이 프로토콜은 고품질 셉틴 복합체를 정제하는 것을 가능하게 하며, 이는 세포에서 셉틴의 많은 역할을 연구하는 데 필수적입니다. 이 접근법의 가장 큰 장점은 Addgene 플라스미드를 사용하여 고품질 셉틴을 정제하는 간단한 절차를 합성하는 것입니다. Septins는 많은 상호 작용으로 인해 세포에서 연구하기가 어렵습니다.
유황 재구성은 간단한 시스템에서 연구하여 이러한 복잡성을 푸는 데 도움이됩니다. 분해를 방지하기 위해 하루에 정제하는 것이 좋습니다. 우리의 경험에 따르면, 이것은 단백질의 수명과 품질을 증가시킬 것입니다.
시작하려면 셰이커 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 600나노미터 파장의 광학 밀도가 표지되지 않은 셉틴의 경우 2-3, msfGFP 또는 mEGFP 표지된 셉틴의 경우 0.6-0.8에 도달할 때까지 형질전환된 박테리아 배양을 성장시킵니다. 배양 후, IPTG를 최종 농도 0.5 밀리몰로 첨가하여 단백질 발현을 유도하고, 표지되지 않은 셉틴 헤테로올리고머를 발현하는 세포를 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양하거나, msfGFP 표지된 헤테로올리고머를 발현하는 세포를 섭씨 17도에서 밤새 배양한다. 그런 다음 섭씨 4도에서 20 분 동안 4, 000 배 G에서 세포를 펠릿합니다.
상청액을 버리고 펠릿을 100 밀리리터의 용해 완충액에 용해시켜 세포를 용해시킵니다. 다음으로, 30% 진폭의 팁 초음파 처리기를 사용하여 셀을 초음파 처리합니다. 섭씨 4도에서 30 분 동안 20, 000 배 G에서 원심 분리하여 세포 용해물을 명확히하고 상층액을 저장하십시오.
선택적으로, 원고에 기술된대로 변성 전기 영동을위한 샘플을 채취하십시오. His-tagged septin의 친화성 크로마토그래피의 경우, 사전 충전된 니켈 세파로스 고성능 크로마토그래피 컬럼을 필요한 모든 완충액과 평형화합니다. 정화된 상청액을 컬럼에 로딩하고 크로마토그래피 시스템을 시작합니다.
그런 다음 분당 1 밀리리터의 유속으로 50 % HisTrap 용리 완충액으로 셉틴 복합체를 용리시킵니다. 250 밀리몰의 이미 다졸 농도를 산출하려면 0.5 밀리리터 분획을 수집하십시오. 이제 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 시스템으로 280나노미터에서 용리액의 광학 흡광도를 모니터링하고 셉틴 복합체가 포함된 분획을 선택합니다.
Strep-II 태그된 단백질의 친화성 크로마토그래피를 위해 사전 충전된 스트렙탁틴 세파로스 고성능 크로마토그래피 컬럼을 셉틴 완충액으로 평형화합니다. 니켈 컬럼에서 회수된 셉틴 함유 분획을 분당 1밀리리터의 속도로 로드하고 크로마토그래피 시스템을 시작합니다. 그런 다음 결합 된 단백질을 세척하고 분당 1 밀리리터의 유속으로 100 % StrepTrap 용리 완충액으로 셉틴 복합체를 용리시킵니다.
2.5 밀리몰 데스티오비오틴의 농도를 산출하려면 0.5 밀리리터 분획을 수집하십시오. 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 시스템으로 온라인으로 모니터링된 280나노미터에서 용리액의 광학 흡광도로 표시된 셉틴 복합체를 포함하는 분획을 선택합니다. 투석에 의해 데스티오비오틴을 제거한 후 단백질 복합체를 원하는 분취량 크기로 분취하고, 분취량을 스냅 동결하고, 섭씨 영하 80도에서 보관한다.
간섭계 산란 현미경의 경우, 유리 슬라이드 번호 1.5를 물, 이소프로판올, 그리고 다시 탈 이온수에서 각각 5 분 동안 초음파 세척기에서 초음파 처리하여 세척하십시오. 부드러운 질소 가스 흐름으로 두 개의 유리 슬라이드를 건조시킵니다. 그런 다음 슬라이드 중 하나의 중앙에 0.01 % Poly-L- 라이신 용액의 7 마이크로 리터 방울을 놓고 다른 슬라이드의 중심을 Poly-L-Lysine 방울 위에 놓고 두 슬라이드를 쉽게 분리 할 수 있도록 직각으로 향하게합니다.
30초 동안 인큐베이션한 후, 탈이온수를 함유하는 비커에 한번 침지하고 직접 물 스트림을 2회 적용하여 슬라이드를 세척한다. 질소 가스 흐름으로 건조하면 이 슬라이드는 건조한 상태의 실온에서 약 6주 동안 보관할 수 있습니다. 실험 전에 2x2, 3x2 또는 3x3 개스킷 조각을 잘라 유리 슬라이드의 Poly-L-Lysine 처리 부분에 붙이고 슬라이드를 경량 와이퍼 티슈에 올려 슬라이드를 놓아 유리 슬라이드와 개스킷이 더러운 표면에 닿지 않도록 합니다.
