Name: purification and quality control of recombinant septin complexes for cell-free reconstitution
Uploaded: 2022-06-23T13:00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution at JoVE.com

Vi takker Cecilia de Agrela Pinto, Tomás de Garay og Katharina Häußermann for deres hjelp med massefotometrieksperimenter (iSCAT); Arjen Jakobi og Wiel Evers for deres hjelp med TEM; Lucia Baldauf for hennes hjelp med TIRF; Pascal Verdier-Pinard for hans råd om innfødt elektroforese; Agata Szuba og Marjolein Vinkenoog for deres hjelp til å sette opp Drosophila septin rensing innsats, og Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, medlem av den franske nasjonale forskningsinfrastrukturen France-BioImaging (ANR10-INBS-04). Denne forskningen mottok finansiering fra Den nederlandske organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO / OCW) gjennom 'BaSyC-Building a Synthetic Cell' Gravitasjonsstipend (024.003.019) og fra Agence Nationale pour la Recherche (ANR-tilskudd ANR-17-CE13-0014: "SEPTIMORF"; ANR-13-JSV8-0002-01: "SEPTIME"; og ANR-20-CE11-0014-01: "SEPTSCORT").

1. Rensing av septin hetero-oligomerer
<ol><li>Samtransformasjon av bakterieceller med ekspresjonsvektorene<ol><li>Velg en kombinasjon av ett pnEA og ett pnCS-plasmid44 som skal brukes til uttrykk. Velg kombinasjonen avhengig av ønsket underenhetssammensetning av septin hetero-oligomer10,35 og om fluorescerende merking er nødvendig eller ikke. MERK: C-terminalt merket monomer superfolder GFP (msfGFP)-merket SEPT2 (for humane septiner) eller msfGFP- eller monomere forbedret GFP (mEGFP)-DSep2 (for Drosophila septiner) brukes her (tabell 1).</li>
		<li>Pipette 1 μL av hvert plasmid (~1 ng/μL) til 100 μL kompetente BL21 Escherichia coli-celler og inkuber på is i 20 minutter.</li>
		<li>Plasser cellene i et vannbad ved 42 ° C i 40 s og inkuber dem umiddelbart i 3 minutter på is.</li>
		<li>Tilsett 0,9 ml lysogeni buljong (LB) medium til cellesuspensjonen og la cellene vokse i 1 time ved 37 °C. Plate 100 μL celler på varme LB-agarplater inneholdende 100 μg/ml ampicillin og 100 μg/ml spectinomycin og inkuber over natten ved 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Dyrk bakteriell prekultur<ol><li>Fyll en 250 ml Erlenmeyer-kolbe med 100 ml Terrific buljong (TB) eller LB-medium som inneholder 100 μg / ml ampicillin og 100 μg / ml spectinomycin.</li>
		<li>Plukk ut en enkelt koloni fra LB-agarplaten med en steril inokulasjonssløyfe og overfør den til ferske medier fra trinn 1.2.1.</li>
		<li>Inkuber ved 37 °C i en roterende shakerkuvøse, enten over natten eller i minst 6 timer. MERK: Fra denne kulturen kan en glyserolbestand fremstilles ved å blande bakteriesuspensjonen 1: 1 med glyserol og lagres ved -80 ° C. Denne beholdningen kan brukes i trinn 1.2.2. i stedet for en nyforvandlet koloni.</li>
	</ol></li>
	<li>Induksjon av bakteriekultur og proteinuttrykk<ol><li>Overfør 100 ml dyrkede bakterier til 5 liter TB eller LB inneholdende 50 μg/ml ampicillin og 50 μg/ml spektinomycin.</li>
		<li>Dyrk denne kulturen ved 37 ° C i en shakerinkubator til den når en optisk tetthet (OD) målt ved en bølgelengde på 600 nm i området 2-3 for umerkede septiner eller 0,6-0,8 for msfGFP / mEGFP-merkede septiner og induser proteinuttrykk ved å legge til en endelig konsentrasjon på 0,5 mM IPTG. Den lavere OD for de merkede septinene er å unngå å nå dødsfasen i lengre uttrykkstid, som beskrevet i neste trinn.</li>
		<li>Inkuber cellene som uttrykker umerkede septin hetero-oligomerer i 3 timer ved 37 °C eller cellene som uttrykker msfGFP-merkede hetero-oligomerer over natten ved 17 °C. MERK: Den korte proteinuttrykkstiden for umerkede komplekser, tilrettelagt ved bruk av det rikere TB-mediet, er valgt for å forhindre proteinnedbrytning. Den lengre uttrykkstiden kombinert med lavere temperatur for merkede komplekser er valgt for å tillate riktig folding av msfGFP-taggen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bakteriell lysis og lysatavklaring MERK: Fra dette tidspunktet og fremover i renseprosedyren, hold den proteinholdige løsningen på is eller ved 4 ° C til enhver tid for å forhindre nedbrytning av proteolytisk protein eller tap av aktivitet.<ol><li>Samle de dyrkede cellene ved sentrifugering ved 4000 x g i 20 minutter ved 4 ° C. Kast supernatanten.<ol><li>Eventuelt snap-frys pelleten i dette trinnet og oppbevar ved -80 ° C i maksimalt 6 måneder. Hvis dette alternativet er valgt, sørg for å tine pelleten på is før du fortsetter.</li>
		</ol></li>
		<li>Løs opp pelleten i 100 ml lysisbuffer (tabell 2) og lys cellene. Velg ett av de to alternativene nedenfor<ol><li>Sonikere i 7 sykluser på 30 s ON og 59 s OFF med en spiss sonicator ved hjelp av 30% amplitude (merk at innstillingene er sonikatoravhengige).</li>
			<li>Bryt ned cellene i den franske pressen ved å sende dem minst 3x.</li>
		</ol></li>
		<li>Klargjør cellelysatet ved sentrifugering ved 20 000 x g i 30 minutter ved 4 °C og hold supernatanten. Det anbefales å starte med trinn 1.5.1. i løpet av dette sentrifugaltrinnet.</li>
		<li>Eventuelt ta en prøve for denaturering av elektroforese, som beskrevet i avsnitt 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Affinitetskromatografi for His-merkede proteiner MERK: Dette trinnet gir komplekser som inneholder human SEPT2 eller Drosophila Sep1 ved hjelp av en nikkelkolonne (figur 1B).<ol><li>Likevekt en ferdigpakket nikkelsepharose høyytelseskromatografikolonne med septinbuffer (tabell 2).</li>
		<li>Legg den avklarte supernatanten på kolonnen ved 1 ml / min og vask det bundne proteinet med minst tre kolonnevolumer septinbuffer.</li>
		<li>Eluter septinkompleksene med 50 % HisTrap elueringsbuffer (tabell 2) ved 1 ml/min mens de samler 0,5 ml fraksjoner for å gi en imidazolkonsentrasjon på 250 mM.</li>
		<li>Velg fraksjonene som inneholder septinkomplekser, som indikert ved optisk absorbans av eluatet ved 280 nm overvåket online med et raskt proteinvæskekromatografisystem (FPLC) eller etter rensingen med et mikrovolumspektrofotometer. MERK: Imidazol absorberer lys ved 280 nm. Dette forklarer trolig hvorfor proteintoppen ikke går tilbake til null absorbans etter septin-eluering (figur 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Affinitetskromatografi for Strep-II-merkede proteiner MERK: Dette trinnet gir komplekser som inneholder enten human SEPT7 (heksamerer), human SEPT9 (oktammerer) eller Drosophila peanøtt ved hjelp av en Strep-Tactin-kolonne (figur 1B). Kromatografikolonnen er basert på et modifisert biotin-streptavidin-system. Proteinet er merket med modifisert biotin (Strep-II-tag), og kolonnen inneholder en konstruert streptavidin (Strep-Tactin). Til tross for at det er modifisert fra biotin-streptavidin-systemet, er det ingen interferens mellom Strep-Tactin-Strep-II-tag-systemet og biotin-streptavidin-systemet. Det beskrevne systemet brukes for å unngå interferens med rekonstitueringsanalyser ved bruk av biotin og streptavidin.<ol><li>Likevekt en ferdigpakket StrepTactin sepharose høyytelseskromatografikolonne med septinbuffer (tabell 2). Last de septinholdige fraksjonene gjenvunnet fra nikkelkolonnen ved 1 ml / min og vask det bundne proteinet med minst tre kolonnevolumer septinbuffer.</li>
