Name: purification and quality control of recombinant septin complexes for cell-free reconstitution
Uploaded: 2022-06-23T13:00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution at JoVE.com

אנו מודים לססיליה דה אגרלה פינטו, תומס דה גאראי וקתרינה האוסרמן על עזרתם בניסויי פוטומטריה המונית (iSCAT); ארג'ן יעקובי ו-וייל אוורס על עזרתם ב-TEM; לוצ'יה בלדוף על עזרתה ב-TIRF; פסקל ורדייה-פינארד על עצתו בנוגע לאלקטרופורזה מקומית; אגטה סובה ומרג'וליין וינקנוג על עזרתן בהקמת מאמצי טיהור ספטין דרוזופילה, והדמיית תאים ורקמות (PICT-IBiSA), מכון קירי, חבר בתשתית המחקר הלאומית הצרפתית צרפת-ביו-דימות (ANR10-INBS-04). מחקר זה קיבל מימון מהארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO/OCW) באמצעות מענק הכבידה 'BaSyC-Building a Synthetic Cell' (024.003.019) ומהסוכנות הלאומית למחקר (ANR מעניקה ANR-17-CE13-0014: "SEPTIMORF"; ANR-13-JSV8-0002-01: "ספטמבר"; ו ANR-20-CE11-0014-01: "SEPTSCORT").

המחברים מצהירים על היעדר אינטרסים מתחרים או כלכליים.

השיטה המתוארת כאן מאפשרת טיהור חזק ובקרת איכות של הטרו-אוליגומרים של ספטין שנוצרו מראש. חלק מהנושאים המרכזיים שיש לקחת בחשבון ליישום הנכון של השיטה הם כדלקמן. במהלך שלבי האלוציה בהפרדות הכרומטוגרפיות, חשוב להשתמש בקצב הזרימה המומלץ (או הנמוך יותר) כדי למזער את הדילול של מתחמי המחיצות. בנוסף, כדי למקסם את התאוששות החלבון בשלב הריכוז הסופי, עמודת הריכוז מכוונת באופן כזה שהתמיסה לא נדחפת כנגד המסנן (כאשר יש רק מסנן בצד אחד). אם הפתרון הולך ישירות למסנן, החלבון נדבק אליו הרבה יותר, ומקטין באופן משמעותי את התשואה הסופית. כמו כן חשוב לקחת בחשבון כי צעד הריכוז לא תמיד הכרחי. בחירת שברים רק מטווח צר סביב השיא בכרומטוגרמה בדרך כלל נותנת ריכוז מלאי גבוה מספיק (>3,000 ננומטר) עבור יישומי שחזור רבים (הפועלים בדרך כלל בין 10-300 ננומטר). לבסוף, עבור בקרת איכות של הפונקציונליות של קומפלקסים septin על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, חשוב להעביר כראוי את פני השטח של שקופיות מיקרוסקופיה, שכן מתחמי septin דבק בשקיקה זכוכית. פסיבציה של שקופיות הזכוכית יכולה להיעשות באמצעות פונקציונליזציה של PLL-PEG או על ידי היווצרות של דו-שכבתי שומנים נתמכים ניטרליים (100% DOPC)11,32.
בהשוואה לפרוטוקול הטיהור המקורי שתואר לראשונה ב- Iv et al.10, חל שינוי בהרכבי החיץ (טבלה 2). הריכוז של MgCl2 הופחת מ-5 mM ל-2mM, והריכוז וה-pH של Tris-HCl הופחתו מ-50 mM ל-20 mM ומ-8.0 ל-7.4, בהתאמה. שינויים אלה נעשו כדי להפוך את תנאי החיץ לתואמים למחקרים על יחסי הגומלין של ספטינים אנושיים עם דו-שכבתיות שומנים, חוטי אקטין ומיקרוטובולים10,11,32. הסיבה לכך היא שהמחברים יצרו דו-שכבתי שומנים נתמכים ואקטין פולימרי במאגר F, שהרכבו זהה לזה של darkSPB, מלבד נוכחות של ATP במאגר F. שינוי החיץ לא גרם לשינויים באיכות או באורך החיים של המחיצות המטוהרות בהשוואה למאגרים המקוריים.
שיטה זו של טיהור עדיין יש כמה מגבלות. ראשית, ניסיונות טיהור שונים יכולים להשתנות בתפוקה (0.5-1 מ"ל של מתחמי ספטין 2-5 מיקרומטר) ובאיכות הפונקציונלית, כפי שנבדק על ידי יכולת היווצרות הצרור של מתחמי ספטין מטוהרים. לכן חשוב מאוד לבצע בעקביות את בדיקות האיכות המתוארות במאמר זה. שליטה טובה מאוד בזמני הביטוי ובצפיפות האופטית של תרבית החיידקים יכולה לעזור למתן את ההבדל בתפוקה. שנית, צינור הטיהור הזה לא יכול להבחין בין גוזמים והקסמרים או בין טטרמרים לאוקטמרים (איור 1B). עם זאת, ניתן להשתמש בניסויי בקרת האיכות כדי להוכיח שרוב מתחמי הספטין הם בצורת אוליגומר ארוך שלהם. במקרה שנדרשת התפלגות גודל אוליגומר צרה עוד יותר, ניתן להכניס כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל בין שלב 1.6. ושלב 1.7. של פרוטוקול הטיהור. עם זאת, צעד אופציונלי זה מקטין באופן דרמטי את התשואה, והוא אינו מומלץ אלא אם כן הוא נחוץ בהחלט. מגבלה אחרונה, בסיסית יותר, נובעת מהשימוש ב- E. coli כמערכת ביטוי למתחמי ספטין רקומביננטיים. מטבע הדברים, מערכת זו אינה מאפשרת שינויים לאחר תרגום (PTMs), אשר דווחו בתאי בעלי חיים, כגון זרחון, אצטילציה וסומוילציה 6,51,52,53. ניתן להוסיף שינויים פוסט-טרנסלציוניים אלה על ידי יישום אסטרטגיית טיהור דומה בתאי חרקים או בני אדם. יתר על כן, מאמר זה דן רק בשחזור של ספטינים בפני עצמם, אך מחקרים בתאים מצביעים על כך שלחלבונים רגולטוריים כגון חלבונים ממשפחת הבורג 54,55 ואנילין 24,25,56 יכולה להיות השפעה משמעותית אך לא מובנת היטב על ההרכבה והתפקודים של ספטינים, ולכן חשוב לשלב אותם בסופו של דבר במבחנה לימודים. פרוטוקולים לטיהור חלבוני בורג ואנילין דווחו54,57.
פרוטוקול טיהור המחיצות המדווח כאן מציע דרך סטנדרטית לטהר ספטינים בצורתם האוליגומרית עם הסטויכיומטריה הנכונה של תת-יחידות, ומציע התקדמות חשובה על פני מחקרים קודמים רבים במבחנה המסתמכים על יחידות משנה בודדות של ספטין. אף על פי שחלק מהמחיצות בהקשרים ספציפיים יכולות לפעול כתת-יחידה2 יחידה, גוף הספרות הנוכחי מציע כי בתאי בעלי חיים, ספטינים מתפקדים בעיקר בקומפלקסים 9,58. לכן, השימוש בהטרו-אוליגומרים שנוצרו מראש, כמו אלה המתוארים במאמר זה ואחרים 10,11,18,32,35,36,37, הוא בעל חשיבות רבה לחקר התכונות המבניות והביופיזיות של ספטינים באמצעות מבחנה reconstitution לנתח את הפונקציות שלהם בתא. יתר על כן, ספטינים הם חלבונים המרכיבים את עצמם עם שותפים רבים לאינטראקציה, כולל הממברנה והשלד הציטוסקולרי, מה שהופך אותם לבעלי עניין רב בביולוגיה סינתטית מלמטה למעלה 59,60,61 ומחקרים על שינויים הנגרמים על ידי חלבונים בתכונות הביופיזיות של הממברנה כגון עקמומיות42,62,63.

