Name: immunolabeling and counting ribbon synapses in young adult and aged gerbil cochleae
Uploaded: 2022-04-21T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae at JoVE.com

De auteurs erkennen Lichun Zhang voor het helpen opzetten van de methode en de Fluorescence Microscopy Service Unit, Carl von Ossietzky University of Oldenburg, voor het gebruik van de beeldvormingsfaciliteiten. Dit onderzoek werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) in het kader van de Duitse Excellence Strategy -EXC 2177/1.

Alle protocollen en procedures zijn goedgekeurd door de relevante autoriteiten van Nedersaksen, Duitsland, met vergunningsnummers AZ 33.19-42502-04-15/1828 en 33.19-42502-04-15/1990. Dit protocol is voor Mongoolse gerbils (M. unguiculatus) van beide geslachten. Jongvolwassene verwijst naar de leeftijd van 3-12 maanden, terwijl gerbils worden beschouwd als 36 maanden en ouder. Indien niet anders vermeld, kunnen buffers en oplossingen worden bereid en bewaard in de koelkast gedurende maximaal enkele maanden (4-8 ?...

<ol>
	<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+and+age-related+hearing+loss:+new+perspectives+and+potential+therapies+[version+1;+peer+review.">Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review.</a> F1000Research. 6 (927), (2017).</li><li>Heeringa, A. N., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+cochlea:+Towards+unraveling+the+functional+contributions+of+strial+dysfunction+and+synaptopathy.">The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy.</a> Hearing. 376, 111-124 (2019).</li><li>Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+gradients+of+ribbon+size+and+AMPA+receptor+expression+underlie+sensitivity+differences+among+cochlear-nerve/hair-cell+synapses.">Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).</li><li>Khimich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+synaptic+ribbons+are+essential+for+synchronous+auditory+signalling.">Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling.</a> Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).</li><li>Pangr&#353;i&#269;, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+requires+otoferlin-dependent+efficient+replenishment+of+synaptic+vesicles+in+hair+cells.">Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells.</a> Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).</li><li>Meyer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+synapse+number,+structure+and+function+in+the+cochlea.">Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea.</a> Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).</li><li>Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+gradients+of+ribbon+volume+and+AMPA-receptor+patch+volume+in+cochlear+afferent+synapses+on+gerbil+inner+hair+cells.">Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells.</a> Hearing Research. 364, 81-89 (2018).</li><li>Steenken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decline+in+cochlear+ribbon+synapses+and+its+relation+to+different+metrics+of+auditory-nerve+activity.">Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity.</a> Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).</li><li>Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+differences+among+afferent+synapses+on+cochlear+hair+cells:+Correlations+with+spontaneous+discharge+rate.">Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate.</a> Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olivocochlear+innervation+maintains+the+normal+modiolar-pillar+and+habenular-cuticular+gradients+in+cochlear+synaptic+morphology.">Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).</li><li>Reijntjes, D. O. J., K&#246;ppl, C., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+gradients+in+inner+hair+cell-auditory+nerve+fiber+pre-+and+postsynaptic+proteins+differ+across+mouse+strains.">Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains.</a> Hearing Research. 390, 107933 (2020).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve.">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li><li>Bourien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+auditory+nerve+fibers+to+compound+action+potential+of+the+auditory+nerve.">Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+An+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Batrel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+potentials+recorded+at+the+round+window+enable+the+detection+of+low+spontaneous+rate+fibers+in+gerbil+auditory+nerve.">Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).</li><li>Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -. L., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+hearing+loss+in+gerbil:+Round+window+assays+of+synapse+loss.">Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).</li><li>Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+auditory+thresholds+and+loss+of+ribbon+synapses+at+inner+hair+cells+in+aged+gerbils.">Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils.</a> Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).</li><li>Cheal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gerbil:+A+unique+model+for+research+on+aging.">The gerbil: A unique model for research on aging.</a> Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).</li><li>Gates, G. A., Mills, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presbycusis.">Presbycusis.</a> The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).</li><li>Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+sensitivity+of+the+gerbil,+Meriones+unguiculatis.">Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li><li>M&#252;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+place-frequency+map+of+the+adult+and+developing+gerbil.">The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+intact+rodent+organ+of+Corti+for+RNAscope+and+immunolabeling,+confocal+microscopy,+and+quantitative+analysis.">Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).</li><li>Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+migration+and+reorganization+after+noise+exposure+suggests+regeneration+in+a+mature+mammalian+cochlea.">Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).</li><li>Gray, D. A., Woulfe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+and+aging:+a+matter+of+toxic+waste.">Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste.</a> Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).</li><li>Li, H. -. S., Hultcrantz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+degeneration+of+the+organ+of+Corti+in+two+genotypes+of+mice.">Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice.</a> ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).</li><li>Kobrina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+anatomical+and+physiological+markers+of+auditory+system+degeneration+with+behavioral+hearing+assessments+in+a+mouse+(Mus+musculus)+model+of+age-related+hearing+loss.">Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss.</a> Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).</li><li>Moreno-Garc&#237;a, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+role+of+lipofuscin+in+age-related+neurodegeneration.">An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).</li><li>Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+myocardial+tissue+with+digital+autofluorescence+microscopy.">Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy.</a> Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).</li><li>Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+gradients+in+the+size+of+inner+hair+cell+ribbons+emerge+before+the+onset+of+hearing+in+rats.">Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).</li><li>Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neural+degeneration+in+the+human+cochlea:+Evidence+for+hidden+hearing+loss+in+the+aging+ear.">Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear.</a> Neuroscience. 407, 8-20 (2019).</li></ol>

