Name: purification and quality control of recombinant septin complexes for cell-free reconstitution
Uploaded: 2022-06-23T13:00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution at JoVE.com

Cecilia de Agrela Pinto, Tomás de Garay ve Katharina Häußermann'a kütle fotometrisi (iSCAT) deneylerindeki yardımları için teşekkür ederiz; Arjen Jakobi ve Wiel Evers, TEM'e yaptıkları yardımlar için; Lucia Baldauf, TIRF ile olan yardımlarından dolayı; Pascal Verdier-Pinard, doğal elektroforez ile ilgili tavsiyeleri için; Agata Szuba ve Marjolein Vinkenoog, Drosophila septin saflaştırma çabalarının ve Hücre ve Doku Görüntüleme'nin (PICT-IBiSA) kurulmasındaki yardımlarından dolayı, Fransız Ulusal Araştırma Altyapısı Fransa-BioImaging (ANR10-INBS-04) üyesi Institut Curie. Bu araştırma, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nden (NWO / OCW) 'BaSyC-Sentetik Bir Hücre İnşa Etmek' Yerçekimi hibesi (024.003.019) ve Agence Nationale pour la Recherche'den (ANR, ANR-17-CE13-0014: "SEPTIMORF"; ANR-13-JSV8-0002-01: "SEPTIME"; ve ANR-20-CE11-0014-01: "SEPTSCORT").

Yazarlar rakip veya finansal çıkarlar beyan etmezler.

Burada açıklanan yöntem, önceden oluşturulmuş septin hetero-oligomerlerinin sağlam saflaştırılmasına ve kalite kontrolüne izin verir. Yöntemin doğru uygulanması için göz önünde bulundurulması gereken temel konulardan bazıları şunlardır. Kromatografik ayırmalardaki elüsyon adımları sırasında, septin komplekslerinin seyreltilmesini en aza indirmek için önerilen (veya daha düşük) akış hızını kullanmak önemlidir. Ek olarak, son konsantrasyon adımı sırasında proteinin geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için, yoğunlaştırıcı kolon, çözelti filtreye karşı itilmeyecek şekilde yönlendirilir (yalnızca bir tarafta bir filtre olduğunda). Çözelti doğrudan filtreye giderse, protein ona çok daha fazla yapışır ve nihai verimi önemli ölçüde azaltır. Konsantrasyon adımının her zaman gerekli olmadığını düşünmek de önemlidir. Fraksiyonları sadece kromatogramdaki tepe noktasının etrafındaki dar bir aralıktan toplamak, çoğu sulandırma uygulaması (genellikle 10-300 nM arasında çalışan) için genellikle yeterince yüksek bir stok konsantrasyonu (>3.000 nM) verir. Son olarak, floresan mikroskobu ile septin komplekslerinin işlevselliğinin kalite kontrolü için, septin kompleksleri cama hevesle yapıştığından, mikroskopi slaytlarının yüzeyini doğru şekilde pasifleştirmek önemlidir. Cam slaytların pasivasyonu, PLL-PEG fonksiyonelleştirmesi yoluyla veya nötr (% 100 DOPC) destekli lipit çift katmanlı11,32 oluşumu ile yapılabilir.
İlk olarak Iv ve ark.10'da açıklanan orijinal saflaştırma protokolü ile karşılaştırıldığında, tampon bileşimlerinde bir değişiklik vardır (Tablo 2). MgCl 2 konsantrasyonu 5 mM'den2 mM'ye düşürüldü ve Tris-HCl'nin konsantrasyonu ve pH'ı sırasıyla 50 mM'den 20 mM'ye ve 8.0'dan 7.4'e düşürüldü. Bu değişiklikler, tampon koşullarının, insan septinlerinin lipid çift katmanları, aktin filamentleri ve mikrotübüller 10,11,32 ile etkileşimleri üzerine yapılan çalışmalarla uyumlu hale getirilmesi için yapılmıştır. Bunun nedeni, yazarların, F-tamponunda ATP'nin varlığının yanı sıra, bileşimi darkSPB'ninkiyle aynı olan F-tamponunda desteklenen lipit çift katmanları ve polimerize aktin oluşturmasıdır. Tampon değişimi, orijinal tamponlara kıyasla saflaştırılmış septinlerin kalitesinde veya ömründe herhangi bir değişiklik yaratmadı.
Bu saflaştırma yönteminin hala birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, farklı saflaştırma girişimleri, saflaştırılmış septin komplekslerinin demet oluşum kabiliyeti ile kontrol edildiği gibi, verim (0.5-1 mL 2-5 μM septin kompleksleri) ve fonksiyonel kalite bakımından değişebilir. Bu nedenle, bu makalede açıklanan kalite kontrollerini tutarlı bir şekilde yapmak çok önemlidir. İfade sürelerini ve bakteri kültürünün optik yoğunluğunu çok iyi kontrol etmek, verimdeki farkı azaltmaya yardımcı olabilir. İkincisi, bu arıtma boru hattı trimerler ve heksamerler veya tetramerler ve oktamerler arasında ayrım yapamaz (Şekil 1B). Bununla birlikte, kalite kontrol deneyleri, septin komplekslerinin çoğunun uzun oligomer formunda olduğunu kanıtlamak için kullanılabilir. Daha dar bir oligomer boyut dağılımının gerekli olması durumunda, adım 1.6 arasına boyut dışlama kromatografisi eklenebilir. ve adım 1.7. arıtma protokolünün. Bununla birlikte, bu isteğe bağlı adım, verimi önemli ölçüde azaltır ve kesinlikle gerekli olmadıkça önerilmez. Sonuncu, daha temel bir sınırlama, E. coli'nin rekombinant septin kompleksleri için bir ekspresyon sistemi olarak kullanılmasından kaynaklanmaktadır. Doğal olarak, bu sistem fosforilasyon, asetilasyon ve sumoilasyon 6,51,52,53 gibi hayvan hücrelerinde bildirilen post-translasyonel modifikasyonlara (PTM'ler) izin vermez. Bu posttranslasyonel modifikasyonlar, böcek veya insan hücrelerinde benzer bir saflaştırma stratejisi uygulanarak eklenebilir. Dahası, bu makale sadece septinlerin kendi başlarına yeniden yapılandırılmasını tartışmıştır, ancak hücrelerde yapılan çalışmalar, Borg ailesi 54,55 ve anilin 24,25,56'dan proteinler gibi düzenleyici proteinlerin, septinlerin montajı ve işlevleri üzerinde önemli ancak az anlaşılmış etkilere sahip olabileceğini ve bu nedenle in vitro olarak dahil edilmesinin önemli olduğunu göstermektedir. Çalışmaları. Borg proteinlerinin ve anilinin saflaştırılması için protokoller54,57 olarak bildirilmiştir.
Burada bildirilen septin saflaştırma protokolü, septinleri oligomer formlarında doğru alt birim stokiyometri ile saflaştırmak için standartlaştırılmış bir yol sunarak, tek septin alt birimlerine dayanan daha önceki birçok in vitro çalışmaya göre önemli bir ilerleme sunmaktadır. Belirli bağlamlardaki bazı septinler tek bir alt ünite2 olarak işlev görse de, mevcut literatür organı, hayvan hücrelerinde septinlerin çoğunlukla 9,58 komplekslerinde işlev gördüğünü kuvvetle önermektedir. Bu nedenle, bu makalede ve diğerlerinde 10,11,18,32,35,36,37 olarak tanımlananlar gibi önceden oluşturulmuş hetero-oligomerlerin kullanımı, septinlerin yapısal ve biyofiziksel özelliklerini in vitro yoluyla incelemek için büyük önem taşımaktadır. hücredeki işlevlerini incelemek için yeniden yapılanma. Ayrıca, septinler, membran ve sitoiskelet de dahil olmak üzere birçok etkileşim ortağına sahip kendi kendine birleşen proteinlerdir, bu da onları aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji59,60,61 ve eğrilik42,62,63 gibi membran biyofiziksel özelliklerinde protein kaynaklı değişikliklerin incelenmesi için büyük ilgi uyandırır.

