauptsächlich in Komplexen 9,58 funktionieren. Daher ist die Verwendung von vorgeformten Hetero-Oligomeren, wie sie in diesem Artikel und anderen 10,11,18,32,35,36,37 beschrieben sind, von großer Bedeutung, um die strukturellen und biophysikalischen Eigenschaften von Septinen in vitro zu untersuchen. Rekonstitution, um ihre Funktionen in der Zelle zu sezieren. Darüber hinaus sind Septine selbstorganisierende Proteine mit vielen Interaktionspartnern, einschließlich der Membran und des Zytoskeletts, was sie für die Bottom-up-synthetische Biologie 59,60,61 und Studien über proteininduzierte Veränderungen der biophysikalischen Eigenschaften der Membran wie Krümmung42,62,63 von großem Interesse macht.

Das Zytoskelett wurde klassischerweise als Dreikomponentensystem beschrieben, das aus Aktinfilamenten, Mikrotubuli und Zwischenfilamentenbesteht 1, aber kürzlich wurden Septine als vierte Komponente des Zytoskeletts1 anerkannt. Septine sind eine Familie von GTP-bindenden Proteinen, die in Eukaryoten2 konserviert sind. Septine sind an vielen zellulären Funktionen wie Zellteilung3, Zell-Zell-Adhäsion4, Zellmotilität5, Morphogenese6, zelluläre Infektion7 und der Herstellung und Aufrechterhaltung der Zellpolarität8 beteiligt. Trotz ihrer wichtigen Funktionen ist wenig verstanden, wie Septine an solchen Prozessen beteiligt sind.
Die Septin-Proteinfamilie wird in mehrere Untergruppen (vier oder sieben, je nach Klassifizierung) unterteilt, basierend auf der Proteinsequenzähnlichkeit2. Mitglieder verschiedener Unterfamilien können palindromische hetero-oligomere Komplexe bilden, die die Bausteine von Filamenten sind und die sich wiederum zu Strukturen höherer Ordnung wie Bündeln, Ringen und Netzen zusammenfügen 1,9,10,11,12. Eine weitere molekulare Komplexität ergibt sich aus dem Vorhandensein verschiedener Spleißvarianten, ein Beispiel ist humanes SEPT9, wo es Hinweise auf spezifische Funktionen verschiedener Spleißvarianten13,14,15 gibt. Darüber hinaus hängt die Länge der Hetero-Oligomere von Spezies und Zelltyp ab. Zum Beispiel bilden Caenorhabditis elegans Septine Tetramere 16, Drosophila melanogaster Septine bilden Hexamer 17 (Abbildung 1A), Saccharomyces cerevisiae Septine bilden Oktamere 18 und menschliche Septine bilden sowohl Hexamer als auch Oktamere19 (Abbildung 1A). Die Fähigkeit von Septinisoformen, Spleißvarianten und posttranslational modifizierten Septinen derselben Unterfamilie, sich im Komplex gegenseitig zu substituieren, und die (Ko-)Existenz unterschiedlich großer Hetero-Oligomere haben es schwierig gemacht, die zellulären Funktionen verschiedener hetero-oligomerer Komplexe abzugrenzen12.
Eine weitere interessante Fähigkeit von Septinen ist ihre Fähigkeit, mit vielen Bindungspartnern in der Zelle zu interagieren. Septine binden die Plasmamembran und die membranösen Organellen während der Interphase und Zellteilung20,21,22. In sich teilenden Zellen kooperieren Septine mit Anillin 23,24,25 und Aktin und Myosin während der Zytokinese 26,27. In den späten Stadien der Zytokinese scheinen Septine die endosomalen Sortierkomplexe zu regulieren, die für das Transportsystem (ESCRT) für die Mittelkörperabscission erforderlichsind 28. Darüber hinaus gibt es auch Hinweise auf Septin auf dem Aktinkortex und Aktin-Stressfasern von Zellen in Interphase-Zellen 29,30,31. In bestimmten Zelltypen binden und regulieren Septine auch das Mikrotubuli-Zytoskelett32,33.
All diese Eigenschaften machen Septine zu einem sehr interessanten, aber auch herausfordernden Proteinsystem. Die Kombination der großen Anzahl von Septin-Untereinheiten (13 Gene beim Menschen ohne Spleißvarianten2) mit dem Potenzial von Septin-Untereinheiten aus derselben Unterfamilie, sich gegenseitig zu substituieren und unterschiedlich große Hetero-Oligomere zu bilden, macht es schwierig, durch genetische Manipulation einen Rückschluss auf die zelluläre Funktion eines bestimmten Septins zu ziehen. Darüber hinaus machen die vielfältigen Wechselwirkungen von Septinen die Interpretation der Wirkungen gängiger Forschungsinstrumente wie Medikamente34 , die auf Zytoskelett- oder Membrankomponenten gerichtet sind, zu einer schwierigen Aufgabe.