		<li>Eluter septinkompleksene med 100% StrepTrap elueringsbuffer (tabell 2) ved 1 ml / min mens du samler 0,5 ml fraksjoner for å gi en konsentrasjon på 2,5 mM desthiobiotin. MERK: Desthiobiotin i StrepTrap elueringsbufferen må oppløses friskt.</li>
		<li>Velg fraksjonene som inneholder septinkomplekser, som indikert av den optiske absorbansen til eluatet ved 280 nm overvåket online med et FPLC-system eller etter rensingen med et mikrovolumspektrofotometer. MERK: Denatureringselektroforese gjøres vanligvis på dette tidspunktet med prøver av kolonnevask og septinfraksjoner. Rekkefølgen på kolonnene kan inverteres med uutslettelige resultater, dvs. det avklarte lysatet etter trinn 1.4. kan bli utsatt for Strep-Tactin affinitetskromatografi etterfulgt av nikkel affinitetskromatografi.</li>
	</ol></li>
	<li>Dialyse og lagring<ol><li>For å fjerne desthiobiotin fra den endelige lagringsløsningen, dialyser septinkompleksene i et ~1:300 prøve-til-buffer-volumforhold mot septinbuffer (tabell 2) supplert med 1 mM DTT over natten, eller i minst 4 timer, ved 4 °C ved bruk av en 30 kDa MWCO dialysemembran.</li>
		<li>Konsentrer eventuelt septinene ved hjelp av en 30 kDa MWCO sentrifugalkonsentrasjonskolonne opp til ønsket konsentrasjon. Sikt på en konsentrasjon på 5-7 μM, målt via løsningen optisk absorbans ved 280 nm og ved bruk av en teoretisk ekstinksjonskoeffisient beregnet via ProtParam (tabell 3).</li>
		<li>Aliquot proteinkompleksene i ønsket aliquotstørrelse, snap-freeze aliquot, og oppbevar den ved -80 ° C. MERK: Det anbefales ikke å lagre proteinet i mer enn 6 måneder. I tillegg anbefales det å utføre regelmessige kvalitetskontrolleksperimenter, spesielt hvis proteinet lagres lenger enn anbefalt tid.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Kvalitetskontroll av renhet og integritet av septin hetero-oligomer
MERK: Hetero-oligomer kvalitetskontroll består av et sett med biokjemiske og bildebehandlingsteknikker som muliggjør påvisning av massen og integriteten til septinkompleksene som er tilstede i løsningen.
<ol><li>Denaturering elektroforese for å kontrollere dannelsen av septin hetero-oligomer med de riktige komponentene<ol><li>Bland 10 μL av de valgte fraksjonene med 10 μL 2x SDS prøvebuffer, legg dem på en prefabrikkert 4% -15% TGX-gel, og fyll systemet med Tris / glycin / SDS kjører buffer.</li>
		<li>Kjør elektroforesen i 35 minutter ved 200 V og flekker gelen (Table of Materials) for å visualisere resultatene. Molekylvektene til de enkelte septinproteinene og septin hetero-oligomere komplekser finnes i tabell 3.</li>
		<li>Mål den relative intensiteten til hvert bånd inne i hver bane som inneholder rensede septiner i et kontrastinvertert bilde. Gjør dette ved å beregne gjennomsnittsintensiteten til like store rektangler rundt hvert bånd og et like stort rektangel på et område uten bånd i samme bane. Normaliser deretter verdiene ved å dele intensiteten til hvert bånd med intensiteten i regionen uten bånd. MERK: Hvis intensiteten er mettet (for eksempel verdier på 255 for et 8-biters bilde på et kontrastinvertert bilde), hopper du over kjørefeltet.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensemble-gjennomsnittlig innfødt størrelsesfordeling via innfødt elektroforese<ol><li>Forbered 800 ml anodebuffer og 200 ml lyseblå katodebuffer dagen før og oppbevar dem i kjøleskapet. For å forberede anodebufferen, fortynn 40 ml 20x løpende buffer med 760 ml type-I avionisert vann (I-vann). For å klargjøre den lyseblå katodebufferen, fortynn 10 ml 20x løpebuffer og 1 ml 20x katodeadditiv med 189 ml I-vann. Den løpende bufferen og katodeadditivet leveres med et sett (Table of Materials).</li>
		<li>Forbered 10 μL av prøven ved å blande ~ 500 ng septin med den nødvendige mengden prøvebuffer (2,5 μL i dette tilfellet, på grunn av bruk av en 4x prøvebuffer, se materialtabell) og nok I-vann til å nå et volum på 10 μL.</li>
		<li>Legg prøvene på gelen og fyll systemet med de iskalde anode- og katodebufferne.</li>
		<li>Kjør elektroforesen i rundt 115 minutter ved 150 V med en strømforsyning som ikke stopper ved lave strømmer og flekker gelen (Table of Materials) for å visualisere resultatene. Molekylvektene til enkeltproteiner og komplekser beregnet ut fra sekvensen finnes i tabell 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Massefordeling av enkeltmolekyler ved hjelp av massefotometri via interferometrisk spredningsmikroskopi<ol><li>Vask # 1,5 glass lysbilder ved å sonikere dem i en ultralydsrenser i 5 minutter i I-vann, 5 min i isopropanol, og til slutt 5 minutter i I-vann.</li>
		<li>Tørk to glassglass med en mild strøm av nitrogengass og legg en 7 μL dråpe 0,01% Poly-L-Lysin (PLL) løsning på midten av et av lysbildene. Plasser deretter midten av det andre lysbildet på toppen av PLL-dråpen, og orienter de to lysbildene ortogonalt for enkel separasjon. Inkuber i 30 s.<ol><li>Vask ved å dyppe i et beger med I-vann 1x og ved å påføre en strøm av I-vann 2x direkte. Tørk deretter de to lysbildene med en strøm av nitrogengass. Disse lysbildene kan lagres etterpå i rundt 6 uker ved romtemperatur under tørre forhold. Merk: Merk siden av lysbildet som er behandlet med PLL, for å kjøre eksperimentet på riktig måte.</li>
		</ol></li>
		<li>Like før eksperimentet, kutt et stykke 2 x 2, 3 x 2 eller 3 x 3 pakninger (som gir henholdsvis 4, 6 eller 9 avbildningskamre / lysbilde) og hold det på PLL-behandlet del av et glassglass mens du unngår glassglasset og pakningene som kommer i kontakt med en skitten overflate. Plasser lysbildet på et lett viskervev og trykk på pakningene med en pipettespiss for å feste dem med den beskyttende plasten fortsatt på pakningene.</li>
		<li>Varm septinbuffer (tabell 2) til romtemperatur og tine proteinene i hånden (hold dem på is etterpå). MERK: iSCAT viser signalet til noen vaskemidler og små molekyler som ligner proteinsignaler45. DTT er et av de små molekylene, og det er derfor det ikke brukes til dette eksperimentet. Det er bare spor av DTT som kommer fra den lagrede septinen.</li>