השלד של הציטוסקלטון תואר באופן קלאסי כמערכת בעלת שלושה רכיבים המורכבת מסבי אקטין, מיקרוטובולים וחוטי ביניים 1, אך לאחרונה הוכרו ספטינים כמרכיב רביעי של השלד הציטוסקולרי1. ספטינים הם משפחה של חלבונים קושרי GTP הנשמרים באאוקריוטים2. ספטינים מעורבים בתפקודים תאיים רבים כגון חלוקת תאים3, הידבקות תא4, תנועתיות תאים5, מורפוגנזה6, זיהום תאי7, והתבססות ותחזוקה של קוטביות התא8. למרות הפונקציות החשובות שלהם, איך septins מעורבים בתהליכים כאלה הוא הבין היטב.
משפחת החלבונים ספטין מחולקת למספר תת-קבוצות (ארבע או שבע, בהתאם לסיווג) בהתבסס על דמיון ברצף חלבונים2. חברים בתת-קבוצות שונות יכולים ליצור קומפלקסים הטרו-אוליגומריים פלינדרומיים, שהם אבני הבניין של חוטים ואשר, בתורם, מתכנסים למבנים מסדר גבוה יותר כגון צרורות, טבעות ורשתות רשת 1,9,10,11,12. מורכבות מולקולרית נוספת נובעת מנוכחותם של גרסאות שחבור שונות, דוגמה לכך היא SEPT9 אנושי, שם יש ראיות לפונקציות ספציפיות של גרסאות שחבור שונות13,14,15. בנוסף, אורך ההטרו-אוליגומרים תלוי במין ובסוג התא. לדוגמה, ספטינים של Caenorhabditis elegans יוצרים טטרמרים16, ספטינים של Drosophila melanogaster יוצרים הקסמרים 17 (איור 1A), ספטינים של Saccharomyces cerevisiae יוצרים אוקסטארים 18, וספטינים אנושיים יוצרים גם הקסמרים וגם אוקסטמרים19 (איור 1A). יכולתם של איזופורמים של ספטין, גרסאות שחבור וספטינים שעברו שינוי לאחר תרגום מאותה תת-משפחה להחליף זה את זה בקומפלקס והקיום (המשותף) של הטרו-אוליגומרים בגדלים שונים הקשו על תיחום הפונקציות התאיות של קומפלקסים הטרו-אוליגומריים שונים12.
יכולת מעניינת נוספת של ספטינים היא יכולתם לקיים אינטראקציה עם שותפים מקשרים רבים בתא. ספטינים קושרים את קרום הפלזמה ואת האברונים הממברניים במהלך אינטרפאזה וחלוקת תאים20,21,22. בחלוקת תאים, ספטינים משתפים פעולה עם אנילין 23,24,25 ואקטין ומיוזין במהלך ציטוקינזיס 26,27. בשלבים מאוחרים של ציטוקינזיס, נראה כי ספטינים מווסתים את מתחמי המיון האנדוזומליים הדרושים למערכת ההובלה (ESCRT) עבור abscission midbody28. בנוסף, יש גם עדויות לכך שספטין ממוקם על קליפת המוח אקטין וסיבי עקה אקטין של תאים בתאים בין-פאזיים 29,30,31. בסוגי תאים ספציפיים, ספטינים גם קושרים ומווסתים את שלד הציטוסקול של המיקרוטובול32,33.
כל התכונות הללו הופכות את הספטינים למערכת חלבונים מעניינת מאוד למחקר, אך גם למאתגרת. השילוב של המספר הגדול של תת-יחידות ספטין (13 גנים בבני אדם מבלי לספור גרסאות שחבור2) עם הפוטנציאל של תת-יחידות ספטין מאותה תת-משפחה להחליף זו את זו וליצור הטרו-אוליגומרים בגדלים שונים מקשה על הסקת מסקנה על התפקוד התאי של ספטין מסוים על ידי מניפולציה גנטית. יתר על כן, האינטראקציות המרובות של ספטינים הופכות את פענוח ההשפעות של כלי מחקר נפוצים כגון תרופות34 המכוונות לרכיבים ציטוסקטליים או ממברנה למשימה קשה.
דרך להתגבר על מצב זה היא להשלים את המחקר בתאים עם שחזור חוץ גופי (ללא תאים) של ספטינים. שחזור במבחנה מאפשר בידוד של סוג יחיד של הטרו-אוליגומרים ספטין עם הרכב תת-יחידה מסוים ואורך 18,35,36,37. לאחר מכן ניתן לחקור קומפלקס זה בסביבה מבוקרת, לבד כדי לגלות את התכונות המבניות והפיסיקוכימיות הבסיסיות של ספטינים 38,39,40, או בשילוב עם שותפים רצויים כגון מודלים ביולוגיים 11,41,42, חוטי אקטין 10,27, או מיקרוטובולים 32,36 כדי לפענח את טבעם של אינטראקציות.
לכן, שיטה אמינה לטהר מתחמי ספטין שונים ביעילות היא חיונית למחקר ספטין. עם זאת, אפילו באמצעות אותו פרוטוקול, טיהורים שונים יכולים לתת חלבונים עם פעילות / פונקציונליות שונה או אפילו שלמות. עבור חלבונים זמינים מסחרית כגון אנזימים, הפונקציונליות והפעילות האנזימטית מאומתות בקפידה43. יישום בקרת איכות קפדנית עבור חלבונים ציטוסקטליים או מבניים כגון ספטינים יכול להיות מאתגר, אך חיוני להפוך ניסויים במעבדות שונות לדומים.
מאמר זה מתאר שיטה חזקה לטיהור ספטינים רקומביננטיים באיכות גבוהה בצורתם ההטרו-אוליגומרית המבוססת על ביטוי סימולטני של שני וקטורים המכילים מבנים חד-סטריים או דו-ציסטרוניים (טבלה 1) בתאי Escherichia coli. השיטה מורכבת מגישה של כרומטוגרפיית זיקה דו-שלבית ללכידת הטרו-אוליגומרים של ספטין המכילים גם ספטין בעל 6תגים וגם ספטין מתויג Strep-II (איור 1B,C). פרוטוקול זה, שתואר לראשונה ב- Iv et al.10, שימש לטיהור הקסמרים של ספטין דרוזופילה 11,27,35, הקסמרים של ספטין אנושיים 10, ומספר אוקסטמרים של ספטין אנושי המכילים איזופורמים מקומיים שונים (איזופורם 1, 3 ו- 5)10,32 או מוטציה של SEPT9 32 . יתר על כן, תיאור של קבוצה של טכניקות כדי להעריך את האיכות של septins מטוהרים ניתנת. ראשית, השלמות והסטויכיומטריה הנכונה של תת-היחידות של ספטין נבדקת באמצעות אלקטרופורזה דנטורית ומיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM). לאחר מכן, נוכחותם של הטרו-אוליגומרים בעלי המסה המולקולרית הנכונה ונוכחותם של מונומרים או אוליגומרים קטנים יותר המעידים על אי-יציבות מורכבת נבחנים על ידי אלקטרופורזה מקומית ופוטומטריית מסה באמצעות מיקרוסקופיית פיזור אינטרפרומטרית (iSCAT). לבסוף, השלב האחרון מורכב מהערכת פעילות הפילמור של המחיצות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ו- TEM.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2.jpg"> איור 1: אסטרטגיית טיהור. (A) סכמות של הטרו-אוליגומרים של ספטין הקיימות בתאים אנושיים (שמאליים) ודרוזופילה (מימין). מספרים מציינים יחידות משנה של ספטין מהקבוצות המצוינות, ו- P מציין בוטנים. SEPT9 אנושי יכול להיות כל אחד מהאיזופורמים שלו. לתת-היחידות של ספטין יש צורה אסימטרית והן משויכות אורכית לשני ממשקים נפרדים, ממשק NC:NC וממשק G:G, כפי שמצוין על ידי NC ו- G, בהתאמה, על גבי ההקסמר האנושי. (ב,ג) המחשה סכמטית של אסטרטגיית הכרומטוגרפיה הדו-שלבית, המוצגת עבור (B) הקסמרים של ספטין אנושיים ו-(C) אוקסטארים. H מציין את התגים שלו, בעוד S מציין את תגי Strep-II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>488nm laser combiner iLAS2</td>