Eine Möglichkeit, diese Situation zu überwinden, besteht darin, die Forschung an Zellen durch eine in vitro (zellfreie) Rekonstitution von Septinen zu ergänzen. Die In-vitro-Rekonstitution ermöglicht die Isolierung eines einzigen Typs von Septin-Hetero-Oligomeren mit einer spezifischen Untereinheitszusammensetzung und Länge 18,35,36,37. Dieser Komplex kann dann in einer kontrollierten Umgebung untersucht werden, entweder allein, um die grundlegenden strukturellen und physikochemischen Eigenschaften der Septine 38,39,40 zu entdecken, oder in Kombination mit gewünschten Partnern wie Modellbiomembranen 11,41,42, Aktinfilamenten 10,27 oder Mikrotubuli 32,36, um die Natur ihrer wechselwirkungen.
Daher ist eine zuverlässige Methode zur effizienten Reinigung verschiedener Septinkomplexe für die Septinforschung von entscheidender Bedeutung. Selbst bei Verwendung desselben Protokolls können jedoch unterschiedliche Reinigungsvorgänge Proteine mit unterschiedlicher Aktivität / Funktionalität oder sogar Integrität ergeben. Für kommerziell erhältliche Proteine wie Enzyme werden die Funktionalität und die enzymatische Aktivität sorgfältig validiert43. Die Implementierung einer sorgfältigen Qualitätskontrolle für Zytoskelett- oder Strukturproteine wie Septine kann eine Herausforderung darstellen, aber es ist wichtig, Experimente über Labore hinweg vergleichbar zu machen.
Dieser Artikel beschreibt eine robuste Methode zur Reinigung hochwertiger rekombinanter Septine in ihrer hetero-oligomeren Form, die auf der gleichzeitigen Expression von zwei Vektoren basiert, die mono- oder bi-cistronische Konstrukte (Tabelle 1) in Escherichia coli-Zellen enthalten. Die Methode besteht aus einem zweistufigen Affinitätschromatographie-Ansatz zur Erfassung von Septin-Hetero-Oligomeren, die sowohl ein his 6-markiertes Septin als auch ein Strep-II-markiertes Septin enthalten (Abbildung 1B, C). Dieses Protokoll, das erstmals in Iv et al.10 beschrieben wurde, wurde verwendet, um Drosophila septin hexamers 11,27,35, human septin hexamers 10 und mehrere humane septin octamere zu reinigen, die verschiedene native (Isoform 1, 3 und 5) 10,32 oder mutierte SEPT9-Isoformen enthalten 32 . Darüber hinaus wird eine Reihe von Techniken zur Beurteilung der Qualität der gereinigten Septine beschrieben. Zunächst wird die Integrität und korrekte Stöchiometrie der Septin-Untereinheiten mittels Denaturierungselektrophorese und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) überprüft. Dann werden das Vorhandensein von Hetero-Oligomeren der richtigen Molekülmasse und das Vorhandensein von Monomeren oder kleineren Oligomeren, die auf eine komplexe Instabilität hinweisen, durch native Elektrophorese und Massenphotometrie mittels interferometrischer Streumikroskopie (iSCAT) untersucht. Der letzte Schritt besteht schließlich in der Beurteilung der Polymerisationsaktivität der Septine mittels Fluoreszenzmikroskopie und TEM.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Reinigungsstrategie . (A) Schematische Darstellung der Septin-Hetero-Oligomere, die in menschlichen (links) und Drosophila-Zellen (rechts) vorkommen. Zahlen bezeichnen Septin-Untereinheiten aus den angegebenen Gruppen und P bedeutet Erdnuss. Humanes SEPT9 kann jede seiner Isoformen sein. Die Septin-Untereinheiten haben eine asymmetrische Form und sind längs mit zwei verschiedenen Grenzflächen verbunden, der NC:NC- und der G:G-Schnittstelle, wie mit NC bzw. G auf dem menschlichen Hexamer bezeichnet. (B,C) Schematische Darstellung der zweistufigen Chromatographiestrategie, dargestellt für (B) menschliche Septin-Hexamer und (C) Oktomere. H zeigt die his-Tags an, während S die Strep-II-Tags angibt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>488nm laser combiner iLAS2</td>
			<td>Gataca</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488nm Sapphire laser lines</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4k X 4k F416 CMOS camera</td>
			<td>TVIPS</td>
			<td></td>
			<td>For JEM-1400plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x sample buffer nativePAGE</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (TROLOX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>To prevent blinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 M1</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>1680311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Type-B, 300 mesh EM grid</td>
			<td>Ted pella</td>
			<td>01813-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Type-B, 300 mesh EM grid</td>
			<td>Electron micoscopy sciences</td>
			<td>CF300-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass #1.5H</td>
			<td>Thorslabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1-M1 confocal unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desthiobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1411-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibtor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>481761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP, 5 mL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>29-0588-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iLAS2 azimuthal TIRF illumination system&#160;</td>