Hücre iskeleti klasik olarak aktin filamentleri, mikrotübüller ve ara filamentlerden oluşan üç bileşenli bir sistem olarak tanımlanmıştır 1, ancak son zamanlarda septinler sitoiskelet1'in dördüncü bir bileşeni olarak kabul edilmiştir. Septinler, ökaryotlar2'de korunan GTP bağlayıcı proteinlerin bir ailesidir. Septinler, hücre bölünmesi3, hücre-hücre adezyonu4, hücre motilitesi5, morfogenez6, hücresel enfeksiyon7 ve hücre polaritesinin kurulması ve sürdürülmesi8 gibi birçok hücresel fonksiyonda rol oynar. Önemli işlevlerine rağmen, septinlerin bu tür süreçlere nasıl dahil oldukları tam olarak anlaşılamamıştır.
Septin protein ailesi, protein dizisi benzerliği2'ye bağlı olarak birkaç alt gruba (sınıflandırmaya bağlı olarak dört veya yedi) ayrılır. Farklı alt ailelerin üyeleri, filamentlerin yapı taşları olan ve sırayla demetler, halkalar ve örgüler 1,9,10,11,12 gibi daha yüksek dereceli yapılara monte edilen palindromik hetero-oligomerik kompleksler oluşturabilir. Daha fazla moleküler karmaşıklık, farklı ekleme varyantlarının varlığından kaynaklanmaktadır; bir örnek, farklı ekleme varyantlarının spesifik işlevleri için kanıtların bulunduğu insan SEPT9'dur 13,14,15. Ek olarak, hetero-oligomerlerin uzunluğu türlere ve hücre tipine bağlıdır. Örneğin, Caenorhabditis elegans septinleri tetramerler 16'yı, Drosophila melanogaster septinleri hexamers17'yi (Şekil 1A), Saccharomyces cerevisiae septinleri oktamerler18'i ve insan septinleri hem hexamers hem de octamers19'u oluşturur (Şekil 1A). Septin izoformlarının, ekleme varyantlarının ve aynı alt aileden translasyonel olarak modifiye edilmiş septinlerin komplekste birbirlerinin yerine geçme kabiliyeti ve farklı büyüklükteki hetero-oligomerlerin (birlikte) varlığı, farklı hetero-oligomerik komplekslerin hücresel fonksiyonlarını tanımlamayı zorlaştırmıştır12.
Septinlerin bir başka ilginç yeteneği, hücredeki birçok bağlayıcı ortakla etkileşime girme yetenekleridir. Septinler plazma zarını ve membranöz organelleri interfaz ve hücre bölünmesi sırasında bağlar20,21,22. Bölünen hücrelerde, septinler sitokinez 26,27 sırasında anilin23,24,25 ve aktin ve miyozin ile işbirliği yapar. Sitokinezinin geç evrelerinde, septinler orta vücut absiszyonu için taşıma (ESCRT) sistemi için gerekli endozomal sıralama komplekslerini düzenlemektedir28. Ek olarak, fazlar arası hücrelerdeki hücrelerin aktin korteksi ve aktin stres lifleri üzerinde bulunan septin kanıtı da vardır 29,30,31. Spesifik hücre tiplerinde, septinler ayrıca mikrotübül sitoiskeletini bağlar ve düzenler32,33.
Tüm bu özellikler, septinleri çalışmak için çok ilginç bir protein sistemi haline getirir, aynı zamanda zorlu bir sistemdir. Çok sayıda septin alt biriminin (insanlarda ekleme varyantlarını saymadan 13 gen2) aynı alt aileden septin alt birimlerinin birbirlerinin yerine geçme ve farklı büyüklükteki hetero-oligomerler oluşturma potansiyeli ile kombinasyonu, genetik manipülasyon yoluyla belirli bir septinin hücresel fonksiyonu hakkında bir sonuç çıkarmayı zorlaştırmaktadır. Ayrıca, septinlerin çoklu etkileşimleri, sitoiskelet veya membran bileşenlerine yönelik ilaçlar34 gibi yaygın araştırma araçlarının etkilerini yorumlamayı zor bir görev haline getirmektedir.
Bu durumun üstesinden gelmenin bir yolu, hücrelerdeki araştırmayı septinlerin in vitro (hücresiz) yeniden sulandırılmasıyla tamamlamaktır. In vitro sulandırma, belirli bir alt birim bileşimi ve uzunluğu18,35,36,37 olan tek tip septin hetero-oligomerlerin izolasyonuna izin verir. Bu kompleks daha sonra,septinlerin 38,39,40 septinlerinin temel yapısal ve fizikokimyasal özelliklerini keşfetmek için tek başına veya model biyomembranlar 11,41,42, aktin filamentleri 10,27 veya mikrotübüller 32,36 gibi istenen ortaklarla kombinasyon halinde kontrollü bir ortamda incelenebilir. Etkileşim.
Bu nedenle, farklı septin komplekslerini verimli bir şekilde saflaştırmak için güvenilir bir yöntem, septin araştırması için hayati öneme sahiptir. Bununla birlikte, aynı protokolü kullanarak bile, farklı saflaştırmalar proteinlere farklı aktivite / işlevsellik ve hatta bütünlük sağlayabilir. Enzimler gibi ticari olarak temin edilebilen proteinler için, işlevsellik ve enzimatik aktivite dikkatlice doğrulanmıştır43. Sitoiskelet veya septinler gibi yapısal proteinler için dikkatli bir kalite kontrolü uygulamak zor olabilir, ancak laboratuvarlar arasında deneylerin karşılaştırılabilir hale getirilmesi önemlidir.
Bu yazıda, Escherichia coli hücrelerinde mono- veya bi-sistronik yapılar içeren iki vektörün eşzamanlı ekspresyonuna dayanarak yüksek kaliteli rekombinant septinleri hetero-oligomerik formlarında saflaştırmak için sağlam bir yöntem açıklanmaktadır (Tablo 1). Yöntem, hem6 etiketli septin hem de Strep-II etiketli septin içeren septin hetero-oligomerlerini yakalamak için iki aşamalı bir afinite kromatografisi yaklaşımından oluşur (Şekil 1B, C). İlk olarak Iv ve ark.10'da tanımlanan bu protokol, Drosophila septin hexamers 11,27,35, human septin hexamers10 ve farklı doğal (izoform 1, 3 ve 5)10,32 veya mutasyona uğramış SEPT9 izoformları 32 içeren birkaç insan septin oktamerini saflaştırmak için kullanılmıştır. . Ayrıca, saflaştırılmış septinlerin kalitesini değerlendirmek için bir dizi tekniğin tanımı verilmiştir. İlk olarak, septin alt birimlerinin bütünlüğü ve doğru stokiyometrisi, denatüre elektroforez ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak kontrol edilir. Daha sonra, doğru moleküler kütleye sahip hetero-oligomerlerin varlığı ve karmaşık instabilitenin göstergesi olan monomerlerin veya daha küçük oligomerlerin varlığı, interferometrik saçılma mikroskobu (iSCAT) yoluyla doğal elektroforez ve kütle fotometrisi ile incelenir. Son olarak, son adım, floresan mikroskobu ve TEM kullanılarak septinlerin polimerizasyon aktivitesinin değerlendirilmesinden oluşur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2.jpg"> Şekil 1: Saflaştırma stratejisi . (A) İnsan (solda) ve Drosophila (sağda) hücrelerinde bulunan septin hetero-oligomerlerinin şemaları. Sayılar belirtilen gruplardan septin alt birimlerini, P ise Fıstık'ı gösterir. İnsan SEPT9, izoformlarından herhangi biri olabilir. Septin alt birimleri asimetrik bir şekle sahiptir ve insan heksamerinin üstünde sırasıyla NC ve G ile gösterildiği gibi, NC: NC ve G: G arayüzü olmak üzere iki ayrı arayüzle uzunlamasına ilişkilidir. (B,C) İki aşamalı kromatografi stratejisinin şematik gösterimi, (B) insan septin heksamserleri ve (C) oktamerler için gösterilmiştir. H his-etiketlerini gösterirken, S Strep-II-etiketlerini gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>488nm laser combiner iLAS2</td>
