Name: immunolabeling and counting ribbon synapses in young adult and aged gerbil cochleae
Uploaded: 2022-04-21T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae at JoVE.com

Forfatterne anerkender Lichun Zhang for at have hjulpet med at etablere metoden og Fluorescence Microscopy Service Unit, Carl von Ossietzky University of Oldenburg, for brugen af billeddannelsesfaciliteterne. Denne forskning blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy -EXC 2177/1.

Alle protokoller og procedurer blev godkendt af de relevante myndigheder i Niedersachsen, Tyskland, med tilladelsesnumre AZ 33.19-42502-04-15/1828 og 33.19-42502-04-15/1990. Denne protokol er for mongolske gerbils (M. unguiculatus) af begge køn. Ung voksen refererer til en alder af 3-12 måneder, mens gerbils betragtes som 36 måneder og ældre. Medmindre andet er angivet, kan buffere og opløsninger tilberedes og opbevares i køleskabet i op til flere måneder (4-8 °C). Før brug skal det sikres, at bufferne ...

<ol>
	<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+and+age-related+hearing+loss:+new+perspectives+and+potential+therapies+[version+1;+peer+review.">Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review.</a> F1000Research. 6 (927), (2017).</li><li>Heeringa, A. N., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+cochlea:+Towards+unraveling+the+functional+contributions+of+strial+dysfunction+and+synaptopathy.">The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy.</a> Hearing. 376, 111-124 (2019).</li><li>Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+gradients+of+ribbon+size+and+AMPA+receptor+expression+underlie+sensitivity+differences+among+cochlear-nerve/hair-cell+synapses.">Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).</li><li>Khimich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+synaptic+ribbons+are+essential+for+synchronous+auditory+signalling.">Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling.</a> Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).</li><li>Pangr&#353;i&#269;, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+requires+otoferlin-dependent+efficient+replenishment+of+synaptic+vesicles+in+hair+cells.">Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells.</a> Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).</li><li>Meyer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+synapse+number,+structure+and+function+in+the+cochlea.">Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea.</a> Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).</li><li>Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+gradients+of+ribbon+volume+and+AMPA-receptor+patch+volume+in+cochlear+afferent+synapses+on+gerbil+inner+hair+cells.">Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells.</a> Hearing Research. 364, 81-89 (2018).</li><li>Steenken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decline+in+cochlear+ribbon+synapses+and+its+relation+to+different+metrics+of+auditory-nerve+activity.">Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity.</a> Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).</li><li>Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+differences+among+afferent+synapses+on+cochlear+hair+cells:+Correlations+with+spontaneous+discharge+rate.">Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate.</a> Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olivocochlear+innervation+maintains+the+normal+modiolar-pillar+and+habenular-cuticular+gradients+in+cochlear+synaptic+morphology.">Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).</li><li>Reijntjes, D. O. J., K&#246;ppl, C., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+gradients+in+inner+hair+cell-auditory+nerve+fiber+pre-+and+postsynaptic+proteins+differ+across+mouse+strains.">Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains.</a> Hearing Research. 390, 107933 (2020).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve.">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li><li>Bourien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+auditory+nerve+fibers+to+compound+action+potential+of+the+auditory+nerve.">Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+An+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Batrel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+potentials+recorded+at+the+round+window+enable+the+detection+of+low+spontaneous+rate+fibers+in+gerbil+auditory+nerve.">Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).</li><li>Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -. L., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+hearing+loss+in+gerbil:+Round+window+assays+of+synapse+loss.">Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).</li><li>Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+auditory+thresholds+and+loss+of+ribbon+synapses+at+inner+hair+cells+in+aged+gerbils.">Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils.</a> Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).</li><li>Cheal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gerbil:+A+unique+model+for+research+on+aging.">The gerbil: A unique model for research on aging.</a> Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).</li><li>Gates, G. A., Mills, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presbycusis.">Presbycusis.</a> The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).</li><li>Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+sensitivity+of+the+gerbil,+Meriones+unguiculatis.">Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li><li>M&#252;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+place-frequency+map+of+the+adult+and+developing+gerbil.">The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+intact+rodent+organ+of+Corti+for+RNAscope+and+immunolabeling,+confocal+microscopy,+and+quantitative+analysis.">Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).</li><li>Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+migration+and+reorganization+after+noise+exposure+suggests+regeneration+in+a+mature+mammalian+cochlea.">Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).</li><li>Gray, D. A., Woulfe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+and+aging:+a+matter+of+toxic+waste.">Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste.</a> Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).</li><li>Li, H. -. S., Hultcrantz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+degeneration+of+the+organ+of+Corti+in+two+genotypes+of+mice.">Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice.</a> ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).</li><li>Kobrina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+anatomical+and+physiological+markers+of+auditory+system+degeneration+with+behavioral+hearing+assessments+in+a+mouse+(Mus+musculus)+model+of+age-related+hearing+loss.">Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss.</a> Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).</li><li>Moreno-Garc&#237;a, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+role+of+lipofuscin+in+age-related+neurodegeneration.">An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).</li><li>Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+myocardial+tissue+with+digital+autofluorescence+microscopy.">Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy.</a> Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).</li><li>Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+gradients+in+the+size+of+inner+hair+cell+ribbons+emerge+before+the+onset+of+hearing+in+rats.">Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).</li><li>Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neural+degeneration+in+the+human+cochlea:+Evidence+for+hidden+hearing+loss+in+the+aging+ear.">Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear.</a> Neuroscience. 407, 8-20 (2019).</li></ol>