			<td>Gataca</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488nm Sapphire laser lines</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4k X 4k F416 CMOS camera</td>
			<td>TVIPS</td>
			<td></td>
			<td>For JEM-1400plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x sample buffer nativePAGE</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (TROLOX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>To prevent blinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 M1</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>1680311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Type-B, 300 mesh EM grid</td>
			<td>Ted pella</td>
			<td>01813-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Type-B, 300 mesh EM grid</td>
			<td>Electron micoscopy sciences</td>
			<td>CF300-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass #1.5H</td>
			<td>Thorslabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1-M1 confocal unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desthiobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1411-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibtor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>481761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP, 5 mL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>29-0588-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iLAS2 azimuthal TIRF illumination system&#160;</td>
			<td>Gataca</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1202-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Protein Gel Stain</td>
			<td>Westburg Life Sciences</td>
			<td>EP ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>10849040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 888 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EM-CCD&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400plus</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td>TEM microscope TUDelft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kappa-cassein&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-6X1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971-10G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746452-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylecllulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8074844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ system (Integral 10)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td></td>
			<td>I-water dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean TGX gels</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativeMark unstained protein standard</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC0725</td>
			<td>For iSCAT and Native gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE 4-16% GELS</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN1002BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE Running Buffer kit</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E&#160;</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nr. 1 Menzel coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo &#215;100/1.45 NA oil immersion objective</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(L-lysine)-graft-biotinylated PEG (PLL-PEG)</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>CHF560.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution 0.01%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td>For iSCAT glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for native gels</td>
			<td>CONSORT</td>
			<td>S/N 71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWERPAC UNIVERSAL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>042BR31206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td>oxygen scavenger - enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03930590-50MG</td>
			<td>oxygen scavenger - reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quemesa camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Tecnai Spirit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refeyn OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample buffer, laemmli 2x concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-10vl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon gaskets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL103250-10EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes 30k MWCO 3mL</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>66381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1441-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap HP, 1 mL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>28-9075-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit microscope</td>
			<td>Thermo Scientific, FEI</td>
			<td></td>
			<td>TEM microscope Institute Curie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0918-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/Glyine/SDS buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6, 30,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0622</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and quality control of recombinant septin complexes for cell-free reconstitution

ספטינים הם משפחה של חלבונים קושרי GTP אאוקריוטים משומרים שיכולים ליצור חוטים ציטוסקטליים ומבנים מסדר גבוה יותר מקומפלקסים הטרו-אוליגומריים. הם מתקשרים עם רכיבים ציטוסקטליים אחרים ועם קרום התא כדי להשתתף בתפקודים תאיים חשובים כגון נדידה וחלוקת תאים. בשל המורכבות של האינטראקציות הרבות של ספטינים, המספר הרב של גנים של ספטין (13 בבני אדם), והיכולת של ספטינים ליצור קומפלקסים הטרו-אוליגומריים עם הרכבי תת-יחידות שונים, שחזור ללא תאים הוא אסטרטגיה חיונית להבנת היסודות של הביולוגיה של ספטין. המאמר הנוכחי מתאר לראשונה שיטה לטיהור ספטינים רקומביננטיים בצורתם ההטרו-אוליגומרית באמצעות גישה של כרומטוגרפיית זיקה דו-שלבית. לאחר מכן, תהליך בקרת האיכות המשמש לבדיקת הטוהר והשלמות של מתחמי ספטין מפורט. תהליך זה משלב אלקטרופורזה מקומית של ג'ל דנטורציה, מיקרוסקופיית אלקטרונים של כתמים שליליים ומיקרוסקופיה של פיזור אינטרפרומטרי. לבסוף, ניתן תיאור של התהליך לבדיקת יכולת הפילמור של קומפלקסי ספטין באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים של כתמים שליליים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. זה מדגים כי ניתן לייצר באיכות גבוהה hexamers ספטין אנושי octamers המכילים איזופורמים שונים של septin_9, כמו גם Drosophila septin hexamers.

כפי שצוין בפרוטוקול, 5 L של תאי E. coli שעברו טרנספורמציה משותפת עם שני הפלסמידים המבטאים ספטין גדלו, והביטוי של ספטינים הושרה על ידי הוספת IPTG. לאחר 3 שעות, התאים נאספו על ידי צנטריפוגה, הוחזרו בחיץ תזה, ושוכבו על ידי סוניקציה. לאחר מכן הובהר הליזאט על ידי צנטריפוגה, והפתרון המובהר הוחל על עמוד HisTrap (איור 2A). לאחר הטיהור הראשון, השברים המכילים ספטין אוחדו והושמו על עמוד StrepTrap (איור 2B). זה בדרך כלל מניב סביב 3-5 מ"ל של ~ 1 μM קומפלקס ספטין. לפני איגום השברים המכילים ספטין, ניתן להשתמש באלקטרופורזה של ג'ל דנטורינג כדי לבדוק את שלמות תת-היחידות של ספטין ואת היחס הסטויכיומטרי השווה בין תת-היחידות השונות של ספטין המרכיבות את המרכובת. (איור 3A). אם הג'ל מראה פסים עזים דומים המתאימים למשקלים המולקולריים (טבלה 3) של תת-יחידות הספטין, ניתן להמשיך את הפרוטוקול. אם לא, מומלץ להפעיל את הפרוטוקול שוב. בדוגמה המוצגת עבור ספטין אוקטמר אנושי עם SEPT9_i1, איור 3A מראה בבירור רצועות המתאימות ל-SEPT9_i1, SEPT6, SEPT7 ו-SEPT2 (בסדר מלמעלה למטה) בעוצמות דומות; הרווח בר-סמך של 99% של העוצמה המנורמלת היה 1.128 ± 0.048 עבור SEPT2, 1.092 ± 0.034 עבור SEPT6, 1.108 ± 0.040 עבור SEPT7, ו- 1.067 ± 0.029 עבור SEPT9. אם SEPT2 מתויג עם msfGFP, הוא יזוז קרוב מאוד מתחת SEPT9_i1. בהתאם למערכת האלקטרופורזה המשמשת ולנוכחות של תג TEV-Strep מסוף C עבור SEPT7 (מה שגורם לו לנדוד לאט יותר מאשר SEPT7 לא מתויג), רצועות SEPT7 ו- SEPT6 מתמזגות לעיתים בשל משקלן המולקולרי הדומה. השלב הבא הוא לאגד את השברים ולדייק אותם כנגד מאגר ספטין עם DTT. לאחר הדיאליזה, אם הריכוז נמוך מדי (<2 מיקרומטר) או שיש צורך בריכוז גבוה יותר לניסויים, ניתן לכלול שלב ריכוז, כמתואר בפרוטוקול. ריכוזים מתחת ל-1 μM מצביעים בדרך כלל על איכות תפקודית גרועה של המחיצות. ריכוז קומפלקס ספטין סופי בין 3.5 μM ל-7 μM פועל היטב עבור רוב הבדיקות במבחנה . ריכוזים אלה מתקבלים בדרך כלל כאשר נפח לאחר הריכוז מגיע 0.5-1 מ"ל.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig02.jpg"> איור 2: כרומטוגרמות לדוגמה המתאימות לטיהור של ספטין אנושי כהה octamers_9i1 . (A) כרומטוגרמה של עמודת HisTrap. לאחר שיא האלוציה של ספטין, הספיגה אינה חוזרת לאפס, ככל הנראה בשל נוכחותו של אימידזול בחיץ. השבר המאוגד עבר מתחילת שיא האלוציה עד שהספיגה התייצבה על כ-250 מ"ל. (B) כרומטוגרמה של עמודת סטרפ-טראפ. החלק המאוגד הלך מתחילת שיא האלוציה עד שהספיגה חזרה לסביבות 0 ב-50 מ"ל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
כדי להמשיך בבקרת האיכות, בוצע אלקטרופורזה טבעית, כמתואר בפרוטוקול (איור 3B). בג'לים ניתן לראות להקה מז'ור המתאימה להטרו-אוליגומרים שלמים, ובדרך כלל להקה מינורית המתאימה לדמרים. הקסמרים אנושיים נמצאים מעט מעל רצועת הסמן של 242 kDa, בעוד שאוקטמרים נמצאים מעל רצועת 480 kDa, מעל המסה המולקולרית המחושבת שלהם. מיקומן של להקות אלה נבדק על ידי ניתוח כתמים מערביים של תמציות תאים אאוקריוטים32. תיוג עם msfGFP זוגות כל SEPT2 עם חלבון msfGFP. זה גורם לעלייה במשקל המולקולרי של קומפלקסי ספטין של 53.4 kDa (מולקולת 26.7 kDa/msGFP). עם זאת, על ג'ל האלקטרופורזה המקורי, המשקל המולקולרי לכאורה של קומפלקסים מתויגים msfGFP אינו ניתן להבחנה מזה של קומפלקסים לא מתויגים.
טכניקה משלימה לבדיקה אם קומפלקסי הספטין שלמים היא פוטומטריית מסה על ידי מיקרוסקופיית iSCAT. iSCAT מנטר את פיזור האור של מולקולות הנוחתות על מגלשת זכוכית המוגברת על ידי הפרעה לאור ייחוס, בדרך כלל השתקפות הלייזר בתחתית שקופית הזכוכית. לאחר מכן, נעשה שימוש בגישת חיסור רקע כדי לתת ניגוד לחלקיקים. בשל תיקון זה, האות מראה ערכים חיוביים ושליליים בהתאם לשאלה אם החלקיקים נוחתים על הזכוכית או מתרחקים ממנה49. האות שזוהה הוא ביחס ישר למשקל המולקולרי של חלבונים50. לכן, כיול אות למסה עם תקן מסה יכול לקבוע את המסה של חלבוני הדגימה. איור 3C מראה דוגמה של אוקטמרים אנושיים המכילים SEPT9_i1. רוב החלקיקים הבודדים שזוהו (~50%) הם בעלי משקל מולקולרי הצפוי עבור אוקטמרים שלמים המכילים SEPT9_i1 (423 kDa) (איור 3C). ישנם גם חלקיקים עם מסות בין 150-300 kDa, אך לא נצפתה פסגה ברורה, מה שמעיד על נוכחות אפשרית של מיני ספטין אחרים בשפע נמוך. באופן דומה, רוב החלקיקים הבודדים שזוהו עבור הקסמרים של Drosophila המתויגים על-ידי mEGFP הם בעלי משקל מולקולרי הצפוי עבור הקסמרים שלמים (361 kDa) (איור 3D). שיא ברור נוסף של 241 kDa מצביע על נוכחות של טטרמרים יציבים המכילים שני חלבוני בוטנים, אחד DSep1 ואחד mEGFP-DSep2. לבסוף, גם מתחמי הספטין האנושיים וגם הזבובים מראים שיא סביב 80 kDa שיכול להיות תערובת של מונומרים ודימרים, אולי מוגבר על ידי עקבות של DTT או כל מולקולה קטנה אחרת שמצטברת, מה שמראה שיא בצד החיובי של העלילה45.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2.jpg"> איור 3: דוגמאות לתוצאות של בקרת האיכות של האוליגומר . (A) דוגמה לג'ל דנטורינג המציג שברים שונים של שיא האלוציה מטיהור ספטין אנושי כהה octamers_9i1. (B) דוגמה לאלקטרופורזה מקומית של קומפלקסים שונים של ספטין. (ג,ד) דוגמאות שונות לתוצאות היסטוגרמה של פוטומטריה המונית ב-12.5 ננומטר של קומפלקסי ספטין: (C) ספטין אנושי כהה octamers_9i1 ו-(D) DSep1-msfGFP דרוזופילה ספטין הקסמרים. הקווים הם גזרות גאוס. (E) תמונת TEM של ספטין אנושי כהה בגודל 25 ננומטר octamers_9i1 במאגר ספטין. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. (F) תמונה ממוצעת בכיתה של ספטין אנושי SEPT2-msfGFP octamers_9i1. תגי msfGFP נראים כצפיפויות מטושטשות בשני הקצוות. סרגל קנה מידה = 10 ננומטר. לוחות (E) ו-(F) הם זכויות היוצרים של חברת הביולוגים והותאמו מ-Iv et al.10 באישור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