			<td>Gataca</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488nm Sapphire laser lines</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4k X 4k F416 CMOS camera</td>
			<td>TVIPS</td>
			<td></td>
			<td>For JEM-1400plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x sample buffer nativePAGE</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (TROLOX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238813</td>
			<td>To prevent blinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 M1</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>1680311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Type-B, 300 mesh EM grid</td>
			<td>Ted pella</td>
			<td>01813-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Type-B, 300 mesh EM grid</td>
			<td>Electron micoscopy sciences</td>
			<td>CF300-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass #1.5H</td>
			<td>Thorslabs</td>
			<td>CG15KH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1-M1 confocal unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desthiobiotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1411-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibtor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>481761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP, 5 mL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>29-0588-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iLAS2 azimuthal TIRF illumination system&#160;</td>
			<td>Gataca</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1202-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue Protein Gel Stain</td>
			<td>Westburg Life Sciences</td>
			<td>EP ab119211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>10849040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 888 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EM-CCD&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400plus</td>
			<td>JOEL</td>
			<td></td>
			<td>TEM microscope TUDelft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kappa-cassein&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-6X1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971-10G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746452-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylecllulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8074844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ system (Integral 10)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td></td>
			<td>I-water dispenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini protean TGX gels</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativeMark unstained protein standard</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC0725</td>
			<td>For iSCAT and Native gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE 4-16% GELS</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN1002BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NativePAGE Running Buffer kit</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>BN2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti2-E&#160;</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>TIRF microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nr. 1 Menzel coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo &#215;100/1.45 NA oil immersion objective</td>
			<td>Nikon instruments</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(L-lysine)-graft-biotinylated PEG (PLL-PEG)</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>CHF560.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution 0.01%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td>For iSCAT glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for native gels</td>
			<td>CONSORT</td>
			<td>S/N 71638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWERPAC UNIVERSAL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>042BR31206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8279-25UN</td>
			<td>oxygen scavenger - enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protocatechuic acid (PCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03930590-50MG</td>
			<td>oxygen scavenger - reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q500 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q500-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quemesa camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For Tecnai Spirit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refeyn OneMP</td>
			<td>Refeyn</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample buffer, laemmli 2x concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3401-10vl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon gaskets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL103250-10EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes 30k MWCO 3mL</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>66381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1441-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap HP, 1 mL</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>28-9075-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit microscope</td>
			<td>Thermo Scientific, FEI</td>
			<td></td>
			<td>TEM microscope Institute Curie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0918-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris/Glyine/SDS buffer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5941-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX2800H-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6, 30,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0622</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and quality control of recombinant septin complexes for cell-free reconstitution