		<li>Plasser lysbildet med pakninger på det kommersielle massefotometrisystemet som inneholder 19 μL septinbuffer og fokuser mikroskopet ved hjelp av autofokusalternativet. Følg produsentens instruksjoner for å sjekke om fokuset er riktig. Standard 100x-målet som er en del av oppsettet brukes her.</li>
		<li>Opprett eller last inn en prosjektmappe for å lagre dataene ved hjelp av File > New Project eller File > Load Project.</li>
		<li>Pipette 1 μL prøve på 19 μL septinbufferfall (trinn 2.3.5) brukes til å fokusere og blande mens du minimerer bevegelsen av lysbildet ved ikke å berøre noe mens du gjør det. Ta deretter opp en video med 6,000 bilder ved å klikke på Record.<ol><li>For korrekt analyse, registrer følgende prøver: septinbuffer, proteinmassestandard for kalibrering av signal-til-masse-forholdet (hvis en nylig kalibrering er tilgjengelig og miljøforholdene ikke er endret, kan denne prøven hoppes over) og 250 nM septinkomplekser fortynnet i septinbuffer uten DTT (dette gir en endelig konsentrasjon på ~ 12,5 nM).</li>
		</ol></li>
		<li>Analyser videoene ved hjelp av produsentens programvare for å oppnå proteinmassefordelingen. Se etter data av god kvalitet som følger.<ol><li>Hvis toppene av forskjellige septin hetero-oligomerer størrelser overlapper for mye eller for mange hendelser oppdages (>3,500 hendelser for en 6,000-frames video med det vanlige synsfeltet på 128 piksler x 34 piksler som spenner over 10.8 μm x 2.9 μm), reduser den endelige septinkonsentrasjonen og mål igjen.</li>
			<li>Hvis det ikke er nok tellinger av enkeltmolekyler målt (minst 2,500-3,500 for en 6,000-ramme video med det vanlige synsfeltet), øk septinkonsentrasjonen og mål igjen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Direkte avbildning av septinkomplekser via negativ flekktransmisjonselektronmikroskopi<ol><li>Fortynn prøver til en konsentrasjon på ca. 50 nM i septinbuffer og klargjør fargeløsningen (2% uranylformat eller uranylacetat i I-vann). MERK: Uranyl formate må tilberedes frisk.</li>
		<li>Pipette 4 μL fortynnede septiner på et glødutladet elektronmikroskopigitter og inkuber i 30 s.</li>
		<li>Fjern det meste av proteinoppløsningen ved hjelp av et filterpapir og vask rutenettet 2x med septinbuffer og 1x med I-vann for å fjerne løst adsorberte septiner.</li>
		<li>Flekk med 2% uranylacetat eller uranylformatoppløsning i I-vann i 1 min, absorber fargeløsningen med et filterpapir og lufttørk rutenettet i noen minutter.</li>
		<li>Screen rutenettet ved hjelp av et riktig justert transmisjonselektronmikroskop for å søke etter regioner med forbedret flekk og samle ca 100 bilder innenfor disse utvalgte områdene.</li>
		<li>Samle bilder med en forstørrelse på minst 50 000x for å oppnå en pikselstørrelse på omtrent 2 Å/piksel og med en defokusering som varierer fra −1 μm til −2 μm. Bruk en akselerasjonsspenning på 200 kV. Bruk helst en automatisert prosedyre for å samle inn dataene, som vil avhenge av tilgjengelig anskaffelsesprogramvare.</li>
		<li>Utfør 2D-bildebehandling ved hjelp av dedikert programvare<ol><li>Boks ut minst 2,000 partikler ved hjelp av en dedikert programvare46.</li>
			<li>Utfør todimensjonal justering og klassifisering iterativt til klasser oppnås uten ytterligere forbedring. Det første justerings- og klassifiseringstrinnet bør være referansefritt for å unngå skjevheter i klassifiseringen.</li>
			<li>Bruk gjennomsnittene fra den første referansefrie klassifiseringen som nye referanser for å gjennomføre en ekstra runde med klassifisering. Gjenta denne prosessen iterativt til ingen ytterligere forbedring oppnås. Sørg for at hver klasse er basert på 50 til 100 plukkede partikler, og at individuelle underenheter er godt synlige. Ulike programvareverktøy kan brukes (Spider, Eman eller Relion) 46,47,48.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Septin funksjonell kvalitetskontroll via polymerisasjonsanalyse
MERK: Funksjonalitetskvalitetskontrollen består av et sett med bildebehandlingsteknikker som gjør det mulig å oppdage polymeriserte septinkomplekser. Nedenfor blir umerkede septiner referert til som "mørke" septiner, og bufferen som brukes til polymerisering av umerkede septiner, refereres til som "mørk" septinpolymerisasjonsbuffer (SPB).
<ol><li>Septinbuntavbildning via fluorescensmikroskopi<ol><li>Forbered 5x fluoSPB (tabell 2) og en septinblanding bestående av 90% mørk septin og 10% msfGFP-septin ved seks ganger høyere konsentrasjon enn ønsket sluttkonsentrasjon i septinbuffer + 1 mM DTT. En typisk konsentrasjon for denne analysen er 300 nM, og derfor er konsentrasjonen 1,800 nM for denne blandingen.</li>
		<li>Polymeriser septinen ved å blande, i denne spesifikke rekkefølgen, I-vann (nok til å fylle opp til det endelige ønskede volumet), 20% 5xfluoSPB (en endelig fortynning på 1: 5), 0,05 μM PCD og 16,67% septinblanding (en endelig fortynning på 1: 6). For 10 μL blandes 6,23 μL I-vann, 2 μL 5xfluoSPB, 0,1 μL PCD (med en bestand på 5 μM) og 1,67 μL septinblanding. Inkuber denne blandingen i minst 30 minutter ved romtemperatur.</li>
		<li>Legg prøvene til et bildekammer vasket med fluoSPB (tabell 2) og avbilde septinbuntene. PLL-PEG-passiverte strømningskanaler, som beskrevet i tidligere forskning10,32, fungerer bra for dette eksperimentet.</li>
	</ol></li>
	<li>Septinbunt som forestilles via negativ flekktransmisjonselektronmikroskopi<ol><li>Forbered 5x darkSPB (tabell 2) og en septinblanding bestående av 100% mørk septin ved seks ganger høyere konsentrasjon enn ønsket sluttkonsentrasjon i septinbuffer + 1 mM DTT. En typisk konsentrasjon for denne analysen er 300 nM, og derfor er konsentrasjonen 1,800 nM for denne blandingen.</li>
		<li>Polymeriser septinkompleksene ved å blande, i denne spesifikke rekkefølgen, I-vann (nok til å fylle opp til det endelige ønskede volumet), 20% 5xdarkSPB og 16,67% septinblanding. For 5 μL blandes 3,16 μL I-vann, 1 μL 5x darkSPB og 0,83 μL septinblanding. Inkuber denne blandingen i minst 30 minutter ved romtemperatur.</li>
		<li>Tilsett 3-5 μL prøve til et glødutladet elektronmikroskopigitter og inkuber i 1 min. Vask deretter rutenettet 2x med darkSPB (tabell 2) ved å absorbere væsken med et filterpapir og tilsett en dråpe darkSPB-buffer, vask 1x med I-vann, inkuber i ~ 30 s med 2% uranylacetat, flekk flekken og lufttørk prøven i noen minutter.</li>
		<li>Bilde septinbuntene ved 120 kV og forstørrelser mellom 5,000x og 60,000x med en defokusering på mellom 1-2 μm.</li>
	</ol></li>
</ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende eller økonomiske interesser.