Med den metode, der er skitseret i denne protokol, er det muligt at immunolabel IHC'er og synaptiske strukturer i cochleae fra unge voksne og gamle gerbils, identificere formodede funktionelle synapser ved samtidig lokalisering af præ- og postsynaptiske elementer, allokere dem til individuelle IHC'er og kvantificere deres antal, volumen og placering. Antistofferne, der anvendes i denne tilgang, mærkede også ydre hårceller (OHC'er; myoVIIa) og deres præsynaptiske bånd. Desuden er et levedygtigt alternativ til immun...

Aldersrelateret høretab er en af verdens mest udbredte sygdomme, der rammer mere end en tredjedel af verdens befolkning i alderen 65 år og ældre1 år. De underliggende årsager er stadig under debat og undersøges aktivt, men kan omfatte tabet af de specialiserede synapser, der forbinder indre hårceller (IHC'er) med afferente auditive nervefibre2. Disse båndsynapser omfatter en præsynaptisk struktur, der har vesikler fyldt med neurotransmitteren glutamat bundet til det, såvel som postsynaptiske α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA) glutamatreceptorer 3,4,5. I gerbilen kontakter ~ 20 afferente auditive nervefibre en IHC 6,7,8. Fibre på IHC, der vender mod modiolus, er imod store synaptiske bånd, mens fibrene, der forbinder på søjlesiden af IHC, står over for små synaptiske bånd (dvs. hos katte9, gerbils7, marsvin10 og mus 3,11,12,13,14). Desuden er størrelsen af de presynaptiske bånd og de postsynaptiske glutamatpletter i gerbilen positivt korreleret 7,14. Fibre, der er imod store bånd på den modiolære side af IHC, er små i kaliber og har lave spontane hastigheder og høje tærskler15. Der er tegn på, at fibre med lav spontan hastighed er mere sårbare over for støjeksponering10 og ototoksiske lægemidler16 end fibre med høj spontan lav tærskel, som er placeret på søjlesiden af IHC'er15.
Tabet af båndsynapser er den tidligste degenerative begivenhed i cochlear neural aldersrelateret høretab, mens tabet af spiralganglionceller og deres afferente auditive nervefibre halterbagefter 17,18. Elektrofysiologiske korrelater inkluderer optagelser af auditive hjernestammeresponser17 og sammensatte handlingspotentialer8; disse afspejler imidlertid ikke finesserne ved synapsetab, da fibre med lav spontan hastighed ikke bidrager til disse foranstaltninger16. Mere lovende elektrofysiologiske målinger er det massepotentialeafledte neurale indeks19 og peristimulus-tidsresponsen20. Disse er dog kun pålidelige, hvis dyret ikke har andre cochleapatologier ud over auditivt nervefibertab, der påvirker aktiviteten af de resterende auditive nervefibre8. Desuden var adfærdsmæssigt vurderede tærskler i gerbilen ikke korreleret med synapsetal21. Derfor er pålidelig kvantificering af overlevende båndsynapser og dermed antallet af funktionelle auditive nervefibre kun mulig ved direkte undersøgelse af cochlear-vævet.
Den mongolske gerbil (Meriones unguiculatus) er en velegnet dyremodel til undersøgelse af aldersrelateret høretab. Det har en kort levetid, har lavfrekvent hørelse svarende til mennesker, er let at vedligeholde og viser ligheder med menneskelige patologier relateret til aldersrelateret høretab 2,22,23,24. Gerbils betragtes som gamle, når de når 36 måneder, hvilket er nær slutningen af deres gennemsnitlige levetid22. Det er vigtigt, at der er påvist et aldersrelateret tab af båndsynapser i gerbils, der er hævet og ældet i rolige omgivelser 8,21.
Her præsenteres en protokol til immunolabel, dissekering og analyse af cochleae fra gerbils i forskellige aldre, fra unge voksne til alderen. Antistoffer rettet mod komponenter i presynapse (CtBP2), postsynaptiske glutamatreceptorplastrepletter (GluA2) og IHC'er (myoVIIa) anvendes. Der anvendes en autofluorescens quencher, der reducerer baggrunden i alderen cochleae og efterlader fluorescenssignalet intakt. Endvidere gives en beskrivelse af, hvordan man dissekerer cochlea for at undersøge både det sensoriske epitel og stria vascularis. Cochlear-længden måles for at gøre det muligt at vælge forskellige cochlea-steder, der svarer til specifikke bedste frekvenser25. Kvantificering af synapsenumre udføres med den frit tilgængelige software ImageJ26. Yderligere kvantificering af synapsevolumener og placeringer inden for den enkelte HC udføres med software, der er tilpasset skrevet i Matlab. Denne software gøres ikke offentligt tilgængelig, da forfatterne mangler ressourcer til at levere professionel dokumentation og support.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V biotin-free</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse)</td>