Met de methode die in dit protocol wordt beschreven, is het mogelijk om IHC's en synaptische structuren in slakkenhuizen van jongvolwassen en oudere gerbils te immunolabelen, veronderstelde functionele synapsen te identificeren door colokalisatie van pre- en postsynaptische elementen, ze toe te wijzen aan individuele IHC's en hun aantal, volume en locatie te kwantificeren. De antilichamen die in deze aanpak werden gebruikt, labelden ook buitenste haarcellen (OHCs; myoVIIa) en hun presynaptische linten. Bovendien is een ...

Leeftijdsgebonden gehoorverlies is een van 's werelds meest voorkomende ziekten die meer dan een derde van de wereldbevolking van 65 jaar en oudertreft 1. De onderliggende oorzaken zijn nog steeds in discussie en worden actief onderzocht, maar kunnen het verlies van de gespecialiseerde synapsen omvatten die binnenste haarcellen (IHC's) verbinden met afferente gehoorzenuwvezels2. Deze lintsynapsen bestaan uit een presynaptische structuur met blaasjes gevuld met de neurotransmitter glutamaat eraan vastgebonden, evenals postsynaptische α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionzuur (AMPA) glutamaatreceptoren 3,4,5. In de gerbil komen ~20 afferente gehoorzenuwvezels in contact met één IHC 6,7,8. Vezels op de IHC tegenover de modiolus zijn in tegenstelling tot grote synaptische linten, terwijl de vezels die aan de pijlerzijde van de IHC verbinden, kleine synaptische linten tegenkomen (d.w.z. bij katten9, gerbils7, cavia's10 en muizen 3,11,12,13,14). Bovendien zijn in de gerbil de grootte van de presynaptische linten en de postsynaptische glutamaatpleisters positief gecorreleerd 7,14. Vezels die zich verzetten tegen grote linten aan de modiolaire kant van de IHC zijn klein van kaliber en hebben lage spontane snelheden en hoge drempels15. Er zijn aanwijzingen dat vezels met een lage spontane snelheid kwetsbaarder zijn voor blootstelling aan lawaai10 en ototoxische geneesmiddelen16 dan hoog-spontane laagdrempelige vezels, die zich aan de pijlerzijde van IHC's15 bevinden.
Het verlies van lintsynapsen is de vroegste degeneratieve gebeurtenis in cochleair neuraal leeftijdsgebonden gehoorverlies, terwijl het verlies van spiraalvormige ganglioncellen en hun afferente gehoorzenuwvezels achterblijft bij17,18. Elektrofysiologische correlaten omvatten opnames van auditieve hersenstamresponsen17 en samengestelde actiepotentialen8; deze weerspiegelen echter niet de subtiliteiten van synapsverlies, omdat vezels met een lage spontane snelheid niet bijdragen aan deze metingen16. Meer veelbelovende elektrofysiologische metrieken zijn de massapotentiaal-afgeleide neurale index19 en de peristimulus-tijdrespons20. Deze zijn echter alleen betrouwbaar als het dier geen andere cochleaire pathologieën heeft, naast verlies van gehoorzenuwvezels, die de activiteit van de resterende gehoorzenuwvezels beïnvloeden8. Bovendien waren gedragsmatig beoordeelde drempels in de gerbil niet gecorreleerd met synapsgetallen21. Daarom is betrouwbare kwantificering van overlevende lintsynapsen en dus het aantal functionele gehoorzenuwvezels alleen mogelijk door direct onderzoek van het cochleaire weefsel.
De Mongoolse gerbil (Meriones unguiculatus) is een geschikt diermodel voor het bestuderen van leeftijdsgebonden gehoorverlies. Het heeft een korte levensduur, heeft een laagfrequent gehoor vergelijkbaar met mensen, is gemakkelijk te onderhouden en vertoont overeenkomsten met menselijke pathologieën gerelateerd aan leeftijdsgebonden gehoorverlies 2,22,23,24. Gerbils worden als oud beschouwd wanneer ze 36 maanden oud zijn, wat bijna het einde van hun gemiddelde levensduur22 is. Belangrijk is dat een leeftijdsgebonden verlies van lintsynapsen is aangetoond bij gerbils die zijn opgevoed en verouderd in rustige omgevingen 8,21.
Hier wordt een protocol gepresenteerd om slakkenhuis van gerbils van verschillende leeftijden, van jongvolwassenen tot oud, te labelen, te ontleden en te analyseren. Antilichamen gericht tegen componenten van de presynapse (CtBP2), postsynaptische glutamaatreceptorpleisters (GluA2) en IHC's (myoVIIa) worden gebruikt. Er wordt een autofluorescentie quencher toegepast die de achtergrond in verouderd slakkenhuis vermindert en het fluorescentiesignaal intact laat. Verder wordt een beschrijving gegeven van hoe het slakkenhuis te ontleden om zowel het sensorische epitheel als de stria vascularis te onderzoeken. De cochleaire lengte wordt gemeten om de selectie van verschillende cochleaire locaties mogelijk te maken die overeenkomen met specifieke beste frequenties25. Kwantificering van synapsnummers wordt uitgevoerd met de vrij beschikbare software ImageJ26. Aanvullende kwantificering van synapsvolumes en locaties binnen de individuele HC wordt uitgevoerd met software die op maat is geschreven in Matlab. Deze software wordt niet openbaar gemaakt, omdat de auteurs niet over de middelen beschikken om professionele documentatie en ondersteuning te bieden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V biotin-free</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse)</td>
			<td>BD Biosciences, Eysins</td>
			<td>612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse (IgG1)-AF 488</td>
			<td>Molecular Probes Inc.</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit)</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25e6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade Holder &#38; Breaker - Flat Jaws</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10052-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Artery Scissors - Ball Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LH26.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Surgical Blade</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>0473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti-rabbit (IgG)-AF647</td>
			<td>Life Technologies-Molecular Probes</td>
			<td>A-31573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12468750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8040.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Blade</td>
			<td>PLANO</td>
			<td>112-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G19 Cannula</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9003633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse (IgG2a)-AF568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>N68542.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essentials</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol, Immersion oil 518F</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>10539438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4062957E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISM596D</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KL 1600 LED</td>
			<td>Schott</td>
			<td>150.600</td>
			<td>light source for stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application suite X</td>
			<td>Leica Microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 system</td>
			<td>Leica Microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>The Mathworks Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14512-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-100 Orbital-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-M100</td>
			<td>for use in cold environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narcoren (pentobarbital)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ni-Ei</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Europe B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish without vents</td>
			<td>Avantor VWR</td>
			<td>390-1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31434-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Cap Containers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K305.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Halsted-Mosquito Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91308-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160; X</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors, 3mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrax VXR basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0002819000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>953300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild TYP 355110 (Stereomicroscope)</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td></td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabeling and counting ribbon synapses in young adult and aged gerbil cochleae

Het verlies van lintsynapsen die binnenste haarcellen en afferente gehoorzenuwvezels verbinden, wordt verondersteld een oorzaak te zijn van leeftijdsgebonden gehoorverlies. De meest gebruikelijke methode voor het detecteren van het verlies van lintsynapsen is immunolabeling omdat het kwantitatieve bemonstering van verschillende tonotopische locaties in een individueel slakkenhuis mogelijk maakt. De interessante structuren zijn echter diep in het benige slakkenhuis begraven. Gerbils worden gebruikt als diermodel voor leeftijdsgebonden gehoorverlies. Hier worden routinematige protocollen voor fixatie, immunolabeling gerbil cochleaire hele mounts, confocale beeldvorming en het kwantificeren van lint synapsnummers en volumes beschreven. Bovendien worden de specifieke uitdagingen in verband met het verkrijgen van goed materiaal van waardevolle ouder wordende personen benadrukt. 
Gerbils worden geëuthanaseerd en ofwel cardiovasculair doordrenkt, of hun trommelvlies bullae worden zorgvuldig uit de schedel ontleed. Het slakkenhuis wordt geopend aan de top en de basis en direct overgebracht naar het fixatief. Ongeacht de initiële methode worden de slakkenhuizen nagefixeerd en vervolgens ontkalkt. Het weefsel wordt vervolgens gelabeld met primaire antilichamen tegen pre- en postsynaptische structuren en haarcellen. Vervolgens worden de slakkenhuizen geïncubeerd met secundaire fluorescentie-gelabelde antilichamen die specifiek zijn tegen hun respectieve primaire antilichamen. Het slakkenhuis van oude gerbils wordt vervolgens behandeld met een autofluorescentie quencher om de typisch substantiële achtergrondfluorescentie van de weefsels van oudere dieren te verminderen. 
Ten slotte worden slakkenhuizen ontleed in 6-11 segmenten. De gehele cochleaire lengte wordt zodanig gereconstrueerd dat specifieke cochleaire locaties betrouwbaar kunnen worden bepaald tussen individuen. Confocale beeldstapels, sequentieel verkregen, helpen haarcellen en synapsen op de gekozen locaties te visualiseren. De confocale stapels worden gedeconcentraliseerd en de synapsen worden handmatig geteld met Behulp van ImageJ, of een uitgebreidere kwantificering van synaptische structuren wordt uitgevoerd met beeldanalyseprocedures die op maat zijn geschreven in Matlab.

Slakkenhuis werd geoogst na cardiovasculaire perfusie met fixatie van het hele dier of snel ontleed na het euthanaseren van het dier en onderdompelingsfixatie. Bij deze laatste methode bleven de IC's tijdens de dissectie op hun plaats, terwijl bij mislukte perfusie en dus onvoldoende vast weefsel het sensorische epitheel vaak werd vernietigd. Merk op dat de auteurs gevallen tegenkwamen waarin fixatie van het slakkenhuis na transcardiële perfusie onvoldoende was terwijl fixatie van de hersenen nog steeds voldoende was. W...

Watch this Scientific Journal Video about Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae at JoVE.com

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

Een protocol voor het verwerken van jongvolwassen en oud gerbil slakkenhuis door immunolabeling van de afferente synaptische structuren en haarcellen, het blussen van autofluorescentie in verouderd weefsel, het ontleden en schatten van de lengte van het slakkenhuis en het kwantificeren van de synapsen in beeldstapels verkregen met confocale beeldvorming wordt gepresenteerd.

Immunolabeling en counting ribbon synapsen bij jongvolwassen en oude Gerbil Cochleae

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

Dit protocol maakt de evaluatie van de synaptische integriteit in het slakkenhuis van de gerbil van alle leeftijden mogelijk. Dit is belangrijk voor fundamenteel onderzoek naar gehoorproblemen, in het bijzonder als gevolg van veroudering. Het protocol is relatief snel en levert kwantitatieve gegevens op van verschillende locaties langs het slakkenhuis.Bovendien pakt het een specifiek probleem van veroudering van weefsel aan door een autofluorescentie quencher te gebruiken. Degeneratie van synapsen is het vroegste teken van functieverlies in het slakkenhuis. Het kwantificeren ervan is een belangrijk hulpmiddel in onderzoek naar de ontwikkeling van niet-invasieve diagnostische hulpmiddelen voor synaptopathie.De cochleaire dissectie is het meest cruciale onderdeel dat oefening nodig heeft, dus het is beter om te beginnen met niet-experimentele cochli. Begin met het verwijderen van de bullae. Knip het bot met een schaar of kraak het bot met een tang en verwijder het met een tang om het slakkenhuis te bereiken.Verwijder de malleus, incus en halfronde kanalen. Verwijder voorzichtig het bot dat de top van het slakkenhuis bedekt en krab het cochleaire bot met een tang om kleine gaatjes aan de top en in de basale draai te maken of prik voorzichtig gaten op beide locaties. Breng de bullae onmiddellijk over in ten minste 50 milliliter koud fixatief.Om de cochli doormidden te snijden, plaatst u een stuk scheermesje dat langer is dan de opgerolde lengte van het slakkenhuis in een meshouder. Plaats het slakkenhuis vervolgens in een petrischaaltje onder een stereomicroscoop. Knip overtollig weefsel weg met een scheermesje of met een fijne schaar.Houd het slakkenhuis op zijn plaats met een fijne tang en snijd het doormidden langs de modiolus. Bereid een 5%-oplossing van de autofluorescentieblus door deze te mengen met 70% ethanol. Plaats de cochli in deze oplossing en incubeer deze gedurende één minuut bij kamertemperatuur op een shaker, gevolgd door driemaal te wassen met één milliliter PBS gedurende vijf minuten.Verzamel voor de dissectie van het slakkenhuis twee fijne tangen, superfijne tangen, vannas, veerschaar, een meshouder, een scheermesje en vul polystyrol petrischaal en het deksel met PBS. Breek stukjes van het scheermesje om een snijoppervlak van twee tot vier millimeter te verkrijgen. Snijd het slakkenhuis doormidden zoals aangegeven in de sectie voor weefselvoorbereiding.Bevestig de cochleaire helft voorzichtig met de tang, zodat de snijrand naar boven is gericht. Gebruik een fijne veerschaar om het bot van het slakkenhuis weg te snijden boven het helicotrema dat de top bedekt. Gebruik vervolgens een schaar om de apicale draai te isoleren door de modiolus en gehoorzenuw en scala vestibuli door te snijden.Maak twee sneden aan elke kant van het cochleaire bot erboven, of als de stria vascularis niet nodig is voor verdere evaluatie, rechtstreeks door de stria vascularis van de middelste bocht. Gebruik het scheermesje om de cochleaire stukken te scheiden. U kunt ook snijden tussen het orgaan van Corti en de stria vascularis.Laat de stria vascularis verbonden met het spiraalvormige ligament en verwijder het ontkalkte bot met behulp van een tang. Breng vervolgens de cochleaire stukken over in een petrischaaldeksel gevuld met PBS. Verwijder overtollig weefsel op de pilaar en modiolaire zijkanten zodat de hele steunen later zo plat mogelijk op de glijbaan zullen liggen.Grote cochleaire stukken, met name die afkomstig van de basale draai, moeten in twee stukken worden gesneden. Verwijder voorzichtig het tectoriale membraan met een superfijne tang. Plaats de cochleaire stukken op een schuif in een druppel montagemedium, zodat het orgaan van Corti naar boven is gericht.Verplaats het cochleaire stuk in het sagittale vlak en zoek naar invaginatie van de