Septinler, hetero-oligomerik komplekslerden sitoiskelet filamentleri ve yüksek dereceli yapılar oluşturabilen korunmuş ökaryotik GTP bağlayıcı proteinlerin bir ailesidir. Göç ve hücre bölünmesi gibi önemli hücresel fonksiyonlara katılmak için diğer sitoiskelet bileşenleri ve hücre zarı ile etkileşime girerler. Septinlerin birçok etkileşiminin karmaşıklığı, çok sayıda septin geni (insanlarda 13) ve septinlerin farklı alt birim bileşimlerine sahip hetero-oligomerik kompleksler oluşturma kabiliyeti nedeniyle, hücresiz sulandırma, septin biyolojisinin temellerini anlamak için hayati bir stratejidir. Bu yazıda ilk olarak rekombinant septinlerin hetero-oligomerik formlarında iki aşamalı bir afinite kromatografisi yaklaşımı kullanılarak saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Daha sonra, septin komplekslerinin saflığını ve bütünlüğünü kontrol etmek için kullanılan kalite kontrol süreci detaylandırılmıştır. Bu işlem, doğal ve denatüre edici jel elektroforezi, negatif leke elektron mikroskobu ve interferometrik saçılma mikroskobunu birleştirir. Son olarak, negatif leke elektron mikroskobu ve floresan mikroskobu kullanılarak septin komplekslerinin polimerizasyon kabiliyetini kontrol etme işleminin bir açıklaması verilmiştir. Bu, Drosophila septin heksameerlerinin yanı sıra farklı septin_9 izoformlarını içeren yüksek kaliteli insan septin heksamerleri ve oktamerleri üretmenin mümkün olduğunu göstermektedir.