			<td>BD Biosciences, Eysins</td>
			<td>612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse (IgG1)-AF 488</td>
			<td>Molecular Probes Inc.</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit)</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25e6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade Holder &#38; Breaker - Flat Jaws</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10052-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Artery Scissors - Ball Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LH26.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Surgical Blade</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>0473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti-rabbit (IgG)-AF647</td>
			<td>Life Technologies-Molecular Probes</td>
			<td>A-31573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12468750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8040.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Blade</td>
			<td>PLANO</td>
			<td>112-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G19 Cannula</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9003633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse (IgG2a)-AF568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>N68542.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essentials</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol, Immersion oil 518F</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>10539438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4062957E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISM596D</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KL 1600 LED</td>
			<td>Schott</td>
			<td>150.600</td>
			<td>light source for stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application suite X</td>
			<td>Leica Microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 system</td>
			<td>Leica Microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>The Mathworks Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14512-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-100 Orbital-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-M100</td>
			<td>for use in cold environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narcoren (pentobarbital)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ni-Ei</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Europe B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish without vents</td>
			<td>Avantor VWR</td>
			<td>390-1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31434-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Cap Containers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K305.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Halsted-Mosquito Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91308-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160; X</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors, 3mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrax VXR basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0002819000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>953300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild TYP 355110 (Stereomicroscope)</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td></td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabeling and counting ribbon synapses in young adult and aged gerbil cochleae