			<td>Gataca</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1202-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Protein Gel Stain</td>
			<td>Westburg Life Sciences</td>
			<td>EP ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>10849040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 888 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EM-CCD&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400plus</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td>TEM microscope TUDelft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kappa-cassein&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-6X1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971-10G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746452-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylecllulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8074844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ system (Integral 10)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td></td>
			<td>I-water dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean TGX gels</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativeMark unstained protein standard</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC0725</td>
			<td>For iSCAT and Native gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE 4-16% GELS</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN1002BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE Running Buffer kit</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E&#160;</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nr. 1 Menzel coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo &#215;100/1.45 NA oil immersion objective</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(L-lysine)-graft-biotinylated PEG (PLL-PEG)</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>CHF560.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution 0.01%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td>For iSCAT glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for native gels</td>
			<td>CONSORT</td>
			<td>S/N 71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWERPAC UNIVERSAL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>042BR31206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td>oxygen scavenger - enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03930590-50MG</td>
			<td>oxygen scavenger - reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quemesa camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Tecnai Spirit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refeyn OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample buffer, laemmli 2x concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-10vl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon gaskets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL103250-10EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes 30k MWCO 3mL</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>66381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1441-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap HP, 1 mL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>28-9075-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit microscope</td>
			<td>Thermo Scientific, FEI</td>
			<td></td>
			<td>TEM microscope Institute Curie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0918-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/Glyine/SDS buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6, 30,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0622</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and quality control of recombinant septin complexes for cell-free reconstitution

Septine sind eine Familie konservierter eukaryotischer GTP-bindender Proteine, die Zytoskelettfilamente und Strukturen höherer Ordnung aus hetero-oligomeren Komplexen bilden können. Sie interagieren mit anderen Zytoskelettkomponenten und der Zellmembran, um an wichtigen zellulären Funktionen wie Migration und Zellteilung teilzunehmen. Aufgrund der Komplexität der vielen Interaktionen von Septinen, der großen Anzahl von Septin-Genen (13 beim Menschen) und der Fähigkeit von Septinen, hetero-oligomere Komplexe mit unterschiedlichen Untereinheitenzusammensetzungen zu bilden, ist die zellfreie Rekonstitution eine wichtige Strategie, um die Grundlagen der Septinbiologie zu verstehen. Die vorliegende Arbeit beschreibt zunächst ein Verfahren zur Reinigung rekombinanter Septine in ihrer hetero-oligomeren Form unter Verwendung eines zweistufigen Affinitätschromatographie-Ansatzes. Dann wird der Prozess der Qualitätskontrolle zur Überprüfung der Reinheit und Integrität der Septinkomplexe detailliert beschrieben. Dieses Verfahren kombiniert native und denaturierende Gelelektrophorese, negative Färbeelektronenmikroskopie und interferometrische Streumikroskopie. Abschließend wird eine Beschreibung des Verfahrens zur Überprüfung der Polymerisationsfähigkeit von Septinkomplexen mittels negativer Färbeelektronenmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie gegeben. Dies zeigt, dass es möglich ist, hochwertige humane Septin-Hexamer und -Oktamere herzustellen, die verschiedene Isoformen von septin_9 enthalten, sowie Drosophila-Septin-Hexamer .

