1.6K Views
•
11:50 min
•
June 23rd, 2022
DOI :
June 23rd, 2022
•0:05
Introduction
0:47
Purification of Septin Hetero-Oligomers
4:29
Quality Control of Purity and Integrity of the Septin Hetero-Oligomer
7:34
Septin Functional Quality Control via Polymerization Analysis
8:57
Results: Analysis of Purified Septin Quality
11:01
Conclusion
Transcript
Detta protokoll gör det möjligt att rena högkvalitativa septinkomplex, och detta är viktigt för att studera septinernas många roller i cellen. Den största fördelen med detta tillvägagångssätt är syntetiseringen av ett enkelt förfarande för att rena högkvalitativ septin med hjälp av Addgene-plasmider. Septiner är svåra att studera i celler på grund av deras många interaktioner.
Svavelberedning hjälper oss att avlägsna denna komplexitet genom att studera dem i ett enkelt system. Vi rekommenderar att du gör rening på en enda dag för att förhindra nedbrytning. Enligt vår erfarenhet kommer detta att öka proteinets livslängd och kvalitet.
Till att börja med odla den transformerade bakteriekulturen vid 37 grader Celsius i en shakerinkubator tills den optiska densiteten vid en våglängd på 600 nanometer når två till tre för omärkta septiner, eller 0,6 till 0,8 för msfGFP eller mEGFP-märkta septiner. Efter inkubation, inducera proteinuttrycket genom att tillsätta IPTG till en slutlig koncentration av 0,5 millimolar och inkubera cellerna som uttrycker omärkta septin hetero-oligomerer vid 37 grader Celsius i tre timmar, eller cellerna som uttrycker msfGFP-märkta hetero-oligomerer vid 17 grader Celsius över natten. Pellet sedan cellerna vid 4 000 gånger G i 20 minuter vid fyra grader Celsius.
Kassera supernatanten och lös upp pelleten i 100 ml lysbuffert för att lysera cellerna. Använd sedan en tips sonicator vid 30% amplitud för att sonikera cellen. Klargör celllysatet genom att centrifugera vid 20 000 gånger G i 30 minuter vid fyra grader Celsius och spara supernatanten.
Alternativt, ta ett prov för denaturering av elektrofores enligt beskrivningen i manuskriptet. För affinitetskromatografi av His-märkta septiner, balansera en färdigpackad nickelsefatos högpresterande kromatografikolonn med alla nödvändiga buffertar. Ladda den klarade supernatanten ner till kolonnen och starta kromatografisystemet.
Eluera sedan septinkomplexen med 50% HisTrap-elueringsbuffert med en flödeshastighet på en milliliter per minut. För att ge en imidazolkoncentration av 250 millimolar, samla 0,5 ml fraktioner. Övervaka nu eluatets optiska absorbans vid 280 nanometer med ett snabbt proteinvätskekromatografisystem och välj fraktionerna som innehåller septinkomplex.
För affinitetskromatografi av Strep-II-märkta proteiner jämställer en färdigpackad StrepTactin sefasos högpresterande kromatografikolonn med septinbuffert. Ladda septinhaltiga fraktioner som återvinns från nickelkolonnen med en hastighet av en milliliter per minut och starta kromatografisystemet. Tvätta sedan det bundna proteinet och eluera septinkomplexen med 100% StrepTrap-elueringsbuffert med en flödeshastighet på en milliliter per minut.
För att ge en koncentration av 2,5 millimolar destiobiotin, samla 0,5 ml fraktioner. Välj fraktionerna som innehåller septinkomplex som indikeras av eluatets optiska absorbans vid 280 nanometer övervakad online med ett snabbt proteinvätskekromatografisystem. Efter att ha avlägsnat desthiobiotin genom dialys alikvoterar proteinkomplexen till önskad alikvotstorlek, snäppfrys alikvoten och förvara den vid minus 80 grader Celsius.
För interferometrisk spridningsmikroskopi, tvätta glasskivor nummer 1.5 genom att sonikera dem i en ultraljudsrengörare i fem minuter vardera i vatten, isopropanol och igen i avjoniserat vatten. Torka två glasskivor med en mild ström av kvävgas. Placera sedan en sju mikroliter droppe av 0,01% Poly-L-lysinlösning på mitten av en av bilderna och placera mitten av den andra bilden ovanpå Poly-L-lysindroppen och orientera de två bilderna ortogonalt för enkel separation.
Efter inkubation i 30 sekunder, tvätta bilden genom att nedsänka i en bägare som innehåller avjoniserat vatten en gång och applicera direkt en ström av vatten två gånger. Torka dem med ett kvävgasflöde och dessa glasrutschbanor kan förvaras i cirka sex veckor vid rumstemperatur under torra förhållanden. Före experimentet, skär en bit av två och två, tre av två eller tre av tre packningar och stick dem på den poly-L-lysinbehandlade delen av en glasskiva, så att glasskivan och packningarna kommer i kontakt med någon smutsig yta genom att placera bilden på en lätt torkarvävnad.