Metoden beskrevet her muliggjør robust rensing og kvalitetskontroll av forformede septin hetero-oligomerer. Noen av de viktigste spørsmålene å vurdere for riktig anvendelse av metoden er som følger. Under elueringstrinnene i kromatografiske separasjoner er det viktig å bruke den anbefalte (eller lavere) strømningshastigheten for å minimere fortynningen av septinkompleksene. I tillegg, for å maksimere utvinningen av protein under det siste konsentrasjonstrinnet, er konsentratorkolonnen orientert på en slik måte at løsningen ikke skyves mot filteret (når det bare er et filter på den ene siden). Hvis løsningen går direkte til filteret, stikker proteinet mye mer til det, noe som reduserer det endelige utbyttet betydelig. Det er også viktig å vurdere at konsentrasjonstrinnet ikke alltid er nødvendig. Plukking av fraksjoner bare fra et smalt område rundt toppen i kromatogrammet gir vanligvis en høy nok lagerkonsentrasjon (>3000 nM) for mange rekonstitueringsapplikasjoner (som vanligvis opererer mellom 10-300 nM). Til slutt, for kvalitetskontroll av funksjonaliteten til septinkompleksene ved fluorescensmikroskopi, er det viktig å passivere overflaten av mikroskopibildene riktig, siden septinkomplekser ivrig holder seg til glass. Passivering av glassglassene kan gjøres enten via PLL-PEG-funksjonalisering eller ved dannelse av nøytrale (100% DOPC) støttede lipid dobbeltlag11,32.
Sammenlignet med den opprinnelige renseprotokollen som først ble beskrevet i Iv et al.10, er det en endring i buffersammensetningene (tabell 2). Konsentrasjonen av MgCl 2 er redusert fra 5 mM til2 mM, og konsentrasjonen og pH i Tris-HCl er redusert fra henholdsvis 50 mM til 20 mM og fra 8,0 til 7,4. Disse endringene ble gjort for å gjøre bufferforholdene kompatible med studier av interaksjoner av humane septiner med lipid-dobbeltlag, aktinfilamenter og mikrotubuli10,11,32. Dette skyldes at forfatterne dannet støttede lipid dobbeltlag og polymerisert aktin i F-bufferen, hvis sammensetning er identisk med darkSPB, bortsett fra tilstedeværelsen av ATP i F-bufferen. Bufferendringen ga ingen endringer i kvaliteten eller levetiden til de rensede septinene sammenlignet med de opprinnelige bufferne.
Denne metoden for rensing har fortsatt flere begrensninger. For det første kan forskjellige renseforsøk variere i utbytte (0,5-1 ml 2-5 μM septinkomplekser) og funksjonell kvalitet, som kontrollert av buntdannelsesevnen til de rensede septinkompleksene. Derfor er det svært viktig å konsekvent utføre kvalitetskontrollene som er beskrevet i dette papiret. Å kontrollere veldig godt uttrykkstidene og den optiske tettheten til bakteriekulturen kan bidra til å redusere forskjellen i utbytte. For det andre kan denne renserørledningen ikke skille mellom trimere og heksamerer eller mellom tetramerer og oktamoer (figur 1B). Imidlertid kan kvalitetskontrolleksperimentene brukes til å bevise at flertallet av septinkomplekser er i sin lange oligomerform. I tilfelle en enda smalere oligomerstørrelsesfordeling er nødvendig, kan størrelsesekskluderingskromatografi settes inn mellom trinn 1.6. og trinn 1.7. i renselsesprotokollen. Dette valgfrie trinnet reduserer imidlertid utbyttet dramatisk, og det anbefales ikke med mindre det er strengt nødvendig. En siste, mer grunnleggende begrensning kommer fra bruken av E. coli som uttrykkssystem for rekombinante septinkomplekser. Naturligvis tillater dette systemet ikke posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM), som er rapportert i dyreceller, som fosforylering, acetylering og sumoylering 6,51,52,53. Disse posttranslasjonelle modifikasjonene kan legges til ved å implementere en lignende rensestrategi i insekt- eller humane celler. Videre har dette papiret bare diskutert rekonstituering av septiner av seg selv, men studier i celler indikerer at regulatoriske proteiner som proteiner fra Borg-familien 54,55 og anillin 24,25,56 kan ha betydelige, men dårlig forståtte effekter på montering og funksjoner av septiner og er derfor viktig å til slutt innlemme in vitro. Studier. Protokoller for rensing av Borg-proteiner og anillin er rapportert54,57.
Septinrensingsprotokollen som er rapportert her, tilbyr en standardisert måte å rense septiner i oligomerform med riktig subenhetsstøkiometri, noe som gir et viktig fremskritt i forhold til mange tidligere in vitro-studier som er avhengige av enkeltseptin-underenheter. Selv om noen septiner i bestemte sammenhenger kan fungere som en enkelt underenhet2, antyder den nåværende litteraturen sterkt at septiner i dyreceller for det meste fungerer i komplekser 9,58. Derfor er bruk av forhåndsformede hetero-oligomerer, som de som er beskrevet i dette papiret og andre 10,11,18,32,35,36,37, av stor betydning for å studere de strukturelle og biofysiske egenskapene til septiner via in vitro. rekonstituering for å dissekere deres funksjoner i cellen. Videre er septiner selvmonterende proteiner med mange interaksjonspartnere, inkludert membranen og cytoskelettet, noe som gjør dem av stor interesse for nedenfra og opp syntetisk biologi 59,60,61 og studier av proteininduserte endringer i membranens biofysiske egenskaper som krumning42,62,63.