이제 피펫 팁으로 개스킷을 눌러 개스킷에있는 보호 플라스틱에 붙입니다. 다음으로 셉틴 버퍼를 실온으로 데우십시오. 손에 든 단백질을 해동하고 나중에 얼음 위에 보관하십시오.
그런 다음 19 마이크로 리터의 셉틴 버퍼가 포함 된 상업용 질량 측광 시스템에 개스킷이있는 슬라이드를 놓고 자동 초점 옵션을 사용하여 현미경의 초점을 맞 춥니 다. 자동 초점 옵션을 사용하여 새 설정으로 다시 초점을 맞춥니다. 프로젝트 폴더를 만들려면 파일, 새 프로젝트 순을 차례로 클릭하고 데이터를 저장할 프로젝트 폴더를 로드하려면 파일, 프로젝트 로드를 차례로 클릭합니다.
그런 다음 1 마이크로리터의 샘플을 19 마이크로리터의 격막 완충액 방울로 피펫팅합니다. 혼합하고 혼합하는 동안 슬라이드의 움직임을 방지하기 위해 아무것도 만지지 마십시오. 그런 다음 녹화를 클릭하여 6, 000 프레임 비디오를 녹화하십시오.
제조업체의 소프트웨어를 사용하여 비디오를 분석하여 단백질 질량 분포를 얻습니다. 상이한 셉틴 헤테로올리고머 크기의 피크가 너무 많이 겹치거나 너무 많은 이벤트가 검출되면 최종 셉틴 농도를 감소시키고 다시 측정한다. 그리고 단일 분자의 충분한 수가 측정되지 않으면 셉틴 농도를 높이고 다시 측정하십시오.
셉틴 분석을 위해 셉틴 완충액과 1 밀리몰 디티 오 트레이톨에서 원하는 최종 농도보다 6 배 높은 농도로 5X darkSPB와 100 % 다크 셉틴으로 구성된 셉틴 혼합물을 준비하십시오. 그런 다음 물, 20%5X darkSPB 및 16.67% 셉틴 혼합물을 이 특정 순서로 혼합하여 셉틴을 중합하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 3-5 마이크로 리터의 샘플을 글로우 방전 전자 현미경 그리드에 추가하고 1 분 동안 배양하십시오.
이제 darkSPB 버퍼 한 방울을 추가하여 그리드를 두 번 씻고 여과지로 액체를 흡수합니다. 물로 한 번 씻고 2 % 우라 닐 아세테이트로 30 초 동안 배양하십시오. 다음으로, 얼룩을 닦아내고 샘플을 몇 분 동안 자연 건조시킨다.
그런 다음 셉틴 번들을 120 킬로 볼트로 이미지화하고 5, 000X와 60, 000X 사이의 배율을 1-2 마이크로 미터의 디 포커스로 이미지화합니다. HisTrap 및 StrepTrap 크로마토 그램은 풀링 된 분획이 용리 피크의 시작부터 흡광도가 각각 약 250 밀리리터 및 50 밀리리터에서 안정화 될 때까지 진행되었음을 보여주었습니다. 셉틴 밴드는 변성 겔 전기 영동에서 유사한 강도를 보여 셉틴이 손상되지 않았 음을 시사합니다.
천연 전기영동에서, 무손상 헤테로올리고머에 상응하는 메이저 밴드 및 트리머 또는 사량체에 대응하는 마이너 밴드가 관찰되었다. msfGFP 태그된 복합체의 겉보기 분자량은 태그되지 않은 복합체의 겉보기 분자량과 구별할 수 없다. 질량 측광법은 셉틴의 온전한 옥타머와 헥사머를 검출했습니다.
241 킬로달톤에서의 추가 피크는 두 개의 땅콩 단백질 인 DSep1 및 mEGFP-DSep2의 존재를 나타냅니다. 셉틴 복합체의 투과 전자 현미경 이미지는 헥사머와 옥타머의 막대를 보여주었습니다. msfGFP 태그는 셉틴 2 msfGFP 인간 셉틴 octamers_9i1의 양쪽 말단에 퍼지 밀도로 표시됩니다.
단백질의 작은 클러스터는 얕은 TIRF 필드에서 관찰 될 수있다. 컨포칼 현미경 검사는 부유 필라멘트 구조의 큰 클러스터를 보여주었습니다. 투과 전자 현미경은 전체 내부 반사 형광 현미경 및 공초점 현미경으로 관찰 된 클러스터에 해당하는 작고 큰 셉틴 다발을 보여주었습니다.
정제 중에 항상 얼음 위에서 작업하고 프로토콜에 지정된 신선한 시약을 추가하는 것이 좋습니다. 우리는 세포질 분열의 맥락에서 셉틴의 상호 작용에 관심이 있습니다. 우리는 현대의 막 액틴 및 미세 소관과 함께 셉틴을 재구성하여 현미경 검사와 여러 생물 물리학 적 분석으로 연구했습니다.
우리는 정제된 셉틴을 사용하여 셉틴이 액틴 필라멘트, 미세소관 및 지질과 어떻게 상호 작용하는지 연구합니다. 그리고 우리는 또한 정제된 셉틴을 사용하여 셉틴이 세포 분열을 촉진하는 합성 세포를 만듭니다.