בהתחשב בכך שגם ג'לים מקוריים וגם iSCAT מספקים מידע ממוצע בלבד, נעשה שימוש בממוצע הסיווג של תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים של אוליגומרים בודדים של ספטין יחיד כדי לבדוק את השלמות והטוהר של הקומפלקסים על ידי הדמיה ישירה. בתמונות TEM של מתחמי ספטין במאגר ספטין, ניתן לראות מוטות באורך של 24 ננומטר (הקסמרים) או 32 ננומטר (אוקטמרים). דוגמה של ספטין אוקטמר אנושי המכיל SEPT9_i1 ניתן לראות באיור 3E. כאשר הכיתה ממוצעת אותם, ניתן לצפות ולספור כל אחת מתת-היחידות, כפי שניתן לראות עבור האוקטמר האנושי המתויג על-ידי msfGFP עם SEPT9_i1 באיור 3F. במקרה שהאוליגומר מסומן באופן פלואורסצנטי, ניתן לראות צפיפויות נוספות המתאימות ל-SEPT2-msfGFP בקצה המוטות (איור 3F).
השילוב של הטכניקות הנ"ל מוכיח כי octamers (או hexamers) עם יחס סטויכיומטרי הנכון טוהר גבוה ניתן לטהר באמצעות הפרוטוקול המתואר. לבסוף, בדיקת בקרת האיכות האחרונה היא עבור הפונקציונליות של מתחמי ספטין במונחים של יכולת פילמור שלהם. בנוכחות ריכוז מלח נמוך (<150 mM KCl עם החיץהמתואר 9), אם ספטינים אינם בנוכחות חלבונים אחרים או ממברנות שומנים טעונות שלילית, הם מרכיבים את עצמם לתוך צרורות9. ספטינים מונעים פילמור על ידי שמירתם במאגר האחסון, בעל ריכוז KCl גבוה (300 mM). לאחר מכן מדוללים ההטרו-אוליגומרים של ספטין ביחס נפח של 1:6 במאגר של אותו הרכב אך ללא KCl כדי להשיג ריכוז KCl סופי של 50 mM. כדי לבצע הדמיה פלואורסצנטית, חיץ זה משלים עם מערכת נטרול חמצן כדי להגן מפני photowhiteaching ועם מדכא מהבהב. במיקרוסקופיית TIRF ניתן לראות צבירים קטנים של חלבונים בתוך שדה TIRF הרדוד (~100 ננומטר; איור 4A,B). במיקרוסקופ קונפוקלי ניתן לראות צבירים גדולים של מבנים נימה מרחפים גבוה יותר בתמיסה (איור 4C). לבסוף, באמצעות TEM, ניתן לראות צרורות קטנים של ספטין (איור 4D), המתאימים לאשכולות שנצפו על-ידי TIRF, וצרורות גדולים (איור 4E), המתאימים למבנים שנצפו על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. הסטים של איור 4D,E מגלים ששני סוגי המבנים מורכבים מחוטים ארוכים ודקים הפועלים במקביל ויוצרים צרורות עם קצוות מחודדים. יחד, תמונות הפלואורסצנציה וה- TEM מוכיחות כי קומפלקסי הספטין המטוהרים יכולים להתפלמר לחוטים, אשר בתורם מרכיבים את עצמם לצרורות.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig04.jpg"> איור 4: דוגמאות לתוצאות של בקרת איכות יכולת הפימור. (A) תמונת TIRF של הקסמרים ספטין אנושיים בגודל 300 ננומטר (10% הקסמרים עם תווית msfGFP) ב-fluoSPB. (B) תמונת TIRF של אוקטמרים של ספטין אנושי בגודל 300 ננומטר המכילים SEPT9_i1 (10% octamers9_i1 עם תווית msfGFP) ב-fluoSPB. (C) הקרנות קונפוקליות בעוצמה מקסימלית של ערימות Z על פני ~30 מיקרומטר עם ריווח של 0.5 מיקרומטר של 300 ננומטר ספטין אנושי octamers_9i3 ב- fluoSPB. (א-ג) סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר וגווני אפור הפוכים. (ד,ה) תמונות TEM לדוגמה של (D) צרורות קטנים ו- (E) גדולים של ספטין אנושי octamers_9i1 ב- darkSPB. כניסות מציגות אזורים שבהם ניתן לראות חוטים שקופים הפועלים במקביל בתוך החבילה. סרגלי קנה מידה = 500 ננומטר. לוחות (C-E) הם זכויות יוצרים של חברת הביולוגים והותאמו מ- Iv et al.10 באישור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
טבלה 1: רשימת פלסמידים. פלסמידים לטיהור אוליגומרים ספטין בעקבות פרוטוקול זה. כל הפלסמידים הופקדו באדג'ין (עמודה ראשונה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%201_V2.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 2: רשימת מאגרים. הרכבי חיץ המשמשים לטיהור ובקרת איכות של אוליגומרים ספטין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%202(1).xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 3: משקלים מולקולריים ומקדמי הכחדה. רשימת משקלים מולקולריים (MW) ומקדמי הכחדה אופטיים (ε) באורך גל של 280 ננומטר המחושבת באמצעות ProtParam בהתבסס על רצפי המרכבך, בהנחה של היתוך ליניארי של תת-יחידות ספטין, מתחמי ספטין השונים ותת-יחידות ספטין ייחודיות (MW בלבד) שניתן לטהר באמצעות הפלסמידים המפורטים בטבלה 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%203.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution at JoVE.com

Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution

שחזור במבחנה של חלבונים ציטוסקטליים הוא כלי חיוני להבנת התכונות התפקודיות הבסיסיות של חלבונים אלה. המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול לטיהור והערכה של קומפלקסי ספטין רקומביננטיים, הממלאים תפקיד מרכזי בחלוקת תאים ונדידתם.

טיהור ובקרת איכות של מתחמי ספטין רקומביננטיים לשחזור ללא תאים

Septins are a family of conserved eukaryotic GTP-binding proteins that can form cytoskeletal filaments and higher-order structures from hetero-oligomeric ...

פרוטוקול זה מאפשר לטהר מתחמי ספטין באיכות גבוהה, וזה חיוני כדי ללמוד את התפקידים הרבים של ספטינים בתא. היתרון העיקרי של גישה זו הוא סינתזה של הליך פשוט כדי לטהר ספטין באיכות גבוהה באמצעות פלסמידים Addgene. ספטינים קשים למחקר בתאים בשל האינטראקציות הרבות שלהם.שחזור גופרית עוזר לנו לנטרל את המורכבות הזו על ידי לימוד שלהם במערכת פשוטה. אנו ממליצים לעשות טיהור ביום אחד כדי למנוע השפלה. מניסיוננו, זה יגדיל את אורך החיים ואת איכות החלבון.כדי להתחיל, לגדל את תרבית החיידקים המותמרת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שייקר עד שהצפיפות האופטית באורך גל של 600 ננומטר מגיעה לשניים עד שלושה עבור ספטינים ללא תווית, או 0.6 עד 0.8 עבור ספטינים עם תוויות msfGFP או mEGFP. לאחר הדגירה, השרו את ביטוי החלבון על ידי הוספת IPTG לריכוז סופי של 0.5 מילימולאר ודגירה של התאים המבטאים הטרו-אוליגומרים של ספטין ללא תווית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות, או את התאים המבטאים msfGFP המסומנים כהטרו-אוליגומרים בטמפרטורה של 17 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ואז גלולה את התאים ב 4, 000 פעמים G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.יש להשליך את הסופר-נטנט ולהמיס את הכדור ב-100 מיליליטר של חיץ ליזיס כדי ללכלך את התאים. לאחר מכן, השתמש ב-tip sonicator באמפליטודה של 30% כדי לונתק את התא. להבהיר את התא lysate על ידי צנטריפוגה ב 20, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולשמור את supernatant.לחלופין, קח דגימה עבור denaturing אלקטרופורזה כמתואר בכתב היד. עבור כרומטוגרפיית זיקה של ספטינים מתויגים שלו, שיווי משקל של עמודת כרומטוגרפיה ארוזה מראש של ניקל ספרוז עם ביצועים גבוהים עם כל המאגרים הנדרשים. טען את הסופרנטנט המובהר עד לעמודה והפעל את מערכת הכרומטוגרפיה.לאחר מכן, העלו את מתחמי הספטין עם מאגר אלוטיון של 50% HisTrap בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה. כדי להניב ריכוז אימידזול של 250 מילימולר, לאסוף שברים של 0.5 מיליליטר. כעת עקוב אחר הספיגה האופטית של ה-eluate ב-280 ננומטר באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבונים ובחר את השברים המכילים קומפלקסים של ספטין.עבור כרומטוגרפיית זיקה של חלבונים מתויגים Strep-II שיווי משקל סטורפטקטין ארוז מראש sepharose גבוהה כרומטוגרפיה עמודה עם מאגר septin. לטעון את ספטין המכיל שברים התאושש מעמודת ניקל בקצב של מיליליטר אחד לדקה ולהתחיל את מערכת הכרומטוגרפיה. לאחר מכן שטפו את החלבון הקשור ועימקו את קומפלקסי ספטין עם 100% StrepTrap elution buffer בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה.כדי להניב ריכוז של 2.5 מילימולר desthiobiotin, לאסוף שברים 0.5 מיליליטר. בחר את השברים המכילים קומפלקסי ספטין כפי שמצוין על ידי הספיגה האופטית של האלואט ב 280 ננומטר המנוטרים באינטרנט עם מערכת כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבונים. לאחר הסרת הדסטיוביוטין על ידי דיאליזה aliquot מתחמי החלבון לגודל האליקוט הרצוי, הקפאו את האליקוט ואחסנו אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.למיקרוסקופיה של פיזור אינטרפרומטרי, יש לשטוף את שקופיות הזכוכית מספר 1.5 על ידי ניקוין בחומר ניקוי על-קולי למשך חמש דקות כל אחת במים, איזופרופנול, ושוב במים שעברו דה-יוניזציה. יבשו שתי מגלשות זכוכית עם זרם עדין של גז חנקן. לאחר מכן הניחו טיפת שבעה מיקרוליטרים של תמיסת פולי-ל-ליזין של 0.01% על מרכז אחת השקופיות והניחו את מרכז השקופית השנייה על גבי טיפת Poly-L-ליזין, תוך הכוונת שתי השקופיות בצורה אורתוגונלית להפרדה קלה.לאחר דגירה למשך 30 שניות, שטפו את המגלשה על ידי טבילה בכוס המכילה מים שעברו דה-יוניזציה פעם אחת ומריחה ישירה של זרם מים פעמיים. ייבשו אותם בזרימת גז חנקן וניתן לאחסן את השקופיות הללו במשך כשישה שבועות בטמפרטורת החדר בתנאים יבשים. לפני הניסוי, חתכו חתיכה של שניים על שניים, שלושה על שניים, או שלושה על שלושה אטמים והדביקו אותם על החלק המטופל בפולי-L-ליזין של מגלשת זכוכית, תוך הימנעות ממגלשת הזכוכית והאטמים הבאים במגע עם כל משטח מלוכלך על ידי הנחת המגלשה על רקמת מגב קלה.