Cytoskjelettet har blitt klassisk beskrevet som et trekomponentsystem bestående av aktinfilamenter, mikrotubuli og mellomliggende filamenter 1, men nylig har septiner blitt anerkjent som en fjerde komponent i cytoskelettet1. Septiner er en familie av GTP-bindende proteiner som er konservert i eukaryoter2. Septiner er involvert i mange cellulære funksjoner som celledeling3, celle-celleadhesjon4, cellemotilitet5, morfogenese6, cellulær infeksjon7, og etablering og vedlikehold av cellepolaritet8. Til tross for deres viktige funksjoner, er hvordan septiner er involvert i slike prosesser dårlig forstått.
Septinfamilien av proteiner er delt inn i flere undergrupper (fire eller syv, avhengig av klassifiseringen) basert på proteinsekvenslikhet2. Medlemmer av forskjellige underfamilier kan danne palindromiske hetero-oligomere komplekser, som er byggesteinene til filamenter og som igjen settes sammen til høyere ordens strukturer som bunter, ringer og meshworks 1,9,10,11,12. Ytterligere molekylær kompleksitet oppstår ved tilstedeværelsen av forskjellige spleisevarianter, et eksempel er menneskelig SEPT9, hvor det er bevis for spesifikke funksjoner av forskjellige spleisevarianter13,14,15. I tillegg avhenger lengden på hetero-oligomerer av art og celletype. For eksempel danner Caenorhabditis elegans septiner tetramerer16, Drosophila melanogaster septiner danner heksamerer 17 (figur 1A), Saccharomyces cerevisiae septiner danner oktamere18, og menneskelige septiner danner både heksamerer og oktamiere19 (figur 1A). Evnen til septinisoformer, spleisevarianter og posttranslasjonelt modifiserte septiner fra samme underfamilie til å erstatte hverandre i komplekset og (sam)eksistensen av hetero-oligomerer av forskjellig størrelse har gjort det vanskelig å avgrense de cellulære funksjonene til forskjellige hetero-oligomere komplekser12.
En annen interessant evne til septiner er deres evne til å samhandle med mange bindende partnere i cellen. Septiner binder plasmamembranen og membranøse organeller under interfase og celledeling20,21,22. I delende celler samarbeider septiner med anillin 23,24,25 og aktin og myosin under cytokinese 26,27. I de sene stadiene av cytokinesen synes septiner å regulere de endosomale sorteringskompleksene som kreves for transportsystemet (ESCRT) for midtkroppsabscissjon28. I tillegg er det også tegn på septin plassert på aktinbarken og aktinstressfibre av celler i interfaseceller 29,30,31. I spesifikke celletyper binder og regulerer septiner også mikrotubulicytoskjelettet32,33.
Alle disse funksjonene gjør septiner til et veldig interessant proteinsystem å studere, men også utfordrende. Kombinasjonen av det store antallet septin-underenheter (13 gener hos mennesker uten å telle spleisevarianter2) med potensialet til septin-underenheter fra samme underfamilie for å erstatte hverandre og danne hetero-oligomerer av forskjellig størrelse, gjør det vanskelig å trekke en konklusjon om den cellulære funksjonen til en bestemt septin ved genetisk manipulasjon. Videre gjør de mange interaksjonene av septiner det vanskelig å tolke effekten av vanlige forskningsverktøy som legemidler34 rettet mot cytoskeletale eller membrankomponenter.
En måte å overvinne denne situasjonen på er å komplementere forskning på celler med in vitro (cellefri) rekonstituering av septiner. In vitro rekonstituering tillater isolering av en enkelt type septin hetero-oligomerer med en spesifikk subenhetssammensetning og lengde 18,35,36,37. Dette komplekset kan deretter studeres i et kontrollert miljø, enten alene for å oppdage de grunnleggende strukturelle og fysisk-kjemiske egenskapene til septiner 38,39,40, eller i kombinasjon med ønskede partnere som modellbiomembraner 11,41,42, aktinfilamenter 10,27 eller mikrotubuli 32,36 for å dechiffrere arten av deres Interaksjoner.
Derfor er en pålitelig metode for å rense forskjellige septinkomplekser effektivt avgjørende for septinforskning. Men selv ved å bruke den samme protokollen, kan forskjellige rensinger gi proteiner med forskjellig aktivitet / funksjonalitet eller til og med integritet. For kommersielt tilgjengelige proteiner som enzymer, er funksjonaliteten og enzymatisk aktivitet nøye validert43. Implementering av nøye kvalitetskontroll for cytoskeletale eller strukturelle proteiner som septiner kan være utfordrende, men det er viktig å gjøre eksperimenter på tvers av laboratorier sammenlignbare.
Dette papiret beskriver en robust metode for å rense rekombinante septiner av høy kvalitet i deres hetero-oligomere form basert på samtidig uttrykk av to vektorer som inneholder mono- eller bi-cistroniske konstruksjoner (tabell 1) i Escherichia coli-celler. Metoden består av en to-trinns affinitetskromatografitilnærming for å fange septin hetero-oligomerer som inneholder både enhans 6-merket septin og en Strep-II-merket septin (figur 1B, C). Denne protokollen, først beskrevet i Iv et al.10, har blitt brukt til å rense Drosophila septin heksamerer 11,27,35, human septin heksamerer 10, og flere humane septinoktamere som inneholder forskjellige innfødte (isoform 1, 3 og 5) 10,32 eller muterte SEPT9 isoformer 32 . Videre gis en beskrivelse av et sett med teknikker for å vurdere kvaliteten på de rensede septinene. For det første kontrolleres integriteten og korrekt støkiometri av septin-underenhetene ved hjelp av denaturerende elektroforese og transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Deretter undersøkes tilstedeværelsen av hetero-oligomerer av riktig molekylmasse og tilstedeværelsen av monomerer eller mindre oligomerer som indikerer kompleks ustabilitet ved innfødt elektroforese og massefotometri via interferometrisk spredningsmikroskopi (iSCAT). Til slutt består det siste trinnet av vurderingen av polymerisasjonsaktiviteten til septinene ved bruk av fluorescensmikroskopi og TEM.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2.jpg"> Figur 1: Rensestrategi . (A) Skjemaer av septin hetero-oligomerer som eksisterer i humane (venstre) og Drosophila (høyre) celler. Tall betegner septinunderenheter fra de angitte gruppene, og P betegner Peanut. Menneskelig SEPT9 kan være hvilken som helst av dens isoformer. Septin-underenhetene har en asymmetrisk form og er langsgående forbundet med to forskjellige grensesnitt, NC: NC og G: G-grensesnittet, som betegnet av henholdsvis NC og G, på toppen av den menneskelige heksameren. (B,C) Skjematisk illustrasjon av totrinnskromatografistrategien, vist for (B) humane septinheksamører og (C) oktamerer. H indikerer hans-taggene, mens S indikerer Strep-II-taggene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>488nm laser combiner iLAS2</td>
			<td>Gataca</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488nm Sapphire laser lines</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4k X 4k F416 CMOS camera</td>
			<td>TVIPS</td>
			<td></td>
			<td>For JEM-1400plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x sample buffer nativePAGE</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (TROLOX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>To prevent blinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 M1</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>1680311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Type-B, 300 mesh EM grid</td>
			<td>Ted pella</td>
			<td>01813-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Type-B, 300 mesh EM grid</td>
			<td>Electron micoscopy sciences</td>
			<td>CF300-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass #1.5H</td>
			<td>Thorslabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1-M1 confocal unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desthiobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1411-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibtor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>481761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP, 5 mL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>29-0588-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iLAS2 azimuthal TIRF illumination system&#160;</td>
			<td>Gataca</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1202-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Protein Gel Stain</td>
			<td>Westburg Life Sciences</td>
			<td>EP ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>10849040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 888 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EM-CCD&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400plus</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td>TEM microscope TUDelft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kappa-cassein&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-6X1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971-10G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746452-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylecllulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8074844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ system (Integral 10)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td></td>
			<td>I-water dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean TGX gels</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativeMark unstained protein standard</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC0725</td>
			<td>For iSCAT and Native gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE 4-16% GELS</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN1002BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE Running Buffer kit</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E&#160;</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nr. 1 Menzel coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo &#215;100/1.45 NA oil immersion objective</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(L-lysine)-graft-biotinylated PEG (PLL-PEG)</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>CHF560.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution 0.01%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td>For iSCAT glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for native gels</td>
			<td>CONSORT</td>
			<td>S/N 71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWERPAC UNIVERSAL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>042BR31206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td>oxygen scavenger - enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03930590-50MG</td>
			<td>oxygen scavenger - reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quemesa camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Tecnai Spirit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refeyn OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample buffer, laemmli 2x concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-10vl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon gaskets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL103250-10EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes 30k MWCO 3mL</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>66381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1441-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap HP, 1 mL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>28-9075-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit microscope</td>
			<td>Thermo Scientific, FEI</td>
			<td></td>
			<td>TEM microscope Institute Curie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0918-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/Glyine/SDS buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6, 30,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0622</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and quality control of recombinant septin complexes for cell-free reconstitution