Tryck nu på packningarna med en pipettspets för att fästa dem med den skyddande plasten som finns på packningarna. Värm sedan septinbufferten till rumstemperatur. Tina proteinerna i handen och håll dem på is efteråt.
Placera sedan bilden med packningar på det kommersiella massfotometrisystemet som innehåller 19 mikroliter septinbuffert och fokusera mikroskopet med autofokusalternativet. Fokusera om med de nya inställningarna med autofokusalternativet. Om du vill skapa en projektmapp klickar du på Arkiv följt av Nytt projekt och läser in en projektmapp för lagring av data klickar du på Arkiv följt av Läs in projekt.
Pipettera sedan en mikroliter prov till 19 mikroliter septumbuffertdroppe. Blanda, och under blandning, undvik att röra vid något för att förhindra glidbanans rörelse. Spela sedan in en 6 000 bildvideo genom att klicka på Spela in.
Analysera videorna med tillverkarens programvara för att få proteinmassfördelningen. Om topparna i olika septin hetero-oligomerstorlekar överlappar för mycket eller för många händelser upptäcks, minska den slutliga septinkoncentrationen och mät igen. Och när tillräckligt många enstaka molekyler inte mäts, öka septinkoncentrationen och mät igen.
För septinanalys, förbered 5X darkSPB och en septinblandning bestående av 100% mörk septin vid sex gånger högre koncentration än den önskade slutliga koncentrationen i septinbuffert och en millimolär Dithiothreitol. Polymerisera sedan septinet genom att blanda vatten, 20% 5X darkSPB och 16,67% septinblandning, i denna specifika ordning, och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt tre till fem mikroliter prov till ett glödande urladdat elektronmikroskopinät och inkubera i en minut.
Tvätta nu gallret två gånger genom att tillsätta en droppe darkSPB-buffert och absorbera vätskan med ett filterpapper. Tvätta en gång med vatten och inkubera i 30 sekunder med 2% uranylacetat. Torka sedan fläcken och lufttorka provet i några minuter.
Föreställ sedan septinbuntarna vid 120 kilovolt och förstoringar mellan 5 000X och 60 000X med en defokus på en till två mikrometer. HisTrap- och StrepTrap-kromatogrammet visade att den poolade fraktionen gick från början av elueringstoppen tills absorbansen stabiliserades vid cirka 250 ml respektive 50 milliliter. Septinbanden visade liknande intensiteter i denaturerande gelelektrofores, vilket tyder på att septinerna är intakta.
I inhemsk elektrofores observerades huvudbandet som motsvarar de intakta hetero-oligomererna och ett mindre band som motsvarar trimorer eller tetramerer. Den skenbara molekylvikten för msfGFP-märkta komplex går inte att skilja från den för de otaggade komplexen. Massfotometri detekterade intakta oktamerer och hexamerer av septiner.
En ytterligare topp vid 241 kilodalton indikerade närvaron av två jordnötsproteiner, DSep1 och mEGFP-DSep2. Transmissionselektronmikroskopibilder av septinkomplex visade stavar av hexamerer och oktamerer. msfGFP-taggarna är synliga som suddiga densiteter i de två ändarna i septin 2 msfGFP human septin octamers_9i1.
Små kluster av proteiner kan observeras i det grunda TIRF-fältet. Den konfokalmikroskopi avslöjade stora kluster av flytande trådformiga strukturer. Transmissionselektronmikroskopi visade små och stora septinbuntar som motsvarade de kluster som observerades med total intern reflektionsfluorescensmikroskopi och konfokalmikroskopi.
Vi rekommenderar att du arbetar på is hela tiden under reningarna och att lägga till färska reagenser som vi anger i protokollet. Vi är intresserade av interaktioner mellan septiner i samband med cytokinese. Vi rekonstituerade septin tillsammans med moderna membran aktin och mikrotubuli för att studera dem med mikroskopi och flera biofysiska analyser.
Vi använder de renade septinerna för att studera hur septiner interagerar med aktinfilament, mikrotubuli och lipider. Och vi använder också de renade septinerna för att bygga syntetiska celler där septinerna underlättar celldelning.
In vitro-rekonstitution av cytoskelettproteiner är ett viktigt verktyg för att förstå de grundläggande funktionella egenskaperna hos dessa proteiner. Denna uppsats beskriver ett protokoll för att rena och bedöma kvaliteten på rekombinanta septinkomplex, som spelar en central roll i celldelning och migration.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved