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June 23rd, 2022
DOI :
June 23rd, 2022
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Introduction
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Purification of Septin Hetero-Oligomers
4:29
Quality Control of Purity and Integrity of the Septin Hetero-Oligomer
7:34
Septin Functional Quality Control via Polymerization Analysis
8:57
Results: Analysis of Purified Septin Quality
11:01
Conclusion
Transcript
यह प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता वाले सेप्टिन परिसरों को शुद्ध करना संभव बनाता है, और यह सेल में सेप्टिन की कई भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है। इस दृष्टिकोण का मुख्य लाभ एडजीन प्लास्मिड का उपयोग करके उच्च गुणवत्ता वाले सेप्टिन को शुद्ध करने के लिए एक सरल प्रक्रिया का संश्लेषण है। सेप्टिन को उनकी कई बातचीत के कारण कोशिकाओं में अध्ययन करना मुश्किल है।
सल्फर पुनर्गठन हमें एक सरल प्रणाली में उनका अध्ययन करके इस जटिलता को अलग करने में मदद करता है। हम गिरावट को रोकने के लिए एक ही दिन में शुद्धिकरण करने की सलाह देते हैं। हमारे अनुभव में, यह जीवन काल और प्रोटीन की गुणवत्ता में वृद्धि करेगा।
शुरू करने के लिए, एक शेकर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रूपांतरित जीवाणु संस्कृति को विकसित करें जब तक कि 600 नैनोमीटर की तरंग दैर्ध्य पर ऑप्टिकल घनत्व बिना लेबल वाले सेप्टिन के लिए दो से तीन तक नहीं पहुंच जाता है, या एमएसएफजीएफपी या एमईजीएफपी लेबल सेप्टिन के लिए 0.6 से 0.8 तक पहुंच जाता है। इनक्यूबेशन के बाद, आईपीटीजी को 0.5 मिलीमोलर की अंतिम सांद्रता में जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें और तीन घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बिना लेबल वाले सेप्टिन हेटेरो-ऑलिगोमर्स व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, या रात भर 17 डिग्री सेल्सियस पर एमएसएफजीएफपी लेबल वाले हेटेरो-ऑलिगोमर्स को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। फिर कोशिकाओं को चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 4,000 गुना जी पर पेलेट करें।
सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 100 मिलीलीटर लाइसिस बफर में गोली को भंग करें। इसके बाद, सेल को सोनिकेट करने के लिए 30% आयाम पर एक टिप सोनिकेटर का उपयोग करें। सेल लाइसेट को चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 गुना जी पर सेंट्रीफ्यूज करके स्पष्ट करें और सुपरनैटेंट को बचाएं।
वैकल्पिक रूप से, पांडुलिपि में वर्णित वैद्युतकणसंचलन को विकृत करने के लिए एक नमूना लें। हिज़-टैग किए गए सेप्टिन की आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के लिए, सभी आवश्यक बफर के साथ एक पूर्व-पैक निकेल सेफ्रोज उच्च प्रदर्शन क्रोमैटोग्राफी कॉलम को बराबर करें। स्पष्ट सुपरनैटेंट को कॉलम में लोड करें और क्रोमैटोग्राफी सिस्टम शुरू करें।
फिर सेप्टिन कॉम्प्लेक्स को 50% हिस्ट्रैप एल्यूशन बफर के साथ एक मिलीलीटर प्रति मिनट की प्रवाह दर पर घुमाएं। 250 मिलीमोलर की इमिडाज़ोल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, 0.5 मिलीलीटर अंश एकत्र करें। अब एक तेज प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली के साथ 280 नैनोमीटर पर एलुएट के ऑप्टिकल अवशोषण की निगरानी करें और सेप्टिन कॉम्प्लेक्स युक्त अंशों को चुनें।