Septiner er en familie av konserverte eukaryote GTP-bindende proteiner som kan danne cytoskeletale filamenter og høyere ordens strukturer fra hetero-oligomere komplekser. De samhandler med andre cytoskeletale komponenter og cellemembranen for å delta i viktige cellulære funksjoner som migrasjon og celledeling. På grunn av kompleksiteten i septinenes mange interaksjoner, det store antallet septingener (13 hos mennesker) og septinenes evne til å danne hetero-oligomere komplekser med forskjellige underenhetssammensetninger, er cellefri rekonstituering en viktig strategi for å forstå det grunnleggende i septinbiologi. Denne artikkelen beskriver først en metode for å rense rekombinante septiner i deres hetero-oligomere form ved hjelp av en to-trinns affinitetskromatografitilnærming. Deretter er prosessen med kvalitetskontroll som brukes til å kontrollere renheten og integriteten til septinkompleksene detaljert. Denne prosessen kombinerer innfødt og denaturerende gelelektroforese, negativ flekkelektronmikroskopi og interferometrisk spredningsmikroskopi. Til slutt gis en beskrivelse av prosessen for å kontrollere polymerisasjonsevnen til septinkomplekser ved bruk av negativ flekkelektronmikroskopi og fluorescerende mikroskopi. Dette viser at det er mulig å produsere høykvalitets humane septinheksamører og oktamiere som inneholder forskjellige isoformer av septin_9, samt Drosophila septin hexamers.