Wie im Protokoll erwähnt, wurden 5 L E. coli-Zellen , die mit den beiden Septin-exprimierenden Plasmiden kotransformiert waren, gezüchtet, und die Expression von Septinen wurde durch Zugabe von IPTG induziert. Nach 3 h wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, im Lysepuffer resuspendiert und durch Beschallung lysiert. Das Lysat wurde dann durch Zentrifugation geklärt, und die geklärte Lösung wurde auf eine HisTrap-Säule aufgetragen (Abbildung 2A). Nach der ersten Reinigung wurden die septinhaltigen Fraktionen gepoolt und auf eine StrepTrap-Säule aufgetragen (Abbildung 2B). Dies ergibt typischerweise etwa 3-5 mL ~1 μM Septinkomplex. Vor dem Pooling der septinhaltigen Fraktionen kann die Denaturierungsgelelektrophorese verwendet werden, um die Integrität der Septin-Untereinheiten und das äquimolare stöchiometrische Verhältnis zwischen den verschiedenen Septin-Untereinheiten, die den Komplex bilden, zu überprüfen. (Abbildung 3A). Wenn das Gel ähnlich intensive Banden aufweist, die den Molekulargewichten (Tabelle 3) der Septin-Untereinheiten entsprechen, kann das Protokoll fortgesetzt werden. Wenn nicht, wird empfohlen, das Protokoll erneut zu starten. In dem gezeigten Beispiel für humanes Septinoktamer mit SEPT9_i1 zeigt Abbildung 3A deutlich Banden, die SEPT9_i1, SEPT6, SEPT7 und SEPT2 (in der Reihenfolge von oben nach unten) mit ähnlichen Intensitäten entsprechen; Das 99%-Konfidenzintervall der normalisierten Intensität betrug 1,128 ± 0,048 für SEPT2, 1,092 ± 0,034 für SEPT6, 1,108 ± 0,040 für SEPT7 und 1,067 ± 0,029 für SEPT9. Wenn SEPT2 mit msfGFP markiert ist, verschiebt es sich sehr nahe unter SEPT9_i1. Abhängig vom verwendeten Elektrophoresesystem und dem Vorhandensein des C-terminalen TEV-Strep-Tags für SEPT7 (wodurch es langsamer migriert als unmarkiertes SEPT7), verschmelzen die SEPT7- und SEPT6-Banden aufgrund ihres vergleichbaren Molekulargewichts manchmal. Der nächste Schritt besteht darin, die Fraktionen zu bündeln und sie gegen den Septinpuffer mit DTT zu dialysieren. Wenn nach der Dialyse die Konzentration zu niedrig ist (<2 μM) oder eine höhere Konzentration für die Experimente benötigt wird, kann ein Konzentrationsschritt einbezogen werden, wie im Protokoll beschrieben. Konzentrationen unter 1 μM deuten in der Regel auf eine schlechte funktionelle Qualität der Septine hin. Eine endgültige Septinkomplexkonzentration zwischen 3,5 μM und 7 μM eignet sich gut für die meisten In-vitro-Assays . Diese Konzentrationen werden normalerweise erreicht, wenn das Volumen nach der Konzentration 0,5-1 ml erreicht.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig02.jpg"> Abbildung 2: Beispielchromatogramme entsprechend der Reinigung von dunklem menschlichem Septin octamers_9i1 . (A) HisTrap-Säulenchromatogramm. Nach dem Septin-Elutionspeak geht die Absorption nicht auf Null zurück, wahrscheinlich aufgrund des Vorhandenseins von Imidazol im Puffer. Die gepoolte Fraktion ging vom Beginn des Elutionspeaks bis zur Stabilisierung der Absorption bei etwa 250 ml. (B) StrepTrap-Säulenchromatogramm. Die gepoolte Fraktion ging vom Beginn des Elutionspeaks an, bis die Absorption bei 50 ml wieder auf etwa 0 zurückging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Um mit der Qualitätskontrolle fortzufahren, wurde eine native Elektrophorese durchgeführt, wie im Protokoll beschrieben (Abbildung 3B). In den Gelen kann eine Hauptbande beobachtet werden, die den intakten Hetero-Oligomeren entspricht, und üblicherweise eine kleine Bande, die den Dimeren entspricht. Menschliche Hexamer befinden sich etwas oberhalb des 242-kDa-Markerbandes, während Oktamere oberhalb des 480-kDa-Bandes oberhalb ihrer berechneten Molekülmasse gefunden werden. Die Lage dieser Banden wurde durch Western-Blot-Analyse von eukaryotischen Zellextraktenüberprüft 32. Das Tagging mit msfGFP koppelt jeden SEPT2 mit einem msfGFP-Protein. Dies führt zu einer Erhöhung des Molekulargewichts von Septinkomplexen um 53,4 kDa (26,7 kDa/msGFP-Molekül). Dennoch ist auf dem nativen Elektrophoresegel das scheinbare Molekulargewicht der msfGFP-markierten Komplexe nicht von dem der nicht markierten Komplexe zu unterscheiden.