Protokolde belirtildiği gibi, iki septin eksprese eden plazmid ile birlikte dönüştürülmüş 5 L E. coli hücresi büyütüldü ve septinlerin ekspresyonu IPTG eklenerek indüklendi. 3 saat sonra, hücreler santrifüjleme ile toplandı, lizis tamponunda yeniden askıya alındı ve sonikasyon ile lize edildi. Lisat daha sonra santrifüjleme ile netleştirildi ve berraklaştırılmış çözelti bir HisTrap sütununa uygulandı (Şekil 2A). İlk saflaştırmadan sonra, septin içeren fraksiyonlar bir araya getirildi ve bir StrepTrap sütununa uygulandı (Şekil 2B). Bu tipik olarak yaklaşık 3-5 mL ~ 1 μM septin kompleksi verir. Septin içeren fraksiyonları bir araya getirmeden önce, septin alt birimlerinin bütünlüğünü ve kompleksi oluşturan farklı septin alt birimleri arasındaki equimolar stokiyometrik oranı kontrol etmek için denatüre jel elektroforezi kullanılabilir. (Şekil 3A). Jel, septin alt birimlerinin moleküler ağırlıklarına (Tablo 3) karşılık gelen benzer şekilde yoğun bantlar gösteriyorsa, protokole devam edilebilir. Değilse, protokolü yeniden başlatmanız önerilir. SEPT9_i1 sahip insan septin oktameri için gösterilen örnekte, Şekil 3A , benzer yoğunluklara sahip SEPT9_i1, SEPT6, SEPT7 ve SEPT2'ye (yukarıdan aşağıya sırayla) karşılık gelen bantları açıkça göstermektedir; normalleştirilmiş yoğunluğun %99'luk güven aralığı 2 Eylül için 0,048 ± 1,128, 6 Eylül için 1,092 ± 0,034, 7 Eylül için 1,108 ± 0,040 ve 9 Eylül için 0,029 ± 1,067 idi. SEPT2 msfGFP ile etiketlenirse, SEPT9_i1 çok altına doğru kayacaktır. Kullanılan elektroforez sistemine ve SEPT7 için C-terminal TEV-Strep etiketinin varlığına bağlı olarak (etiketsiz SEPT7'den daha yavaş göç etmesini sağlar), SEPT7 ve SEPT6 bantları bazen karşılaştırılabilir moleküler ağırlıkları nedeniyle birleşir. Bir sonraki adım, fraksiyonları bir araya getirmek ve DTT ile septin tamponuna karşı çevirmektir. Diyalizden sonra, konsantrasyon çok düşükse (<2 μM) veya deneyler için daha yüksek bir konsantrasyona ihtiyaç duyulursa, protokolde açıklandığı gibi bir konsantrasyon adımı dahil edilebilir. 1 μM'nin altındaki konsantrasyonlar genellikle septinlerin kötü fonksiyonel kalitesini gösterir. 3.5 μM ile 7 μM arasındaki son septin kompleks konsantrasyonu, çoğu in vitro tahlil için iyi çalışır. Bu konsantrasyonlar genellikle konsantrasyondan sonraki hacim 0.5-1 mL'ye ulaştığında elde edilir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig02.jpg"> Şekil 2: Karanlık insan septinin saflaştırılmasına karşılık gelen örnek kromatogramlar octamers_9i1 . (A) HisTrap kolon kromatogramı. Septin elüsyon zirvesinden sonra, muhtemelen tampondaki imidazolün varlığından dolayı absorbans sıfıra geri dönmez. Havuzlanmış fraksiyon, elüsyon zirvesinin başlangıcından absorbans yaklaşık 250 mL'de stabilize olana kadar gitti. (B) StrepTrap sütun kromatogramı. Havuzlanmış fraksiyon, elüsyon zirvesinin başlangıcından absorbans 50 mL'de yaklaşık 0'a geri dönene kadar gitti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Kalite kontrolüne devam etmek için, protokolde açıklandığı gibi doğal elektroforez uygulandı (Şekil 3B). Jellerde, bozulmamış hetero-oligomerlere karşılık gelen büyük bir bant ve genellikle dimerlere karşılık gelen küçük bir bant gözlenebilir. İnsan heksamerleri 242 kDa marker bandının biraz üzerinde bulunurken, oktamerler 480 kDa bandının üzerinde, hesaplanan moleküler kütlelerinin üzerinde bulunur. Bu bantların yeri, ökaryotik hücre ekstraktlarının batı leke analizi ile kontrol edildi32. msfGFP ile etiketleme, her SEPT2'yi bir msfGFP proteini ile eşleştirir. Bu, septin komplekslerinin moleküler ağırlığında 53.4 kDa'lık (26.7 kDa / msGFP molekülü) bir artışa neden olur. Bununla birlikte, doğal elektroforez jelinde, msfGFP etiketli komplekslerin görünür moleküler ağırlığı, etiketlenmemiş komplekslerinkinden ayırt edilemez.
Septin komplekslerinin sağlam olup olmadığını test etmek için tamamlayıcı bir teknik, iSCAT mikroskobu ile kütle fotometrisidir. iSCAT, referans ışığına müdahale edilerek güçlendirilmiş bir cam slayta inen moleküllerin ışık saçılımını, tipik olarak lazerin cam slaytın altındaki yansımasını izler. Daha sonra, parçacıklara kontrast vermek için bir arka plan çıkarma yaklaşımı kullanılır. Bu düzeltme nedeniyle, sinyal parçacıkların camın üzerine inmesine veya ondan uzaklaşmasına bağlı olarak pozitif ve negatif değerler gösterir49. Tespit edilen sinyal, proteinlerin moleküler ağırlığı50 ile doğru orantılıdır. Bu nedenle, kütle standardına sahip bir sinyalden kütleye kalibrasyon, numune proteinlerinin kütlesini belirleyebilir. Şekil 3C, SEPT9_i1 içeren insan septin oktamerlerinin bir örneğini göstermektedir. Tespit edilen tek parçacıkların çoğu (~% 50), SEPT9_i1 (423 kDa) içeren tam oktamerler için beklenen moleküler ağırlığa sahiptir (Şekil 3C). Kütleleri 150-300 kDa arasında olan parçacıklar da vardır, ancak diğer septin türlerinin düşük miktarda olası varlığını gösteren net bir tepe noktası gözlenmez. Benzer şekilde, mEGFP etiketli Drosophila heksamerleri için tespit edilen tek parçacıkların çoğu, bozulmamış heksamerler (361 kDa) için beklenen moleküler bir ağırlığa sahiptir (Şekil 3D). 241 kDa'daki ek bir berrak zirve, iki fıstık proteini, bir DSep1 ve bir mEGFP-DSep2 içeren kararlı tetramerlerin varlığını gösterir. Son olarak, hem insan hem de sinek septin kompleksleri, muhtemelen DTT izi veya toplanan başka bir küçük molekül tarafından güçlendirilmiş, arsa45'in pozitif tarafında bir zirve gösteren monomerlerin ve dimerlerin bir karışımı olabilecek 80 kDa civarında bir zirve göstermektedir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2.jpg"> Şekil 3: Oligomer kalite kontrolünün sonuçlarına örnekler . (A) Karanlık insan septin octamers_9i1 saflaştırılmasından elüsyon zirvesinin farklı fraksiyonlarını gösteren denatüre jel örneği. (B) Farklı septin komplekslerinin doğal elektroforez örneği. (C,D) 12.5 nM septin komplekslerinde kütle fotometrisinin histogram sonuçlarının farklı örnekleri: (C) karanlık insan septin octamers_9i1 ve (D) DSep1-msfGFP Drosophila septin heksameers. Çizgiler Gauss uyumlarıdır. (E) 25 nM karanlık insan septinin TEM görüntüsü, septin tamponunda octamers_9i1. Ölçek çubuğu = 200 nm. (F) SEPT2-msfGFP insan septin octamers_9i1 sınıf ortalama görüntüsü. msfGFP etiketleri iki uçta bulanık yoğunluklar olarak görünür. Ölçek çubuğu = 10 nm. Paneller (E) ve (F) The Company of Biologists'in telif hakkıdır ve izin alınarak Iv ve ark.10'dan uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Hem doğal jellerin hem de iSCAT'ın yalnızca topluluk ortalaması elde edilen bilgileri sağladığı göz önüne alındığında, komplekslerin bütünlüğünü ve saflığını doğrudan görselleştirme ile kontrol etmek için tek septin oligomerlerinin iletim elektron mikroskobu görüntülerinin sınıf ortalaması kullanılmıştır. Septin tamponundaki septin komplekslerinin TEM görüntülerinde, 24 nm (hexamers) veya 32 nm (oktamer) uzunluğunda çubuklar gözlenebilir. SEPT9_i1 içeren bir insan septin oktamerinin bir örneği Şekil 3E'de görülebilir. Sınıf bunların ortalamasını alırken, alt birimlerin her biri, Şekil 3F'de SEPT9_i1 sahip msfGFP etiketli insan oktamerinde görüldüğü gibi gözlemlenebilir ve sayılabilir. Oligomerin floresan olarak etiketlenmesi durumunda, çubukların sonunda SEPT2-msfGFP'ye karşılık gelen ekstra yoğunluklar gözlemlenebilir (Şekil 3F).
Yukarıdaki tekniklerin kombinasyonu, doğru stokiyometrik orana ve yüksek saflığa sahip oktamerlerin (veya heksamerlerin) tarif edilen protokol kullanılarak saflaştırılabileceğini kanıtlamaktadır. Son olarak, son kalite kontrol kontrolü, septin komplekslerinin polimerizasyon yetenekleri açısından işlevselliği içindir. Düşük tuz konsantrasyonu varlığında (tarif edilen tampon 9 ile <150 mM KCl), septinler diğer proteinlerin veya negatif yüklü lipit membranlarının varlığında değilse, kendi kendine demetlerhalinde toplanırlar9. Septinler, yüksek (300 mM) KCl konsantrasyonuna sahip depolama tamponunda tutularak polimerizasyondan önlenir. Septin hetero-oligomerleri daha sonra aynı bileşime sahip bir tamponda 1: 6 hacim oranında seyreltilir, ancak 50 mM'lik son bir KCl konsantrasyonu elde etmek için KCl olmadan. Floresan görüntüleme yapmak için, bu tampon fotobeyazlatmadan korunmak için bir oksijen süpürme sistemi ve yanıp sönen bir baskılayıcı ile tamamlanmaktadır. TIRF mikroskopisinde, sığ TIRF alanı içinde küçük protein kümeleri gözlenebilir (~100 nm; Şekil 4A,B). Konfokal mikroskopta, çözelti içinde daha yükseğe doğru yüzen büyük filamentli yapı kümeleri görülebilir (Şekil 4C). Son olarak, TEM ile, TIRF tarafından gözlemlenen kümelere karşılık gelen küçük septin demetleri (Şekil 4D) ve konfokal mikroskopi ile gözlenen yapılara karşılık gelen büyük demetler (Şekil 4E) gözlemlenebilir. Şekil 4D, E'nin iç kısımları, her iki yapı tipinin de paralel olarak çalışan ve konik uçlu demetler oluşturan uzun, ince filamentlerden oluştuğunu ortaya koymaktadır. Birlikte, floresan ve TEM görüntüleri, saflaştırılmış septin komplekslerinin filamentlere polimerize olabileceğini ve bunun da kendi kendine demetler halinde toplandığını kanıtlamaktadır.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig04.jpg"> Şekil 4: Polimerizasyon yeteneği kalite kontrolünün sonuçlarına örnekler. (A) fluoSPB'de 300 nM insan septin heksamerinin (% 10 msfGFP etiketli heksamer) TIRF görüntüsü. (B) fluoSPB'de SEPT9_i1 (octamers9_i1 %10 msfGFP etiketli) içeren 300 nM insan septin oktamerinin TIRF görüntüsü. (C) FlüoSPB'de 300 nM insan septinin 0,5 μm aralığı ile ~30 μm boyunca Z-yığınlarının konfokal maksimum yoğunluk projeksiyonları octamers_9i3. (A-C) Ölçek çubuğu = 10 μm ve ters gri tonlamalı. (D,E) Örnek (D) küçük ve (E) büyük insan septin demetlerinin TEM görüntüleri darkSPB'de octamers_9i1. Girintiler, demet içinde paralel çalışan berrak filamentlerin gözlemlenebileceği bölgeleri gösterir. Ölçek çubukları = 500 nm. Paneller (C-E) telif hakkı The Company of Biologists'e aittir ve izin alınarak Iv ve ark.10'dan uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Plazmidlerin listesi. Bu protokolü takiben septin oligomerlerini saflaştırmak için plazmidler. Tüm plazmidler Addgene'de (ilk sütun) biriktirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%201_V2.zip" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 2: Arabelleklerin listesi. Septin oligomerlerinin saflaştırılması ve kalite kontrolünde kullanılan tampon bileşimleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%202(1).xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 3: Moleküler ağırlıklar ve yok olma katsayıları. Kompleksin dizilerine dayanarak ProtParam ile hesaplanan 280 nm dalga boyundaki moleküler ağırlıkların (MW) ve optik yok olma katsayılarının (ε) listesi, septin alt birimlerinin, farklı septin komplekslerinin ve Tablo 1'de listelenen plazmidlerle saflaştırılabilen benzersiz septin alt birimlerinin (sadece MW) doğrusal füzyonunu varsayarsak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%203.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution at JoVE.com

Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution

Hücre iskeleti proteinlerinin in vitro resusyonu, bu proteinlerin temel fonksiyonel özelliklerini anlamak için hayati bir araçtır. Bu yazıda, hücre bölünmesi ve göçünde merkezi bir rol oynayan rekombinant septin komplekslerinin saflaştırılması ve kalitesinin değerlendirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Hücresiz Sulandırma için Rekombinant Septin Komplekslerinin Saflaştırılması ve Kalite Kontrolü

Septins are a family of conserved eukaryotic GTP-binding proteins that can form cytoskeletal filaments and higher-order structures from hetero-oligomeric ...

Bu protokol, yüksek kaliteli septin komplekslerini saflaştırmayı mümkün kılar ve bu, septinlerin hücredeki birçok rolünü incelemek için gereklidir. Bu yaklaşımın temel avantajı, Addgene plazmidleri kullanarak yüksek kaliteli septini saflaştırmak için basit bir prosedürün sentezlenmesidir. Septinlerin birçok etkileşimi nedeniyle hücrelerde incelenmesi zordur.Kükürt sulandırması, bu karmaşıklığı basit bir sistemde inceleyerek çözmemize yardımcı olur. Bozulmayı önlemek için tek bir günde saflaştırma yapmanızı öneririz. Deneyimlerimize göre, bu proteinin ömrünü ve kalitesini artıracaktır.Başlamak için, dönüştürülmüş bakteri kültürünü bir çalkalayıcı inkübatörde 37 santigrat derecede büyütün, 600 nanometre dalga boyundaki optik yoğunluk etiketlenmemiş septinler için iki ila üçe veya msfGFP veya mEGFP etiketli septinler için 0.6 ila 0.8'e ulaşana kadar. Kuluçkadan sonra, IPTG'yi 0.5 milimolar nihai konsantrasyona ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin ve etiketlenmemiş septin hetero-oligomerlerini 37 santigrat derecede eksprese eden hücreleri üç saat boyunca inkübe edin veya msfGFP eksprese eden hücreler gece boyunca 17 santigrat derecede hetero-oligomerleri inkübe edin. Daha sonra hücreleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 4.000 kez G'de toplayın.Süpernatantı atın ve hücreleri lize etmek için peleti 100 mililitre lizis tamponunda çözün. Ardından, hücreyi sonikleştirmek için% 30 genlikte bir uç sonikatör kullanın. Dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 20.000 kez G'de santrifüj yaparak hücre lizatını netleştirin ve süpernatanı kurtarın.İsteğe bağlı olarak, makalede açıklandığı gibi elektroforezi denatüre etmek için bir örnek alın. His etiketli septinlerin afinite kromatografisi için, önceden paketlenmiş bir nikel sefarozun yüksek performanslı kromatografi kolonunu gerekli tüm tamponlarla dengeleyin. Arıtılmış süpernatantı kolona kadar yükleyin ve kromatografi sistemini başlatın.Daha sonra septin komplekslerini% 50 HisTrap elüsyon tamponu ile dakikada bir mililitre akış hızında süzün. 250 milimolarlık bir imidazol konsantrasyonu elde etmek için, 0.5 mililitre fraksiyonları toplayın. Şimdi hızlı bir protein sıvı kromatografi sistemi ile 280 nanometrede elüatın optik emilimini izleyin ve septin kompleksleri içeren fraksiyonları seçin.Strep-II etiketli proteinlerin afinite kromatografisi için, önceden paketlenmiş bir StrepTactin sefarozu yüksek performanslı kromatografi kolonunu septin tamponu ile dengeler. Nikel kolonundan geri kazanılan septin içeren fraksiyonları dakikada bir mililitre oranında yükleyin ve kromatografi sistemini başlatın. Daha sonra bağlı proteini yıkayın ve septin komplekslerini% 100 StrepTrap elüsyon tamponu ile dakikada bir mililitre akış hızında süzün.2.5 milimolar desthiobiotin konsantrasyonu elde etmek için, 0.5 mililitre fraksiyonları toplayın. Hızlı bir protein sıvı kromatografi sistemi ile çevrimiçi olarak izlenen 280 nanometrede elüatın optik emilimi ile belirtildiği gibi septin kompleksleri içeren fraksiyonları seçin. Deshiobiotin'i diyaliz aliquot ile çıkardıktan sonra, protein kompleksleri istenen aliquot boyutuna getirin, aliquot'u dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.İnterferometrik saçılma mikroskobu için, cam slaytları 1.5 numaralı slaytları, her biri beş dakika boyunca suda, izopropanolde ve tekrar deiyonize suda ultrasonik bir temizleyicide sonikleştirerek yıkayın. İki cam kaydırağı yumuşak bir azot gazı akışıyla kurulayın. Ardından, slaytlardan birinin ortasına yedi mikrolitrelik bir Poli-L-Lizin çözeltisi damlası yerleştirin ve diğer slaytın merkezini Poli-L-Lizin damlasının üzerine yerleştirin ve iki slaytı kolay ayırma için ortogonal olarak yönlendirin.30 saniye boyunca inkübe ettikten sonra, bir kez deiyonize su içeren bir beherin içine daldırarak ve doğrudan iki kez su akışı uygulayarak slaytı yıkayın. Azot gazı akışıyla kurutun ve bu slaytlar kuru koşullarda oda sıcaklığında yaklaşık altı hafta saklanabilir. Deneyden önce, ikişer ikişer, üçe iki veya üçe üç contadan oluşan bir parçayı kesin ve bunları bir cam slaytın Poli-L-Lizin ile muamele edilmiş kısmına yapıştırın, cam slaytı ve contaları hafif hizmet tipi bir silecek dokusuna yerleştirerek herhangi bir kirli yüzeye temas etmesini önleyin.Şimdi contaları bir pipet ucuyla bastırarak contaların üzerinde bulunan koruyucu plastikle yapıştırın. Daha sonra, septin tamponunu oda sıcaklığına ısıtın. Eldeki proteinleri çözün ve daha sonra buz üzerinde tutun.Ardından, contalı slaytı 19 mikrolitre septin tamponu içeren ticari kütle fotometri sistemine yerleştirin ve otomatik odaklama seçeneğini kullanarak mikroskobu odaklayın. Otomatik netleme seçeneğini kullanarak yeni ayarlarla yeniden netleme. Bir proje klasörü oluşturmak için, Dosya'nın ardından Yeni Proje'yi tıklatın ve verileri depolamak üzere bir proje klasörü yüklemek için Dosya'yı ve ardından Projeyi Yükle'yi tıklatın.Daha sonra pipetten bir mikrolitre numune 19 mikrolitre septum tamponuna damlatılır. Karıştırın ve karıştırırken, slaytın hareketini önlemek için herhangi bir şeye dokunmaktan kaçının. Ardından, Kaydet'e tıklayarak 6.000 karelik bir video kaydedin.Protein kütle dağılımını elde etmek için üreticinin yazılımını kullanarak videoları analiz edin. Farklı septin hetero-oligomer boyutlarının zirveleri çok fazla örtüşürse veya çok fazla olay tespit edilirse, son septin konsantrasyonunu azaltır ve tekrar ölçer. Ve yeterli sayıda tek molekül ölçülmediğinde, septin konsantrasyonunu artırın ve tekrar ölçün.Septin analizi için, 5X darkSPB'yi ve septin tamponunda istenen son konsantrasyondan altı kat daha yüksek konsantrasyonda% 100 koyu septinden oluşan bir septin karışımı ve bir milimolar Dithiothreitol hazırlayın. Daha sonra bu özel sırayla su,% 205X darkSPB ve% 16.67 septin karışımı karıştırarak septini polimerize edin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Parıltılı bir elektron mikroskobu ızgarasına üç ila beş mikrolitre numune ekleyin ve bir dakika boyunca inkübe edin.Şimdi, bir damla darkSPB tamponu ekleyerek ızgarayı iki kez yıkayın ve sıvıyı bir filtre kağıdıyla emer. Bir kez suyla yıkayın ve% 2 uranil asetat ile 30 saniye inkübe edin. Daha sonra, lekeyi lekeleyin ve numuneyi birkaç dakika boyunca hava ile kurutun.Daha sonra septin demetlerini 120 kilovoltta ve 5.000X ile 60.000X arasında büyütmeleri bir ila iki mikrometre odak ile görüntüleyin. HisTrap ve StrepTrap kromatogramı, havuzlanmış fraksiyonun elüsyon zirvesinin başlangıcından absorbansın sırasıyla yaklaşık 250 mililitre ve 50 mililitrede stabilize olana kadar gittiğini gösterdi. Septin bantları, denatüre jel elektroforezinde benzer yoğunluklar gösterdi ve bu da septinlerin sağlam olduğunu düşündürdü.Doğal elektroforezde, bozulmamış hetero-oligomerlere karşılık gelen ana bant ve tribrörlere veya tetramerlere karşılık gelen küçük bir bant gözlenmiştir. msfGFP etiketli komplekslerin görünür moleküler ağırlığı, etiketlenmemiş komplekslerinkinden ayırt edilemez. Kütle fotometrisinde septinlerin sağlam oktamerleri ve heksamerleri saptandı.241 kilodaltondaki ek bir zirve, iki fıstık proteininin, DSep1 ve mEGFP-DSep2'nin varlığını gösterdi. Septin komplekslerinin transmisyon elektron mikroskobu görüntülerinde heksamer ve oktamer çubukları görüldü. msfGFP etiketleri, septin 2 msfGFP insan septin octamers_9i1 iki ucunda bulanık yoğunluklar olarak görülebilir.Sığ TIRF alanında küçük protein kümeleri gözlenebilir. Konfokal mikroskopi, yüzen filamentli yapıların büyük kümelerini ortaya çıkardı. İletim elektron mikroskobu, toplam iç yansıma floresan mikroskobu ve konfokal mikroskopi ile gözlenen kümelere karşılık gelen küçük ve büyük septin demetleri gösterdi.Saflaştırmalar sırasında her zaman buz üzerinde çalışmanızı ve protokolde belirttiğimiz taze reaktifleri eklemenizi öneririz. Sitokinezi bağlamında septinlerin etkileşimleriyle ilgileniyoruz. Septini, mikroskopi ve çeşitli biyofiziksel tahlillerle incelemek için modern membranlar aktin ve mikrotübüllerle birlikte yeniden yapılandırdık.Saflaştırılmış septinleri, septinlerin aktin filamentleri, mikrotübüller ve lipitlerle nasıl etkileşime girdiğini incelemek için kullanıyoruz. Ayrıca saflaştırılmış septinleri, septinlerin hücre bölünmesini kolaylaştırdığı sentetik hücreler oluşturmak için kullanıyoruz.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Microemulsions boş hücre Xenopus yumurtanın hücre döngüsü salınımlarını sulandırma ayıklar

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Kloroplast Translocon Protein kompleksleri dokunun etiketini kullanarak benzeşme arıtma

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

N-terminal etki alanı Ryanodine reseptör Plutella xylostella gelen kristal yapısı

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Tek adım arıtma RNA bağlı Biotin ve fotoğraf yarilabilir bir bağlayıcı kullanarak makromoleküllerin kompleksleri

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Bir Flavanone bir Flavonol Biyosentezi Bir-pot Bienzymatik Cascade Kurarak

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...