Som nevnt i protokollen ble 5 L av E. coli-celler samtransformert med de to septinuttrykkende plasmidene dyrket, og uttrykket av septiner ble indusert ved å legge til IPTG. Etter 3 timer ble cellene samlet ved sentrifugering, resuspended i lysisbuffer og lyset ved sonikering. Lysatet ble deretter avklart ved sentrifugering, og den klargjorte løsningen ble påført en HisTrap-kolonne (figur 2A). Etter den første rensingen ble de septinholdige fraksjonene samlet og påført en StrepTrap-kolonne (figur 2B). Dette gir vanligvis rundt 3-5 ml ~ 1 μM septinkompleks. Før du samler septinholdige fraksjoner, kan denaturerende gelelektroforese brukes til å kontrollere integriteten til septin-underenhetene og det ekvimolære støkiometriske forholdet mellom de forskjellige septin-underenhetene som danner komplekset. (Figur 3A). Hvis gelen viser tilsvarende intense bånd som tilsvarer molekylvektene (tabell 3) til septin-underenhetene, kan protokollen fortsette. Hvis ikke, anbefales det å starte protokollen på nytt. I eksemplet vist for human septinoktamer med SEPT9_i1, viser figur 3A tydelig bånd som tilsvarer SEPT9_i1, SEPT6, SEPT7 og SEPT2 (i rekkefølgen fra topp til bunn) med lignende intensiteter; konfidensintervallet på 99 % for normalisert intensitet var 1,128 ± 0,048 for SEPT2, 1,092 ± 0,034 for SEPT6, 1,108 ± 0,040 for SEPT7 og 1,067 ± 0,029 for SEPT9. Hvis SEPT2 er merket med msfGFP, vil det skifte opp veldig nært under SEPT9_i1. Avhengig av elektroforesesystemet som brukes og tilstedeværelsen av C-terminal TEV-Strep-taggen for SEPT7 (som gjør at den migrerer saktere enn ukodet SEPT7), smelter SEPT7- og SEPT6-båndene noen ganger sammen på grunn av deres sammenlignbare molekylvekter. Det neste trinnet er å samle fraksjonene og dialysere dem mot septinbuffer med DTT. Etter dialysen, hvis konsentrasjonen er for lav (<2 μM) eller en høyere konsentrasjon er nødvendig for forsøkene, kan et konsentrasjonstrinn inkluderes, som beskrevet i protokollen. Konsentrasjoner under 1 μM indikerer vanligvis en dårlig funksjonell kvalitet på septinene. En endelig septinkomplekskonsentrasjon mellom 3,5 μM og 7 μM fungerer bra for de fleste in vitro-analyser . Disse konsentrasjonene oppnås vanligvis når volumet etter konsentrasjon når 0,5-1 ml.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig02.jpg"> Figur 2: Eksempel på kromatogrammer tilsvarende rensing av mørk human septin octamers_9i1 . (A) HisTrap kolonnekromatogram. Etter septin-elueringstoppen går absorbansen ikke tilbake til null, sannsynligvis på grunn av tilstedeværelsen av imidazol i bufferen. Den samlede fraksjonen gikk fra starten av elueringstoppen til absorbansen stabiliserte seg på rundt 250 ml. (B) StrepTrap kolonnekromatogram. Den samlede fraksjonen gikk fra starten av elueringstoppen til absorbansen gikk tilbake til rundt 0 ved 50 ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
For å fortsette med kvalitetskontrollen ble det utført innfødt elektroforese, som beskrevet i protokollen (figur 3B). I gelene kan man observere et større bånd som tilsvarer de intakte hetero-oligomerene, og vanligvis et mindre bånd som tilsvarer dimerer. Menneskelige heksamører finnes litt over 242 kDa-markørbåndet, mens oktamier finnes over 480 kDa-båndet, over deres beregnede molekylmasse. Plasseringen av disse båndene ble kontrollert ved vestlig blotanalyse av eukaryote celleekstrakter32. Merking med msfGFP parer hver SEPT2 med et msfGFP-protein. Dette medfører en økning i molekylvekten til septinkomplekser på 53,4 kDa (26,7 kDa / msGFP-molekylet). Likevel, på den innfødte elektroforesegelen, er den tilsynelatende molekylvekten til de msfGFP-merkede kompleksene ikke skiller seg fra de umerkede kompleksene.
En komplementær teknikk for å teste om septinkompleksene er intakte, er massefotometri ved iSCAT-mikroskopi. iSCAT overvåker lysspredningen av molekyler som lander på et glassglass forsterket av interferens med referanselys, vanligvis refleksjonen av laseren på bunnen av glassglasset. Deretter brukes en bakgrunnssubtraksjonsmetode for å gi kontrast til partiklene. På grunn av denne korreksjonen viser signalet positive og negative verdier avhengig av om partiklene lander på glasset eller beveger seg bort fra det49. Det oppdagede signalet er direkte proporsjonalt med molekylvekten til proteiner50. Derfor kan en signal-til-masse-kalibrering med en massestandard bestemme massen av prøveproteinene. Figur 3C viser et eksempel på humane septinoktamere som inneholder SEPT9_i1. De fleste av de oppdagede enkeltpartiklene (~ 50%) har en molekylvekt som forventes for komplette oktamier som inneholder SEPT9_i1 (423 kDa) (figur 3C). Det er også partikler med masser mellom 150-300 kDa, men ingen klar topp observeres, noe som indikerer mulig tilstedeværelse av andre septinarter i lav overflod. På samme måte har de fleste av de oppdagede enkeltpartiklene for mEGFP-merkede Drosophila-heksamører en molekylvekt som forventes for intakte heksamører (361 kDa) (figur 3D). En ytterligere klar topp ved 241 kDa indikerer tilstedeværelsen av stabile tetramerer som inneholder to peanøttproteiner, en DSep1 og en mEGFP-DSep2. Til slutt viser både menneske- og flueptinkompleksene en topp rundt 80 kDa som kan være en blanding av monomerer og dimere, muligens forsterket av et spor av DTT eller et hvilket som helst annet lite molekyl som aggregerer, og viser en topp i den positive siden av plottet45.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2.jpg"> Figur 3: Eksempler på resultater fra oligomerkvalitetskontrollen . (A) Eksempel på denatureringsgel som viser forskjellige fraksjoner av elueringstoppen fra rensing av mørk menneskelig septin octamers_9i1. (B) Eksempel på innfødt elektroforese av forskjellige septinkomplekser. (C,D) Ulike eksempler på histogramresultater av massefotometri ved 12,5 nM septinkomplekser: (C) mørk human septin octamers_9i1 og (D) DSep1-msfGFP Drosophila septin hexamers. Linjer er Gaussian passer. (E) TEM-bilde av 25 nM mørk menneskelig septin octamers_9i1 i septinbuffer. Skala bar = 200 nm. (F) Klasse gjennomsnittlig bilde av SEPT2-msfGFP human septin octamers_9i1. MsfGFP-taggene er synlige som uklare tettheter i de to endene. Skala bar = 10 nm. Paneler (E) og (F) er opphavsretten til The Company of Biologists og er tilpasset fra Iv et al.10 med tillatelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Gitt at både innfødte geler og iSCAT bare gir ensemble-gjennomsnittlig informasjon, ble klassegjennomsnitt av transmisjonselektronmikroskopibilder av enkeltseptinoligomerer brukt til å kontrollere integriteten og renheten til kompleksene ved direkte visualisering. I TEM-bilder av septinkomplekser i septinbuffer kan stenger på 24 nm (heksamører) eller 32 nm (oktammerer) i lengde observeres. Et eksempel på en human septinoktamer som inneholder SEPT9_i1 kan ses i figur 3E. Når klassen gjennomsnitt dem, hver av underenhetene kan observeres og telles, som sett for msfGFP-merket menneskelig oktammer med SEPT9_i1 i figur 3F. Hvis oligomeren er fluorescerende merket, kan det observeres ekstra tettheter som tilsvarer SEPT2-msfGFP på enden av stengene (figur 3F).
Kombinasjonen av de ovennevnte teknikkene viser at octamers (eller hexamers) med riktig støkiometrisk forhold og høy renhet kan renses ved hjelp av den beskrevne protokollen. Endelig er den siste kvalitetskontrollen for funksjonaliteten til septinkompleksene når det gjelder deres polymerisasjonsevne. I nærvær av lav saltkonsentrasjon (<150 mM KCl med den beskrevne bufferen 9), hvis septiner ikke er i nærvær av andre proteiner eller negativt ladede lipidmembraner, monterer de seg selv i bunter9. Septiner forhindres fra polymerisering ved å holde dem i lagringsbufferen, som har en høy (300 mM) KCl-konsentrasjon. Septin hetero-oligomerer fortynnes deretter i et volumforhold på 1:6 i en buffer med samme sammensetning, men uten KCl for å oppnå en endelig KCl-konsentrasjon på 50 mM. For å gjøre fluorescensavbildning, kompletteres denne bufferen med et oksygenrensesystem for å beskytte mot fotobleking og med en blinkende suppressor. I TIRF-mikroskopi kan små klynger av proteiner observeres innenfor det grunne TIRF-feltet (~ 100 nm; Figur 4A,B). På et konfokalt mikroskop kan store klynger av filamentøse strukturer ses flytende høyere opp i løsningen (figur 4C). Til slutt, med TEM, kan små bunter av septin (figur 4D), tilsvarende klyngene observert av TIRF, og store bunter (figur 4E), tilsvarende strukturer observert ved konfokalmikroskopi, observeres. Innfeltene i figur 4D, E avslører at begge typer strukturer består av lange, tynne filamenter som går parallelt og danner bunter med koniske ender. Sammen viser fluorescens- og TEM-bildene at de rensede septinkompleksene kan polymerisere til filamenter, som igjen selvmonteres i bunter.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig04.jpg"> Figur 4: Eksempler på resultater av polymerisasjonsevnen kvalitetskontroll. (A) TIRF-bilde av 300 nM humane septinheksamører (10% msfGFP-merkede heksamører) i fluoSPB. (B) TIRF-bilde av 300 nM humane septinoktamere som inneholder SEPT9_i1 (10 % msfGFP-merket octamers9_i1) i fluoSPB. (C) Konfokale maksimale intensitetsprojeksjoner av Z-stabler over ~ 30 μm med 0,5 μm avstand på 300 nM human septin octamers_9i3 i fluoSPB. (A-C) Skalalinje = 10 μm og inverterte gråtoner. (D,E) Eksempel på TEM-bilder av (D) små og (E) store bunter av menneskelig septin octamers_9i1 i darkSPB. Innfelt viser områder der det kan observeres tydelige filamenter som går parallelt i bunten. Skala barer = 500 nm. Paneler (C-E) er opphavsrettslig beskyttet av The Company of Biologists og er tilpasset fra Iv et al.10 med tillatelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 1: Liste over plasmider. Plasmider for å rense septin oligomerer etter denne protokollen. Alle plasmider er deponert i Addgene (første kolonne). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%201_V2.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 2: Liste over buffere. Buffersammensetninger som brukes til rensing og kvalitetskontroll av septin oligomerer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%202(1).xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 3: Molekylvekter og utryddelseskoeffisienter. Liste over molekylvekter (MW) og optiske ekstinksjonskoeffisienter (ε) ved en bølgelengde på 280 nm beregnet med ProtParam basert på sekvensene av komplekset, forutsatt lineær fusjon av septin-underenhetene, de forskjellige septinkompleksene og de unike septin-underenhetene (kun MW) som kan renses med plasmidene oppført i tabell 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%203.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution at JoVE.com

Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution

In vitro rekonstituering av cytoskeletale proteiner er et viktig verktøy for å forstå de grunnleggende funksjonelle egenskapene til disse proteinene. Denne artikkelen beskriver en protokoll for å rense og vurdere kvaliteten på rekombinante septinkomplekser, som spiller en sentral rolle i celledeling og migrasjon.

Rensing og kvalitetskontroll av rekombinante septinkomplekser for cellefri rekonstituering

Septins are a family of conserved eukaryotic GTP-binding proteins that can form cytoskeletal filaments and higher-order structures from hetero-oligomeric ...

Denne protokollen gjør det mulig å rense septinkomplekser av høy kvalitet, og dette er viktig for å studere de mange rollene til septiner i cellen. Den største fordelen med denne tilnærmingen er syntetisering av en enkel prosedyre for å rense septin av høy kvalitet ved hjelp av Addgene plasmider. Septiner er vanskelige å studere i celler på grunn av deres mange interaksjoner.Svovelrekonstituering hjelper oss med å fjerne denne kompleksiteten ved å studere dem i et enkelt system. Vi anbefaler å gjøre rensing på en enkelt dag for å forhindre nedbrytning. Vår erfaring er at dette vil øke proteinets levetid og kvalitet.For å begynne, vokse den transformerte bakteriekulturen ved 37 grader Celsius i en shakerinkubator til den optiske tettheten ved en bølgelengde på 600 nanometer når to til tre for umerkede septiner, eller 0,6 til 0,8 for msfGFP eller mEGFP-merkede septiner. Etter inkubering, induser proteinuttrykket ved å tilsette IPTG til en endelig konsentrasjon på 0,5 millimolar og inkubere cellene som uttrykker umerkede septin hetero-oligomerer ved 37 grader Celsius i tre timer, eller cellene som uttrykker msfGFP merket hetero-oligomerer ved 17 grader Celsius over natten. Pellet deretter cellene ved 4.000 ganger G i 20 minutter ved fire grader Celsius.Kast supernatanten og oppløs pelleten i 100 ml lysisbuffer for å lyse cellene. Deretter bruker du en spiss sonikator ved 30% amplitude for å sonikere cellen. Klargjør cellelysatet ved sentrifuging ved 20.000 ganger G i 30 minutter ved fire grader Celsius og lagre supernatanten.Eventuelt ta en prøve for denaturering av elektroforese som beskrevet i manuskriptet. For affinitetskromatografi av His-merkede septiner, likevekt en ferdigpakket nikkel sepharose høyytelseskromatografikolonne med alle nødvendige buffere. Legg den avklarte supernatanten ned til kolonnen og start kromatografisystemet.Deretter eluerer septinkompleksene med 50% HisTrap elueringsbuffer ved en strømningshastighet på en milliliter per minutt. For å gi en imidazolkonsentrasjon på 250 millimolar, samle 0, 5 milliliter fraksjoner. Overvåk nå den optiske absorbansen av eluatet ved 280 nanometer med et raskt proteinvæskekromatografisystem og velg fraksjonene som inneholder septinkomplekser.For affinitetskromatografi av Strep-II-merkede proteiner likevekter en ferdigpakket StrepTactin sepharose høyytelseskromatografikolonne med septinbuffer. Last septinholdige fraksjoner gjenvunnet fra nikkelkolonnen med en hastighet på en milliliter per minutt og start kromatografisystemet. Vask deretter det bundne proteinet og eluere septinkompleksene med 100% StrepTrap elueringsbuffer med en strømningshastighet på en milliliter per minutt.For å gi en konsentrasjon på 2, 5 millimolar desthiobiotin, samle 0, 5 milliliter fraksjoner. Velg fraksjonene som inneholder septinkomplekser som indikert av den optiske absorbansen av eluatet ved 280 nanometer overvåket online med et raskt proteinvæskekromatografisystem. Etter fjerning av desthiobiotin ved dialyse aliquot proteinkompleksene i ønsket aliquot størrelse, snap fryse aliquot, og lagre den på minus 80 grader Celsius.For interferometrisk spredningsmikroskopi, vask glassglass nummer 1,5 ved å sonikere dem i en ultralydsrenser i fem minutter hver i vann, isopropanol og igjen i avionisert vann. Tørk to glassglass med en mild strøm av nitrogengass. Plasser deretter en syv mikroliter dråpe 0,01% Poly-L-Lysin-løsning på midten av et av lysbildene og plasser midten av det andre lysbildet på toppen av Poly-L-Lysin-dråpen, orienter de to lysbildene ortogonalt for enkel separasjon.Etter inkubering i 30 sekunder, vask lysbildet ved å senke det ned i et beger som inneholder avionisert vann en gang og påføre en vannstrøm to ganger. Tørk dem med en nitrogengasstrøm, og disse lysbildene kan lagres i rundt seks uker ved romtemperatur under tørre forhold. Før eksperimentet, kutt et stykke to til to, tre av to eller tre med tre pakninger og hold dem på Poly-L-Lysine-behandlet del av et glassglass, unngå glassglasset og pakningene som kommer i kontakt med en skitten overflate ved å plassere lysbildet på et lett viskervev.Trykk nå pakningene med en pipettespiss for å feste dem med den beskyttende plasten som er tilstede på pakningene. Varm deretter septinbufferen til romtemperatur. Tine proteinene i hånden og hold dem på is etterpå.Plasser deretter lysbildet med pakninger på det kommersielle massefotometrisystemet som inneholder 19 mikroliter septinbuffer og fokuser mikroskopet ved hjelp av autofokusalternativet. Fokuser på nytt med de nye innstillingene ved hjelp av autofokusalternativet. Hvis du vil opprette en prosjektmappe, klikker du Fil etterfulgt av Nytt prosjekt, og hvis du vil laste inn en prosjektmappe for lagring av data, klikker du Fil etterfulgt av Last inn prosjekt.Deretter pipette en mikroliter prøve til 19 mikroliter septum buffer slipp. Bland, og mens du blander, unngå å berøre noe for å forhindre bevegelse av lysbildet. Ta deretter opp en 6,000 rammevideo ved å klikke på Record.Analyser videoene ved hjelp av produsentens programvare for å oppnå proteinmassefordelingen. Hvis toppene av forskjellige septin hetero-oligomer størrelser overlapper for mye eller for mange hendelser oppdages, reduserer den endelige septinkonsentrasjonen og måler igjen. Og når nok tellinger av enkeltmolekyler ikke måles, øker septinkonsentrasjonen og måler igjen.For septinanalyse, lag 5X darkSPB og en septinblanding bestående av 100% mørk septin ved seks ganger høyere konsentrasjon enn ønsket sluttkonsentrasjon i septinbuffer og en millimolar Dithiothreitol. Polymeriser deretter septinen ved å blande vann, 20% 5X darkSPB og 16,67% septinblanding, i denne spesifikke rekkefølgen, og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Legg tre til fem mikroliter prøve til et glødutladet elektronmikroskopigitter og inkuber i ett minutt.Vask nå rutenettet to ganger ved å legge til en dråpe darkSPB-buffer og absorbere væsken med et filterpapir. Vask en gang med vann og inkuber i 30 sekunder med 2% uranylacetat. Deretter må du tørke flekken og lufttørke prøven i noen minutter.Se deretter septinbuntene på 120 kilovolt og forstørrelser mellom 5.000X og 60.000X med en defokusering på en til to mikrometer. HisTrap og StrepTrap kromatogram viste at den samlede fraksjonen gikk fra starten av elueringstoppen til absorbansen stabiliserte seg på henholdsvis rundt 250 milliliter og 50 milliliter. Septinbåndene viste lignende intensiteter i denaturerende gelelektroforese, noe som tyder på at septinene er intakte.I innfødt elektroforese ble hovedbåndet tilsvarende de intakte hetero-oligomerene og et mindre bånd tilsvarende trimorer eller tetramerer observert. Den tilsynelatende molekylvekten til msfGFP-merkede komplekser kan ikke skilles fra den for de umerkede kompleksene. Massefotometri oppdaget intakte oktamier og heksamerer av septiner.En ytterligere topp på 241 kilodalton indikerte tilstedeværelsen av to peanøttproteiner, DSep1 og mEGFP-DSep2. Transmisjonselektronmikroskopibilder av septinkomplekser viste stenger av heksamører og oktamerer. MsfGFP-taggene er synlige som uklare tettheter i de to endene i septin 2 msfGFP human septin octamers_9i1.Små klynger av proteiner kan observeres i det grunne TIRF-feltet. Konfokalmikroskopien avslørte store klynger av flytende filamentøse strukturer. Transmisjonselektronmikroskopi viste små og store septinbunter tilsvarende klyngene observert ved total intern refleksjonsfluorescensmikroskopi og konfokalmikroskopi.Vi anbefaler å jobbe på is til enhver tid under rensingene og å tilsette ferske reagenser som vi spesifiserer i protokollen. Vi er interessert i interaksjoner av septiner i sammenheng med cytokinese. Vi rekonstituerte septin sammen med moderne membraner aktin og mikrotubuli for å studere dem med mikroskopi og flere biofysiske analyser.Vi bruker de rensede septinene til å studere hvordan septiner interagerer med aktinfilamenter, mikrotubuli og lipider. Og vi bruker også de rensede septinene til å bygge syntetiske celler der septinene letter celledeling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Rensing av protein komplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontal gelelektroforese for forbedret deteksjon av protein-RNA-komplekser

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: trinns affinitet rensing for parallell analyse av Protein-Protein og Protein-metabolitten komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Rekonstituering i cellen syklus svingninger i mikroemulsjoner Cell-free Xenopus egg ekstrakter

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rensing av Chloroplast Translocon Protein komplekser hjelp av trykk-koden

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal struktur av N-terminal domenet av Ryanodine reseptoren fra Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Enkeltsteg rensing av Macromolecular komplekser ved hjelp av RNA knyttet til Biotin og et foto-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Biosyntesen av en Flavonol fra en Flavanone ved å etablere en One-Pot Bienzymatic Cascade

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Vaskemiddel-assistert rekonstituering av rekombinant Drosophila Atlastin til liposomer for lipid-miksing analyser

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...