כעת לחץ על האטמים עם קצה פיפטה כדי להדביק אותם עם הפלסטיק המגן שנמצא על האטמים. לאחר מכן, חממו את חיץ המחיצות לטמפרטורת החדר. הפשירו את החלבונים ביד ושמרו אותם על הקרח לאחר מכן.לאחר מכן הניחו את השקופית עם אטמים על מערכת פוטומטריית המסה המסחרית המכילה 19 מיקרוליטרים של חיץ ספטין ומקד את המיקרוסקופ באמצעות אפשרות המיקוד האוטומטי. מיקוד מחדש עם ההגדרות החדשות, באמצעות אפשרות המיקוד האוטומטי. כדי ליצור תיקיית פרוייקט, לחץ על קובץ ואחריו פרוייקט חדש, וכדי לטעון תיקיית פרוייקט לאחסון נתונים, לחץ על קובץ ולאחר מכן על טען פרוייקט.ואז פיפטה מיקרוליטר אחד של דגימה ל 19 מיקרוליטר של ירידת חיץ מחיצה. ערבבו, ותוך כדי ערבוב, הימנעו מלגעת בשום דבר כדי למנוע את תזוזת השקופית. לאחר מכן הקלט סרטון 6, 000 פריימים על ידי לחיצה על הקלט.נתח את הסרטונים באמצעות תוכנת היצרן כדי להשיג את התפלגות מסת החלבון. אם הפסגות של גדלים שונים של ספטין הטרו-אוליגומרים חופפים יותר מדי או יותר מדי אירועים מזוהים להקטין את ריכוז ספטין הסופי ולמדוד שוב. וכאשר לא נמדדות מספיק ספירות של מולקולות בודדות, הגדל את ריכוז המחיצות ומדוד שוב.לניתוח ספטין, הכינו את ה-5X darkSPB ותערובת ספטין המורכבת מ-100% ספטין כהה בריכוז גבוה פי שישה מהריכוז הסופי הרצוי במאגר ספטין ודיתיותרטיטול מילימולרי אחד. לאחר מכן פילמר את המחיצה על ידי ערבוב מים, תערובת 20%5X darkSPB ו-16.67%septin, בסדר הספציפי הזה, ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הוסיפו שלושה עד חמישה מיקרוליטרים של דגימה לרשת מיקרוסקופיית אלקטרונים זוהרת ודגירה למשך דקה אחת.כעת, שטפו את הרשת פעמיים על ידי הוספת טיפה של מאגר darkSPB וספגו את הנוזל עם נייר סינון. יש לשטוף פעם אחת במים ולדגור במשך 30 שניות עם 2% אורניל אצטט. לאחר מכן, כתם הכתם ואוויר לייבש את הדגימה במשך כמה דקות.לאחר מכן תמונה את צרורות septin ב 120 קילווולט והגדלה בין 5, 000X ו 60, 000X עם defocus של אחד עד שני מיקרומטר. הכרומטוגרמה של HisTrap ו-StrepTrap הראתה כי השבר המאוגד עבר מתחילת השיא עד שהספיגה התייצבה על כ-250 מיליליטר ו-50 מיליליטר בהתאמה. רצועות המחיצות הראו עוצמות דומות באלקטרופורזה של ג'ל דנטורציה, מה שמרמז על כך שהמחיצות שלמות.באלקטרופורזה מקומית נצפו הלהקה העיקרית המתאימה להטרו-אוליגומרים השלמים ולהקה מינורית המתאימה לטרימרים או לטטרמרים. המשקל המולקולרי לכאורה של קומפלקסים מתויגים msfGFP אינו ניתן להבחנה מזה של קומפלקסים לא מתויגים. פוטומטריה המונית זיהתה אוקטאמרים והקסמרים שלמים של ספטינים.שיא נוסף של 241 קילודלטון הצביע על נוכחותם של שני חלבוני בוטנים, DSep1 ו-mEGFP-DSep2. תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים של מתחמי ספטין הראו מוטות של הקסמרים ואוקטמרים. תגי msfGFP נראים כצפיפויות מטושטשות בשני הקצוות בספטין 2 msfGFP ספטין אנושי octamers_9i1.ניתן לצפות בצבירים קטנים של חלבונים בשדה TIRF הרדוד. המיקרוסקופיה הקונפוקלית חשפה אשכולות גדולים של מבנים נימה צפים. מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה הראתה צרורות ספטין קטנים וגדולים המתאימים לצבירים שנצפו על ידי מיקרוסקופיית השתקפות פנימית כוללת ומיקרוסקופיה קונפוקלית.אנו ממליצים לעבוד על קרח בכל עת במהלך הטיהורים ולהוסיף ריאגנטים טריים שאנו מציינים בפרוטוקול. אנו מתעניינים באינטראקציות של ספטינים בהקשר של ציטוקינזיס. שחזרנו את ספטין יחד עם ממברנות מודרניות אקטין ומיקרוטובולים כדי לחקור אותם באמצעות מיקרוסקופיה ומספר מבחנים ביופיזיקליים.אנו משתמשים במחיצות המטוהרות כדי לחקור כיצד ספטינים מתקשרים עם חוטי אקטין, מיקרוטובולים ושומנים. בנוסף, אנו משתמשים במחיצות המטוהרות כדי לבנות תאים סינתטיים שבהם המחיצות מקלות על חלוקת התאים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

ג &#39;ל אופקי אלקטרופורזה לאיתור משופרת של חלבונים-רנ&quot;א קומפלקסים

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

מבנה גבישי של N-מסוף תחום של Ryanodine הקולטן של Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

ביוסינתזה של פלאנונול מתוך Flavanone על ידי הקמת מדורגת ביאנזיטית בסיר אחד

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

כביסה-החוקה בסיוע מחדש של רקומביננטי דרוזולה אטלסטין ליפוזומים בשביל השומנים

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...