Eine ergänzende Technik, um zu testen, ob die Septinkomplexe intakt sind, ist die Massenphotometrie mittels iSCAT-Mikroskopie. iSCAT überwacht die Lichtstreuung von Molekülen, die auf einem Objektträger landen, verstärkt durch Interferenz mit Referenzlicht, typischerweise die Reflexion des Lasers auf dem Boden des Objektträgers. Dann wird ein Hintergrundsubtraktionsansatz verwendet, um den Partikeln einen Kontrast zu geben. Aufgrund dieser Korrektur zeigt das Signal positive und negative Werte an, je nachdem, ob die Partikel auf dem Glas landen oder sich von ihm entfernen49. Das detektierte Signal ist direkt proportional zum Molekulargewicht der Proteine50. Daher kann eine Signal-zu-Masse-Kalibrierung mit einem Massenstandard die Masse der Probenproteine bestimmen. Abbildung 3C zeigt ein Beispiel für menschliche Septin-Oktamere, die SEPT9_i1 enthalten. Die meisten der detektierten Einzelpartikel (~50%) haben ein Molekulargewicht, das für vollständige Oktamere mit SEPT9_i1 (423 kDa) erwartet wird (Abbildung 3C). Es gibt auch Partikel mit Massen zwischen 150-300 kDa, aber es wird kein klarer Peak beobachtet, was auf das mögliche Vorhandensein anderer Septinspezies in geringer Häufigkeit hinweist. Ebenso haben die meisten der detektierten Einzelpartikel für mEGFP-markierte Drosophila-Hexamer ein Molekulargewicht, das für intakte Hexamer erwartet wird (361 kDa) (Abbildung 3D). Ein zusätzlicher klarer Peak bei 241 kDa zeigt das Vorhandensein stabiler Tetramere an, die zwei Erdnussproteine enthalten, ein DSep1 und ein mEGFP-DSep2. Schließlich zeigen sowohl der menschliche als auch der Fliegenseptinkomplex einen Peak um 80 kDa, der eine Mischung aus Monomeren und Dimeren sein könnte, möglicherweise verstärkt durch eine Spur von DTT oder einem anderen kleinen Molekül, das aggregiert, was einen Peak in der positiven Seite des Diagramms45 zeigt.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2.jpg"> Abbildung 3: Beispiele für Ergebnisse der Oligomer-Qualitätskontrolle . (A) Beispiel für ein Denaturierungsgel, das verschiedene Anteile des Elutionspeaks aus der Reinigung von dunklem menschlichem Septin octamers_9i1. (B) Beispiel für eine native Elektrophorese verschiedener Septinkomplexe. (C,D) Verschiedene Beispiele für Histogrammergebnisse der Massenphotometrie bei 12,5 nM Septinkomplexen: (C) dunkles humanes Septin octamers_9i1 und (D) DSep1-msfGFP Drosophila septin hexamers. Linien sind Gaußsche Anfälle. (E) TEM-Bild von 25 nM dunklem menschlichem Septin octamers_9i1 im Septinpuffer. Maßstabsbalken = 200 nm. (F) Klassendurchschnittsbild von SEPT2-msfGFP humanem Septin octamers_9i1. Die msfGFP-Tags sind als Fuzzy-Dichten an den beiden Enden sichtbar. Maßstabsbalken = 10 nm. Die Tafeln (E) und (F) unterliegen dem Copyright von The Company of Biologists und wurden mit Genehmigung von Iv et al.10 angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Da sowohl native Gele als auch iSCAT nur ensemblegemittelte Informationen liefern, wurde die Klassenmittelung von Transmissionselektronenmikroskopiebildern einzelner Septin-Oligomere verwendet, um die Integrität und Reinheit der Komplexe durch direkte Visualisierung zu überprüfen. In TEM-Bildern von Septinkomplexen im Septinpuffer können Stäbchen von 24 nm (Hexamer) oder 32 nm (Oktamere) Länge beobachtet werden. Ein Beispiel für ein menschliches Septin-Oktamer, das SEPT9_i1 enthält, ist in Abbildung 3E zu sehen. Bei Klassenmittelung kann jede der Untereinheiten beobachtet und gezählt werden, wie für den msfGFP-markierten menschlichen Oktamer mit SEPT9_i1 in Abbildung 3F zu sehen ist. Wenn das Oligomer fluoreszierend markiert ist, können zusätzliche Dichten beobachtet werden, die dem SEPT2-msfGFP am Ende der Stäbchen entsprechen (Abbildung 3F).