स्ट्रेप-II टैग किए गए प्रोटीन की आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के लिए सेप्टिन बफर के साथ एक पूर्व-पैक स्ट्रेप्टाक्टिन सेफ्रोज उच्च प्रदर्शन क्रोमैटोग्राफी कॉलम को बराबर करें। निकेल कॉलम से बरामद अंशों वाले सेप्टिन को एक मिलीलीटर प्रति मिनट की दर से लोड करें और क्रोमैटोग्राफी सिस्टम शुरू करें। फिर बंधे हुए प्रोटीन को धो लें और सेप्टिन कॉम्प्लेक्स को 100% स्ट्रेपट्रैप एलाशन बफर के साथ एक मिलीलीटर प्रति मिनट की प्रवाह दर पर रखें।
2.5 मिलीमोलर डेस्थियोबायोटिन की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, 0.5 मिलीलीटर अंश एकत्र करें। एक तेज प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली के साथ ऑनलाइन निगरानी किए गए 280 नैनोमीटर पर एलुएट के ऑप्टिकल अवशोषण द्वारा इंगित सेप्टिन कॉम्प्लेक्स वाले अंशों को चुनें। डायलिसिस द्वारा डेस्थियोबायोटिन को हटाने के बाद प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को वांछित एलिकोट आकार में बदलें, एलिकोट को फ्रीज करें, और इसे माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
इंटरफेरोमेट्रिक स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी के लिए, ग्लास स्लाइड नंबर 1.5 को एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर में पांच मिनट के लिए पानी, आइसोप्रोपेनॉल और फिर से विआयनीकृत पानी में डुबोकर धोएं। नाइट्रोजन गैस की एक कोमल धारा के साथ दो ग्लास स्लाइड सुखाएं। फिर स्लाइडों में से एक के केंद्र पर 0.01% पॉली-एल-लाइसिन समाधान की सात माइक्रोलीटर बूंद रखें और दूसरी स्लाइड के केंद्र को पॉली-एल-लाइसिन ड्रॉप के शीर्ष पर रखें, दो स्लाइडों को आसान पृथक्करण के लिए ऑर्थोगोनल रूप से उन्मुख करें।
30 सेकंड के लिए इनक्यूबेट करने के बाद, स्लाइड को एक बार विआयनीकृत पानी युक्त बीकर में डुबोकर और सीधे दो बार पानी की धारा लगाकर धो लें। उन्हें नाइट्रोजन गैस प्रवाह के साथ सुखाएं और इन स्लाइडों को शुष्क परिस्थितियों में कमरे के तापमान पर लगभग छह सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है। प्रयोग से पहले, दो के एक टुकड़े को दो से दो, तीन से दो, या तीन को तीन गैसकेट से काटें और उन्हें ग्लास स्लाइड के पॉली-एल-लाइसिन उपचारित हिस्से पर चिपकाएं, ग्लास स्लाइड से बचें और गैसकेट किसी भी गंदे सतह से संपर्क करते हुए लाइट ड्यूटी वाइपर ऊतक पर स्लाइड रखें।
अब गैसकेट्स पर मौजूद प्रोटेक्टिंग प्लास्टिक से चिपकाने के लिए पिपेट टिप से गैसकेट्स को दबाएं। इसके बाद, सेप्टिन बफर को कमरे के तापमान पर गर्म करें। प्रोटीन को हाथ में पिघलाएं और बाद में उन्हें बर्फ पर रखें।
फिर सेप्टिन बफर के 19 माइक्रोलीटर युक्त वाणिज्यिक द्रव्यमान फोटोमेट्री सिस्टम पर गैसकेट्स के साथ स्लाइड रखें और ऑटोफोकस विकल्प का उपयोग करके माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें। ऑटोफोकस विकल्प का उपयोग करके, नई सेटिंग्स के साथ रीफोकस करें। कोई प्रोजेक्ट फ़ोल्डर बनाने के लिए, नया प्रोजेक्ट के बाद फ़ाइल क्लिक करें, और डेटा संग्रहीत करने के लिए प्रोजेक्ट फ़ोल्डर लोड करने के लिए, लोड प्रोजेक्ट के बाद फ़ाइल क्लिक करें.