Tabet af båndsynapser, der forbinder indre hårceller og afferente auditive nervefibre, antages at være en årsag til aldersrelateret høretab. Den mest almindelige metode til påvisning af tab af båndsynapser er immunolabeling, fordi det giver mulighed for kvantitativ prøveudtagning fra flere tonotopiske steder i en individuel cochlea. Imidlertid er de interessante strukturer begravet dybt inde i den benede cochlea. Gerbils bruges som en dyremodel for aldersrelateret høretab. Her beskrives rutinemæssige protokoller for fiksering, immunolabeling af gerbil cochlear hele monteringer, konfokal billeddannelse og kvantificering af båndsynapsnumre og volumener. Desuden fremhæves de særlige udfordringer, der er forbundet med at opnå godt materiale fra værdifulde aldrende individer. 
Gerbils aflives og enten perfunderes kardiovaskulært, eller deres tympaniske bullae dissekeres omhyggeligt ud af kraniet. Cochleae åbnes i toppen og bunden og overføres direkte til fikseringsmidlet. Uanset den oprindelige metode efterfikses cochleae og afkalkes derefter. Vævet mærkes derefter med primære antistoffer mod præ- og postsynaptiske strukturer og hårceller. Dernæst inkuberes cochleae med sekundære fluorescensmærkede antistoffer, der er specifikke mod deres respektive primære. Cochleae af alderen gerbils behandles derefter med en autofluorescens quencher for at reducere den typisk betydelige baggrundsfluorescens af ældre dyrs væv. 
Endelig dissekeres cochleae i 6-11 segmenter. Hele cochlear-længden rekonstrueres således, at specifikke cochlear-steder kan bestemmes pålideligt mellem individer. Konfokale billedstakke, erhvervet sekventielt, hjælper med at visualisere hårceller og synapser på de valgte steder. De konfokale stakke dekonvoleres, og synapserne tælles enten manuelt ved hjælp af ImageJ, eller mere omfattende kvantificering af synaptiske strukturer udføres med billedanalyseprocedurer, der er specialskrevet i Matlab.

Cochleae blev enten høstet efter kardiovaskulær perfusion med fiksering af hele dyret eller hurtigt dissekeret efter aflivning af dyret og nedsænkningsfikseret. Med sidstnævnte metode forblev IHC'erne på plads under dissektion, mens det sensoriske epitel i tilfælde af mislykket perfusion og dermed utilstrækkeligt fikseret væv ofte blev ødelagt. Bemærk, at forfatterne stødte på tilfælde, hvor fiksering af cochleae efter transkardieperfusion var utilstrækkelig, mens fiksering af hjernen stadig var tilstrække...

Watch this Scientific Journal Video about Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae at JoVE.com

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

En protokol til behandling af unge voksne og alderen gerbil cochleae ved immunolabeling af de afferente synaptiske strukturer og hårceller, slukning af autofluorescens i alderen væv, dissekering og estimering af længden af cochleae og kvantificering af synapserne i billedstakke opnået med konfokal billeddannelse præsenteres.

Immunolabeling og tælling af båndsynapser hos unge voksne og ældre Gerbil Cochleae

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

Denne protokol muliggør evaluering af den synaptiske integritet i cochlea af gerbil i alle aldre. Dette er vigtigt for grundforskning i høreproblemer, især på grund af aldring. Protokollen er relativt hurtig og giver kvantitative data fra flere steder langs cochlea.Desuden løser det et specifikt problem med aldrende væv ved hjælp af en autofluorescens quencher. Degeneration af synapser er det tidligste tegn på tab af funktion i cochlea. Kvantificering af det er et vigtigt redskab i forskning mod udvikling af ikke-invasive diagnostiske værktøjer til synaptopati.Cochlear dissektion er den mest afgørende del, der har brug for praksis, så det er bedre at starte med ikke-eksperimentel cochli. Begynd med at fjerne bullae. Skær knoglen med en saks eller knæk knoglen med tang og fjern den med tang for at nå cochlea.Fjern malleus, incus og halvcirkelformede kanaler. Fjern forsigtigt knoglen, der dækker toppen af cochlea, og krads cochlear-knoglen med tang for at lave små huller i toppen og i basaldrejningen eller forsigtigt stikke huller begge steder. Overfør straks bullae til mindst 50 ml koldt fikseringsmiddel.For at skære cochli i halve skal du placere et stykke barberblad længere end cochleaens oprullede længde i en bladholder. Placer derefter cochlea i en petriskål under et stereomikroskop. Skær overskydende væv væk med et barberblad eller med en fin saks.Hold cochlea på plads med fine tang og skær i halve langs modiolus. Forbered en 5% opløsning af autofluorescens quencher ved at blande den med 70% ethanol. Cochli anbringes i denne opløsning, og den inkuberes i et minut ved stuetemperatur på en ryster efterfulgt af vask tre gange med en milliliter PBS i fem minutter.Til dissektion af cochlea skal du samle to fine tang, superfine tang, vannas, fjedersaks, en knivholder, et barberblad og fylde polystyrol petriskål og dens låg med PBS. Bryd stykker fra barberbladet for at opnå en skæreflade på to til fire millimeter. Skær cochlea i halvdelen som vist i afsnittet til vævsforberedelse.Fastgør forsigtigt cochlear-halvdelen med tangen, så den afskårne kant vender opad. Brug en fin fjedersaks til at skære cochleabenets knogle væk over helicotremaet, der dækker toppen. Brug derefter en saks til at isolere den apikale drejning ved at skære gennem modiolus og hørenerven og scala vestibuli.Lav to snit på hver side af cochlear knoglen ovenfor, eller hvis stria vascularis ikke er nødvendig for yderligere evaluering, direkte gennem stria vascularis i den midterste drejning. Brug barberbladet til at adskille cochlear-stykkerne. Alternativt skæres mellem Corti-organet og stria vascularis.Lad stria vascularis være forbundet med spiralbåndet og fjern den afkalkede knogle ved hjælp af tang. Overfør derefter cochlear-stykkerne til et petriskållåg fyldt med PBS. Fjern overskydende væv på søjlen og de moderne sider, således at hele monteringerne senere vil ligge på glideren så fladt som muligt.Store cochleastykker, især dem, der stammer fra basaldrejningen, skal skæres i to stykker. Fjern forsigtigt tectorialmembranen med superfine pincet. Placer cochlear-brikkerne på en glide i en dråbe monteringsmedium, så du sikrer, at Corti-organet vender opad.Skift cochlear-stykket ind i sagittalplanet og se efter invagination af spiral limbus i nærheden af de indre hårceller. Denne invagination af spiral limbus kan ses tydeligere i de midterste og basale cochlear stykker. Overfør hele cochlea og hele stria vascularis på mikroskopglasset ved at gentage disse trin.Dæk glideren og tilsæt sort neglelak rundt om kanterne til tætning. Tør i mørket og opbevar dem ved fire grader Celsius. Åbn en kopi af de dekonvolverede stakke i ImageJ-software, der er indlæst med BioVoxxel-plugin.Opdel kanalerne ved at klikke på Billede, derefter Farve og derefter Opdel kanaler. Flet dem ved at klikke på Billede, derefter Farve og derefter Flet kanaler for at tildele forskellige farver. Konverter billedet til en RGB-stak ved at klikke på Billede, gå derefter til Farve og klik på Stak til RGB.Juster lysstyrken og kontrasten ved at klikke på Billede, Juster og derefter Lysstyrke / Kontrast. Brug enten auto eller skyder for at sikre, at de præ- og postsynaptiske strukturer og de indre hårcelleetiketter adskiller sig fra baggrunden. Mærk fem indre hårceller med tekstværktøjet ved at klikke på den ønskede placering i stakken.Gå derefter til Analyser, derefter Værktøjer, og vælg ROI Manager. Marker afkrydsningsfeltets etiketter for at mærke punkterne med et tal. Zoom ind på den indre hårcelle af interesse.Højreklik på punktværktøjet for at vælge Multi-point-tilstand. Rul gennem Z-dimensionen, og tæl de funktionelle båndsynapser, som identificeres af et præsynaptisk bånd i sammenstilling med et postsynaptisk glutamatplaster. Når du har valgt alle de interesserede strukturer, skal du klikke på Tilføj ROI Manager, klik derefter på det vilkårlige navn og vælg Omdøb.Med håndværktøjet skal du justere billedet for fuldt ud at vise den næste indre hårcelle. Skift fra flerpunktsværktøj til punktværktøj for at undgå at føje flere punkter til de tidligere gemte data. Klik på en struktur af interesse inden for den næste indre hårcelle og skift til Multi-point værktøj.Fortsæt med at tilføje den funktionelle båndsynaps i ROI Manager, indtil alle de indre hårceller er evalueret. Klik på et datasæt i ROI Manager og derefter på Mål. Vent på, at der vises et nyt vindue, der viser de målte datapunkter, og klik på Filer og Gem som for at gemme denne liste som et regneark.Gem billedet ved at aktivere Vis alle i ROI Manager. Klik på Flad for permanent at tilføje punktetiketterne til stakken, og klik på Enig for at lukke ved at gemme ændringerne. Z stack fremskrivninger fra cochlea af en ung gerbil i alderen 10 måneder viser, at de myosin 7A-mærkede indre hårceller, der her er skitseret af hvide stiplede linjer, var i skarp kontrast til baggrunden.De præsynaptiske bånd blev mærket med anti-CtBP2 to vist med grønt, mens de postsynaptiske glutamatplastre blev mærket med anti-GluA2 vist med rødt. Cochlea fra en gammel gerbil i alderen 38 måneder blev behandlet med autofluorescens quencher og viste tydelige indre hårceller med tydeligt synlige præ- og postsynaptiske strukturer. For at teste stabiliteten af immunmærkningen blev det samme stykke cochlea fra den unge gerbil afbildet efter tre måneder og 29 1/2 måned.På trods af det reducerede signal/støj-forhold var de funktionelle synapser tydelige og kvantificerbare. Selv hvis et snit mislykkes, skal du montere det resterende stykke væv for senere at estimere den fulde cochlealængde mest nøjagtigt. Dataene fra denne protokol er særligt værdifulde, hvis de indledes med og derefter individuelt korreleres med elektrofysiologiske eller psykofysiske høretest.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Kinematics and Ground Reaction Force Determination: A Demonstration Quantifying Locomotor Abilities of Young Adult, Middle-aged, and Geriatric Rats

Behavior, in its broadest definition, can be defined as the motor manifestation of physiologic processes.  As such, all behaviors manifest through the ...

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Cerebrovaskulære Støbning af Voksen Mouse til 3D Imaging og morfologisk analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hele Mount immunolabeling af olfaktoriske receptor neuroner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescens og Bioluminescens Imaging af Subcellulær Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; I Aged hippocampusneuroner

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

High-Resolution Kvantitativ immunoguld Analyse af membranreceptorer på retinale Ribbon synapser

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Kombineret optogenetic og Freeze-fraktur Replica immunolabeling til at undersøge Input-specifikke Placering af glutamatreceptorer i Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Morfologiske og funktionelle evaluering af bånd synapser på specifikke frekvensområder af musen cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Morfologisk og funktionel vurdering af Axoner og deres synapser under Axon Death i Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Kultur af Neurosfærer Stammer fra neurogene nicher i Adult Prairie Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...