Die Kombination der oben genannten Techniken beweist, dass Oktamere (oder Hexamere) mit dem richtigen stöchiometrischen Verhältnis und hoher Reinheit unter Verwendung des beschriebenen Protokolls gereinigt werden können. Die letzte Qualitätskontrolle schließlich betrifft die Funktionalität der Septinkomplexe hinsichtlich ihrer Polymerisationsfähigkeit. In Gegenwart einer niedrigen Salzkonzentration (<150 mM KCl mit dem beschriebenen Puffer 9) lagern sich Septine, wenn sie nicht in Gegenwart anderer Proteine oder negativ geladener Lipidmembranen vorliegen, zu Bündeln9 zusammen. Septine werden an der Polymerisation gehindert, indem sie im Speicherpuffer gehalten werden, der eine hohe (300 mM) KCl-Konzentration aufweist. Die Septin-Hetero-Oligomere werden dann in einem Puffer der gleichen Zusammensetzung, jedoch ohne KCl, mit einem Volumenverhältnis von 1:6 verdünnt, um eine endgültige KCl-Konzentration von 50 mM zu erreichen. Für die Fluoreszenzbildgebung wird dieser Puffer durch ein Sauerstofffängersystem zum Schutz vor Photobleiche und durch einen blinkenden Suppressor ergänzt. In der TIRF-Mikroskopie können kleine Cluster von Proteinen innerhalb des flachen TIRF-Feldes (~100 nm; Abbildung 4A,B). Auf einem konfokalen Mikroskop sind große Cluster filamentöser Strukturen zu sehen, die weiter oben in Lösung schweben (Abbildung 4C). Schließlich können mit TEM kleine Bündel von Septin (Abbildung 4D), die den von TIRF beobachteten Clustern entsprechen, und große Bündel (Abbildung 4E), die den durch konfokale Mikroskopie beobachteten Strukturen entsprechen, beobachtet werden. Die Einschübe in Abbildung 4D,E zeigen, dass beide Arten von Strukturen aus langen, dünnen Filamenten bestehen, die parallel verlaufen und Bündel mit konischen Enden bilden. Zusammen beweisen die Fluoreszenz- und TEM-Bilder, dass die gereinigten Septinkomplexe zu Filamenten polymerisieren können, die sich wiederum selbst zu Bündeln zusammensetzen.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig04.jpg"> Abbildung 4: Beispiele für Ergebnisse der Qualitätskontrolle der Polymerisationsfähigkeit. (A) TIRF-Bild von 300 nM humanen Septin-Hexamern (10% msfGFP-markierte Hexamere) in fluoSPB. (B) TIRF-Bild von 300 nM humanen Septin-Oktameren mit SEPT9_i1 (10% msfGFP-markierte octamers9_i1) in fluoSPB. (C) Konfokale Projektionen mit maximaler Intensität von Z-Stacks über ~30 μm mit 0,5 μm Abstand von 300 nM menschlichem Septin octamers_9i3 in fluoSPB. (A-C) Maßstabsbalken = 10 μm und invertierte Graustufen. (D,E) Beispiele für TEM-Bilder von (D) kleinen und (E) großen Bündeln von menschlichem Septin, die in darkSPB octamers_9i1. Einschübe zeigen Regionen, in denen klare Filamente beobachtet werden können, die innerhalb des Bündels parallel verlaufen. Maßstabsbalken = 500 nm. Panels (C-E) unterliegen dem Copyright von The Company of Biologists und wurden von Iv et al.10 mit Genehmigung angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Tabelle 1: Liste der Plasmide. Plasmide zur Reinigung von Septin-Oligomeren nach diesem Protokoll. Alle Plasmide wurden in Addgene deponiert (erste Spalte). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%201_V2.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: Liste der Puffer. Pufferzusammensetzungen zur Reinigung und Qualitätskontrolle von Septin-Oligomeren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%202(1).xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 3: Molekulargewichte und Extinktionskoeffizienten. Liste der Molekulargewichte (MW) und optischen Extinktionskoeffizienten (ε) bei einer Wellenlänge von 280 nm, berechnet mit ProtParam basierend auf den Sequenzen des Komplexes, unter der Annahme einer linearen Fusion der Septin-Untereinheiten, der verschiedenen Septin-Komplexe und der eindeutigen Septin-Untereinheiten (nur MW), die mit den in Tabelle 1 aufgeführten Plasmiden gereinigt werden können. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%203.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

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Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution

Die In-vitro-Rekonstitution von Zytoskelettproteinen ist ein wichtiges Werkzeug, um die grundlegenden funktionellen Eigenschaften dieser Proteine zu verstehen. Die vorliegende Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Reinigung und Bewertung der Qualität von rekombinanten Septinkomplexen, die eine zentrale Rolle bei der Zellteilung und -migration spielen.

Reinigung und Qualitätskontrolle von rekombinanten Septinkomplexen zur zellfreien Rekonstitution

Septins are a family of conserved eukaryotic GTP-binding proteins that can form cytoskeletal filaments and higher-order structures from hetero-oligomeric ...

