このプロトコルは、高品質のセプチン複合体を精製することを可能にし、これは細胞内のセプチンの多くの役割を研究するために不可欠です。このアプローチの主な利点は、Addgeneプラスミドを使用して高品質のセプチンを精製するための簡単な手順の合成です。セプチンは、それらの多くの相互作用のために細胞内で研究することは困難です。
硫黄の再構成は、単純なシステムでそれらを研究することによって、この複雑さを解きほぐすのに役立ちます。劣化防止のため、1日で精製を推奨します。私たちの経験では、これはタンパク質の寿命と品質を向上させます。
まず、600ナノメートルの波長の光学密度が非標識セプチンの場合は2〜3、msfGFPまたはmEGFP標識セプチンの場合は0.6〜0.8に達するまで、シェーカーインキュベーター内で摂氏37度で形質転換細菌培養物を増殖させます。インキュベート後、IPTGを最終濃度0.5ミリモルまで添加してタンパク質発現を誘導し、非標識セプチンヘテロオリゴマーを発現する細胞を摂氏37度で3時間インキュベートするか、msfGFP標識ヘテロオリゴマーを発現する細胞を摂氏17度で一晩インキュベートします。次に、摂氏4度で20分間、4, 000倍Gで細胞をペレット化します。
上清を廃棄し、ペレットを100ミリリットルの溶解バッファーに溶解して細胞を溶解します。次に、細胞を超音波処理するために30%振幅で先端超音波処理器を使用します。摂氏 4 度で 30 分間 20 、 000 倍 G で遠心分離して細胞溶解液を清澄化し、上清を保存します。
任意選択で、原稿に記載されているように電気泳動を変性するためのサンプルを採取する。Hisタグ付きセプチンのアフィニティークロマトグラフィーでは、充填済みのニッケルセファロース高速クロマトグラフィーカラムを必要なすべてのバッファーで平衡化します。清澄化した上清をカラムにロードし、クロマトグラフィーシステムを起動します。
次に、セプチン複合体を50%HisTrap溶出バッファーで毎分1ミリリットルの流速で溶出します。250ミリモルのイミダゾール濃度を得るために、0.5ミリリットルの画分を集める。次に、高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムで280ナノメートルの溶出液の光学吸光度を監視し、セプチン複合体を含む画分を選択します。
Strep-IIタグ付きタンパク質のアフィニティークロマトグラフィーのために、予め充填されたStrepTactinセファロース高速クロマトグラフィーカラムをセプチン緩衝液で平衡化します。ニッケルカラムから回収したセプチン含有画分を毎分1ミリリットルの速度でロードし、クロマトグラフィーシステムを起動します。次に、結合したタンパク質を洗浄し、セプチン複合体を100%StrepTrap溶出バッファーで毎分1ミリリットルの流速で溶出します。
2.5ミリモルのデスチオビオチンの濃度を得るために、0.5ミリリットルの画分を集める。高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムでオンラインで監視された280ナノメートルでの溶出液の光吸光度で示されるように、セプチン複合体を含む画分を選択します。透析によってデスチオビオチンを除去した後、タンパク質複合体を所望のアリコートサイズに分注し、アリコートをスナップ凍結し、摂氏マイナス80度で保存します。
干渉散乱顕微鏡の場合、ガラススライド番号1.5を超音波洗浄機で水、イソプロパノール、および再び脱イオン水中でそれぞれ5分間超音波処理することにより洗浄します。2枚のスライドガラスを穏やかな窒素ガスの流れで乾かします。次に、スライドの1つの中央に0.01%ポリ-L-リジン溶液の7マイクロリットル滴を置き、もう一方のスライドの中心をポリ-L-リジンドロップの上に置き、2つのスライドを簡単に分離できるように直交させます。
30秒間インキュベートした後、脱イオン水を含むビーカーに1回浸し、水流を2回直接適用してスライドを洗浄します。窒素ガスフローで乾燥させると、これらのスライドは乾燥状態で室温で約6週間保存できます。実験の前に、2 x 2、3 x 2、または 3 x 3 ガスケットをカットし、スライドガラスのPoly-L-リジン処理部分に貼り付け、スライドガラスとガスケットが汚れた表面に接触しないようにします。
次に、ガスケットをピペットチップで押して、ガスケットにある保護プラスチックで貼り付けます。次に、セプチン緩衝液を室温まで温める。手持ちのタンパク質を解凍し、その後氷の上に置いておきます。
次に、ガスケット付きのスライドを19マイクロリットルのセプチンバッファーを含む市販の質量測光システムに置き、オートフォーカスオプションを使用して顕微鏡の焦点を合わせます。オートフォーカスオプションを使用して、新しい設定で再フォーカスします。プロジェクト フォルダーを作成するには、[ファイル]、[新しいプロジェクト] の順にクリックし、データを格納するプロジェクト フォルダーを読み込むには、[ファイル]、[プロジェクトのロード] の順にクリックします。
次に、1マイクロリットルのサンプルを19マイクロリットルのセプタムバッファードロップにピペットで入れます。混合し、混合中は、スライドの動きを防ぐために何かに触れないでください。次に、[録画]をクリックして6, 000フレームのビデオを録画します。
メーカーのソフトウェアを使用してビデオを分析して、タンパク質の質量分布を取得します。異なるセプチンヘテロオリゴマーサイズのピークが重なりすぎるか、または検出されるイベントが多すぎる場合は、最終セプチン濃度を下げて再度測定します。そして、単一分子の十分な数が測定されない場合は、セプチン濃度を上げて再度測定します。
セプチン分析のために、5倍のdarkSPBと、セプチンバッファーと1ミリモルのジチオスレイトール中の所望の最終濃度の6倍の濃度の100%ダークセプチンからなるセプチンミックスを調製します。次に、水、20%5X darkSPBおよび16.67%セプチン混合物をこの特定の順序で混合してセプチンを重合し、室温で30分間インキュベートします。3〜5マイクロリットルのサンプルをグロー放電電子顕微鏡グリッドに加え、1分間インキュベートします。
次に、darkSPBバッファーを1滴加えてグリッドを2回洗浄し、ろ紙で液体を吸収します。水で一度洗浄し、2%酢酸ウラニルで30秒間インキュベートします。次に、汚れを吸い取り、サンプルを数分間風乾します。
次に、セプチンバンドルを120キロボルトで、倍率5, 000Xから60, 000Xの倍率で、1〜2マイクロメートルの焦点を合わせます。HisTrapおよびStrepTrapクロマトグラムは、プールされた画分が溶出ピークの開始から吸光度がそれぞれ約250ミリリットルおよび50ミリリットルで安定するまで経過したことを示しました。セプチンバンドは、変性ゲル電気泳動において同様の強度を示し、セプチンが無傷であることを示唆している。
ネイティブ電気泳動では、インタクトなヘテロオリゴマーに対応するメジャーバンドと、トリマーまたはテトラマーに対応するマイナーバンドが観察されました。msfGFPタグ付き複合体の見かけの分子量は、タグなし錯体のそれと区別がつかない。質量測光法は、セプチンの無傷の八量体および六量体を検出した。
241キロダルトンでの追加のピークは、2つのピーナッツタンパク質、DSep1とmEGFP-DSep2の存在を示しました。セプチン錯体の透過型電子顕微鏡画像は、六量体および八量体の棒を示した。msfGFPタグは、セプチン2 msfGFPヒトセプチンoctamers_9i1の両端のファジー密度として見える。
タンパク質の小さなクラスターは、浅いTIRFフィールドで観察することができます。共焦点顕微鏡は、浮遊糸状構造の大きなクラスターを明らかにしました。透過型電子顕微鏡は、全反射蛍光顕微鏡および共焦点顕微鏡によって観察されたクラスターに対応する大小のセプチン束を示した。
精製中は常に氷上で作業し、プロトコルで指定した新鮮な試薬を追加することをお勧めします。私たちは、細胞質分裂の文脈におけるセプチンの相互作用に興味を持っています。セプチンを最新の膜アクチンおよび微小管とともに再構成し、顕微鏡検査およびいくつかの生物物理学的アッセイでそれらを研究しました。
精製されたセプチンを使用して、セプチンがアクチンフィラメント、微小管、脂質とどのように相互作用するかを研究します。また、精製されたセプチンを使用して、セプチンが細胞分裂を促進する合成細胞を構築します。