फिर नमूने के एक माइक्रोलीटर को सेप्टम बफर ड्रॉप के 19 माइक्रोलीटर में बदल दें। मिश्रण करें, और मिश्रण करते समय, स्लाइड की गति को रोकने के लिए कुछ भी छूने से बचें। फिर रिकॉर्ड पर क्लिक करके 6,000 फ्रेम वीडियो रिकॉर्ड करें।
प्रोटीन द्रव्यमान वितरण प्राप्त करने के लिए निर्माता के सॉफ्टवेयर का उपयोग करके वीडियो का विश्लेषण करें। यदि विभिन्न सेप्टिन हेटेरो-ऑलिगोमर आकारों की चोटियां बहुत अधिक ओवरलैप होती हैं या बहुत अधिक घटनाओं का पता लगाया जाता है, तो अंतिम सेप्टिन एकाग्रता कम हो जाती है और फिर से मापती है। और जब एकल अणुओं की पर्याप्त गिनती को मापा नहीं जाता है, तो सेप्टिन एकाग्रता बढ़ाएं और फिर से मापें।
सेप्टिन विश्लेषण के लिए, 5एक्स डार्कएसपीबी और एक सेप्टिन मिश्रण तैयार करें जिसमें सेप्टिन बफर और एक मिलीमोलर डिथियोथ्रेइटोल में वांछित अंतिम एकाग्रता से छह गुना अधिक सांद्रता पर 100% डार्क सेप्टिन शामिल है। फिर इस विशिष्ट क्रम में पानी, 20% 5एक्स डार्कएसपीबी और 16.67% सेप्टिन मिश्रण को मिलाकर सेप्टिन को पॉलीमराइज़ करें, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। एक चमक डिस्चार्ज इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड में नमूने के तीन से पांच माइक्रोलीटर जोड़ें और एक मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
अब, डार्कएसपीबी बफर की एक बूंद जोड़कर ग्रिड को दो बार धोएं और फिल्टर पेपर के साथ तरल को अवशोषित करें। एक बार पानी से धो लें और 2% यूरिनिल एसीटेट के साथ 30 सेकंड के लिए इनक्यूबेट करें। इसके बाद, दाग को धब्बा दें और नमूने को कुछ मिनटों के लिए हवा से सुखाएं।
फिर सेप्टिन बंडलों को 120 किलोवोल्ट पर चित्रित करें और एक से दो माइक्रोमीटर के डीफोकस के साथ 5, 000 एक्स और 60, 000 एक्स के बीच आवर्धन करें। हिस्ट्रैप और स्ट्रेपट्रैप क्रोमैटोग्राम से पता चला है कि पूल किया गया अंश क्षालन शिखर की शुरुआत से तब तक चला गया जब तक अवशोषण क्रमशः लगभग 250 मिलीलीटर और 50 मिलीलीटर पर स्थिर नहीं हो गया। सेप्टिन बैंड ने जेल वैद्युतकणसंचलन को विकृत करने में समान तीव्रता दिखाई, जिससे पता चलता है कि सेप्टिन बरकरार हैं।
देशी वैद्युतकणसंचलन में, बरकरार हेटेरो-ऑलिगोमर्स के अनुरूप प्रमुख बैंड और ट्रिमर्स या टेट्रामर्स के अनुरूप एक मामूली बैंड देखा गया था। एमएसएफजीएफपी टैग किए गए परिसरों का स्पष्ट आणविक भार अनटैग किए गए परिसरों से अप्रभेद्य है। मास फोटोमेट्री ने सेप्टिन के बरकरार ऑक्टेमर्स और हेक्सामर्स का पता लगाया।
241 किलोडाल्टन पर एक अतिरिक्त शिखर ने दो मूंगफली प्रोटीन, डीएसईपी 1 और एमईजीएफपी-डीएसईपी 2 की उपस्थिति का संकेत दिया। सेप्टिन कॉम्प्लेक्स की ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों ने हेक्सामर्स और ऑक्टामर्स की छड़ें दिखाईं। एमएसएफजीएफपी टैग सेप्टिन 2 एमएसएफजीएफपी मानव सेप्टिन octamers_9i1 में दो सिरों पर फजी घनत्व के रूप में दिखाई देते हैं।
उथले टीआईआरएफ क्षेत्र में प्रोटीन के छोटे समूह देखे जा सकते हैं। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी ने फ्लोटिंग फिलामेंटस संरचनाओं के बड़े समूहों का खुलासा किया। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे गए समूहों के अनुरूप छोटे और बड़े सेप्टिन बंडल दिखाए।
हम शुद्धिकरण के दौरान हर समय बर्फ पर काम करने और प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट ताजा अभिकर्मकों को जोड़ने की सलाह देते हैं। हम साइटोकिनेसिस के संदर्भ में सेप्टिन की बातचीत में रुचि रखते हैं। हमने माइक्रोस्कोपी और कई बायोफिजिकल परखों के साथ उनका अध्ययन करने के लिए आधुनिक झिल्ली एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं के साथ सेप्टिन का पुनर्गठन किया।
हम शुद्ध सेप्टिन का उपयोग यह अध्ययन करने के लिए करते हैं कि सेप्टिन एक्टिन फिलामेंट्स, सूक्ष्मनलिकाएं और लिपिड के साथ कैसे बातचीत करते हैं। और हम सिंथेटिक कोशिकाओं के निर्माण के लिए शुद्ध सेप्टिन का भी उपयोग करते हैं जहां सेप्टिन कोशिका विभाजन की सुविधा प्रदान करते हैं।
साइटोस्केलेटल प्रोटीन का इन विट्रो पुनर्गठन इन प्रोटीनों के बुनियादी कार्यात्मक गुणों को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। वर्तमान पेपर पुनः संयोजक सेप्टिन परिसरों की गुणवत्ता को शुद्ध करने और मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो कोशिका विभाजन और प्रवासन में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं।
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