Dieses Protokoll ermöglicht es, qualitativ hochwertige Septinkomplexe zu reinigen, und dies ist unerlässlich, um die vielen Rollen von Septinen in der Zelle zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist die Synthese eines einfachen Verfahrens zur Reinigung von hochwertigem Septin mit Addgene-Plasmiden. Septine sind aufgrund ihrer vielen Wechselwirkungen in Zellen schwer zu untersuchen.Die Schwefelrekonstitution hilft uns, diese Komplexität zu entwirren, indem wir sie in einem einfachen System untersuchen. Wir empfehlen, die Reinigung an einem einzigen Tag durchzuführen, um einen Abbau zu verhindern. Nach unserer Erfahrung erhöht dies die Lebensdauer und die Qualität des Proteins.Um zu beginnen, züchten Sie die transformierte Bakterienkultur bei 37 Grad Celsius in einem Shaker-Inkubator, bis die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern zwei bis drei für unmarkierte Septine oder 0,6 bis 0,8 für msfGFP oder mEGFP-markierte Septine erreicht. Nach der Inkubation induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von 0,5 Millimol und inkubieren Sie die Zellen, die unmarkierte Septin-Hetero-Oligomere bei 37 Grad Celsius exprimieren, für drei Stunden oder die Zellen, die msfGFP-markierte Hetero-Oligomere bei 17 Grad Celsius über Nacht exprimieren. Dann pelletieren Sie die Zellen bei 4.000 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.Verwerfen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet in 100 Milliliter Lysepuffer, um die Zellen zu lysieren. Als nächstes verwenden Sie einen Spitzenbeschaller mit 30% Amplitude, um die Zelle zu beschallen. Klären Sie das Zelllysat durch Zentrifugieren bei 20.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius und sparen Sie den Überstand.Optional wird eine Probe zur Denaturierung der Elektrophorese entnommen, wie im Manuskript beschrieben. Für die Affinitätschromatographie von His-markierten Septinen ist eine vorverpackte Nickel-Sepharose-Hochleistungschromatographiesäule mit allen erforderlichen Puffern auszugleichen. Laden Sie den geklärten Überstand in die Säule und starten Sie das Chromatographiesystem.Anschließend eluieren Sie die Septinkomplexe mit 50% HisTrap-Elutionspuffer bei einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute. Um eine Imidazolkonzentration von 250 Millimol zu erhalten, sammeln Sie 0,5 Milliliter Fraktionen. Überwachen Sie nun die optische Absorption des Eluats bei 280 Nanometern mit einem schnellen Proteinflüssigkeitschromatographiesystem und picken Sie die Fraktionen, die Septinkomplexe enthalten.Für die Affinitätschromatographie von Strep-II-markierten Proteinen äquilibrieren eine vorverpackte StrepTactin Sepharose Hochleistungschromatographiesäule mit Septinpuffer. Laden Sie das aus der Nickelsäule gewonnene Septin enthaltende Fraktionen mit einer Rate von einem Milliliter pro Minute und starten Sie das Chromatographiesystem. Dann waschen Sie das gebundene Protein und eluieren Sie die Septinkomplexe mit 100% StrepTrap Elutionspuffer bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute.Um eine Konzentration von 2,5 Millimolar Desthiobiotin zu erhalten, sammeln Sie 0,5 Milliliter Fraktionen. Wählen Sie die Fraktionen, die Septinkomplexe enthalten, wie durch die optische Absorption des Eluats bei 280 Nanometern angezeigt, die online mit einem schnellen Proteinflüssigkeitschromatographiesystem überwacht werden. Nach dem Entfernen des Desthiobiotins durch Dialyse aliquot die Proteinkomplexe in die gewünschte aliquote Größe, schnappen Sie das Aliquot ein und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius.Für die interferometrische Streumikroskopie waschen Sie Glasobjektträger Nummer 1.5, indem Sie sie in einem Ultraschallreiniger jeweils fünf Minuten lang in Wasser, Isopropanol und erneut in entionisiertem Wasser beschallen. Trocknen Sie zwei Glasobjektträger mit einem sanften Stickstoffgasstrom. Geben Sie dann einen sieben Mikroliter Tropfen 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung auf die Mitte eines der Objektträger und legen Sie die Mitte des anderen Objektträgers auf den Poly-L-Lysin-Tropfen, wobei die beiden Objektträger orthogonal ausgerichtet werden, um eine einfache Trennung zu ermöglichen.Nach 30 Sekunden Inkubation waschen Sie den Objektträger, indem Sie ihn einmal in ein Becherglas mit entionisiertem Wasser tauchen und zweimal direkt einen Wasserstrahl auftragen. Trocknen Sie sie mit einem Stickstoffgasstrom und diese Objektträger können etwa sechs Wochen bei Raumtemperatur unter trockenen Bedingungen gelagert werden. Schneiden Sie vor dem Experiment ein Stück von zwei mal zwei, drei mal zwei oder drei mal drei Dichtungen ab und kleben Sie sie auf den mit Poly-L-Lysin behandelten Teil eines Objektträgers, wobei Sie vermeiden, dass der Objektträger und die Dichtungen eine schmutzige Oberfläche berühren, indem Sie den Objektträger auf ein leichtes Wischertuch legen.Drücken Sie nun die Dichtungen mit einer Pipettenspitze, um sie mit dem auf den Dichtungen vorhandenen schützenden Kunststoff zu verkleben. Als nächstes erwärmen Sie den Septinpuffer auf Raumtemperatur. Die Proteine in der Hand auftauen und anschließend auf Eis halten.Legen Sie dann den Objektträger mit Dichtungen auf das handelsübliche Massenphotometriesystem mit 19 Mikrolitern Septinpuffer und fokussieren Sie das Mikroskop mit der Autofokus-Option. Fokussieren Sie mit den neuen Einstellungen mithilfe der Autofokus-Option. Klicken Sie zum Erstellen eines Projektordners auf Datei gefolgt von Neues Projekt, und um einen Projektordner zum Speichern von Daten zu laden, klicken Sie auf Datei und anschließend auf Projekt laden.Dann pipettieren Sie einen Mikroliter Probe auf 19 Mikroliter Septumpuffertropfen. Mischen Sie und vermeiden Sie beim Mischen das Berühren von etwas, um die Bewegung des Objektträgers zu verhindern. Nehmen Sie dann ein Video mit 6.000 Bildern auf, indem Sie auf Aufnahme klicken.Analysieren Sie die Videos mit der Software des Herstellers, um die Proteinmassenverteilung zu erhalten. Wenn sich die Peaks verschiedener Septin-Hetero-Oligomer-Größen zu stark überlappen oder zu viele Ereignisse detektiert werden, verringern Sie die endgültige Septinkonzentration und messen erneut. Und wenn nicht genügend einzelne Moleküle gezählt werden, erhöhen Sie die Septinkonzentration und messen Sie erneut.Für die Septinanalyse bereiten Sie das 5X darkSPB und eine Septinmischung bestehend aus 100% dunklem Septin in sechsmal höherer Konzentration als die gewünschte Endkonzentration im Septinpuffer und einem Millimolar Dithiothreitol vor. Polymerisieren Sie dann das Septin durch Mischen von Wasser, 20% 5X darkSPB und 16,67% Septinmischung, in dieser spezifischen Reihenfolge, und inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie drei bis fünf Mikroliter Probe in ein glühendes Elektronenmikroskopiegitter hinzu und inkubieren Sie für eine Minute.Waschen Sie nun das Gitter zweimal, indem Sie einen Tropfen darkSPB-Puffer hinzufügen und die Flüssigkeit mit einem Filterpapier absorbieren. Einmal mit Wasser waschen und 30 Sekunden mit 2%Uranylacetat inkubieren. Als nächstes tupfen Sie den Fleck ab und trocknen Sie die Probe einige Minuten an der Luft.Dann bilden Sie die Septinbündel bei 120 Kilovolt und Vergrößerungen zwischen 5.000X und 60.000X mit einer Unschärfe von ein bis zwei Mikrometern ab. Das HisTrap- und das StrepTrap-Chromatogramm zeigten, dass die gepoolte Fraktion vom Beginn des Elutionspeaks bis zur Stabilisierung der Absorption bei etwa 250 Milliliter bzw. 50 Milliliter ging. Die Septinbänder zeigten ähnliche Intensitäten bei der Denaturierungsgelelektrophorese, was darauf hindeutet, dass die Septine intakt sind.Bei der nativen Elektrophorese wurden die Hauptbande beobachtet, die den intakten Hetero-Oligomeren entspricht, und eine kleine Bande, die Trimoren oder Tetrameren entspricht. Das scheinbare Molekulargewicht der msfGFP-markierten Komplexe ist nicht von dem der nicht markierten Komplexe zu unterscheiden. Die Massenphotometrie detektierte intakte Oktamere und Hexamer von Septinen.Ein zusätzlicher Peak von 241 Kilodalton zeigte das Vorhandensein von zwei Erdnussproteinen, DSep1 und mEGFP-DSep2. Transmissionselektronenmikroskopische Bilder von Septinkomplexen zeigten Stäbchen von Hexamern und Oktameren. Die msfGFP-Tags sind als Fuzzy-Dichten an den beiden Enden in Septin 2 msfGFP human septin octamers_9i1 sichtbar.Kleine Cluster von Proteinen können im flachen TIRF-Feld beobachtet werden. Die konfokale Mikroskopie zeigte große Cluster schwimmender filamentöser Strukturen. Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigte kleine und große Septinbündel, die den Clustern entsprechen, die durch Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie und konfokale Mikroskopie beobachtet wurden.Wir empfehlen, während der Reinigung immer auf Eis zu arbeiten und frische Reagenzien hinzuzufügen, die wir im Protokoll angeben. Wir interessieren uns für Wechselwirkungen von Septinen im Kontext der Zytokinese. Wir rekonstituierten Septin zusammen mit modernen Membranen Aktin und Mikrotubuli, um sie mit Mikroskopie und mehreren biophysikalischen Assays zu untersuchen.Wir verwenden die gereinigten Septine, um zu untersuchen, wie Septine mit Aktinfilamenten, Mikrotubuli und Lipiden interagieren. Und wir verwenden die gereinigten Septine auch, um synthetische Zellen zu bauen, wo die Septine die Zellteilung erleichtern.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Forschung

Biochemie

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horizontale Gel-Elektrophorese zur verbesserten Nachweis von Protein-RNA-Komplexen

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Kristallstruktur des N-terminale Domäne des Ryanodin-Rezeptoren von Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Biosynthese eines Flavonols aus einem Flavanon durch Die Etablierung einer Ein-Topf-Bienzymatischen Kaskade

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin in Liposomen für Lipid-Mischtests

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...