spiraalvormige limbus in de nabijheid van de binnenste haarcellen. Deze invaginatie van de spiraalvormige limbus is duidelijker te zien in de middelste en basale cochleaire stukken. Breng het hele slakkenhuis en de gehele stria vascularis over op de microscoopglaas door deze stappen te herhalen.Laat de glijbaan glijden en voeg zwarte nagellak toe rond de randen om af te sluiten. Droog in het donker en bewaar ze bij vier graden Celsius. Open een kopie van de gedeconvolved stacks in ImageJ-software geladen met BioVoxxel plugin.Splits de kanalen door te klikken op Afbeelding, vervolgens Op Kleur en vervolgens kanalen splitsen. Voeg ze samen door te klikken op Afbeelding, vervolgens op Kleur en vervolgens kanalen samenvoegen om verschillende kleuren toe te wijzen. Converteer de afbeelding naar een RGB-stapel door op Afbeelding te klikken, ga vervolgens naar Kleur en klik op Stapelen naar RGB.Pas de helderheid en het contrast aan door te klikken op Afbeelding, Aanpassen en vervolgens op Helderheid / contrast. Gebruik automatisch of schuifregelaar om ervoor te zorgen dat de pre- en post-synaptische structuren en de binnenste haarcellabels verschillen van de achtergrond. Label vijf binnenste haarcellen met het tekstgereedschap door op de gewenste locatie in de stapel te klikken.Ga vervolgens naar Analyseren, vervolgens Naar Extra en selecteer ROI Manager. Vink de selectievakjes aan om de punten met een nummer te labelen. Zoom in op de binnenste haarcel van belang.Klik met de rechtermuisknop op de punttool om de multipuntmodus te kiezen. Blader door de Z-dimensie en tel de functionele lintsynapsen, die worden geïdentificeerd door een pre-synaptisch lint in juxtapositie met een post-synaptische glutamaatpleister. Nadat u alle interessante structuren hebt geselecteerd, klikt u op De ROI-manager toevoegen, klikt u vervolgens op de willekeurige naam en kiest u Naam wijzigen.Pas met het handgereedschap de afbeelding aan om de volgende binnenste haarcel volledig weer te geven. Verander van Multi-point tool naar Point tool om te voorkomen dat er meer puncta wordt toegevoegd aan de eerder opgeslagen gegevens. Klik op een interessante structuur in de volgende binnenste haarcel en verander naar Multi-point tool.Ga door met het toevoegen van de functionele lintsynapse in de ROI Manager totdat alle binnenste haarcellen zijn geëvalueerd. Klik op een dataset in de ROI Manager en vervolgens op Meten. Wacht tot er een nieuw venster verschijnt met de gemeten gegevenspunten en klik op Bestand en Opslaan als om deze lijst als op te slaan als een spreadsheet.Sla de afbeelding op door Alles weergeven te activeren in DE ROI Manager. Klik op Afvlakken om de puntlabels permanent aan de stapel toe te voegen en klik op Akkoord om te sluiten door de wijzigingen op te slaan. Z stack projecties van het slakkenhuis van een jonge gerbil van 10 maanden laten zien dat de myosine 7A-gelabelde binnenste haarcellen die hier worden geschetst door witte stippellijnen in schril contrast stonden met de achtergrond.De pre-synaptische linten werden gelabeld met anti-CtBP2 twee weergegeven in groen, terwijl de post-synaptische glutamaatpleisters werden gelabeld met anti-GluA2 weergegeven in rood. Het slakkenhuis van een oude gerbil van 38 maanden werd behandeld met de autofluorescentie quencher en vertoonde duidelijke binnenste haarcellen met duidelijk zichtbare pre- en post-synaptische structuren. Om de stabiliteit van de immunolabeling te testen, werd hetzelfde stukje slakkenhuis van de jonge gerbil na drie maanden en 29 1/2 maand in beeld gebracht.Ondanks de verminderde signaal-ruisverhouding waren de functionele synapsen verschillend en kwantificeerbaar. Zelfs als een snede mislukt, monteer je het resterende stuk weefsel om later de volledige cochleaire lengte het nauwkeurigst te schatten. De gegevens van dit protocol zijn bijzonder waardevol als ze worden voorafgegaan door en vervolgens individueel gecorreleerd zijn met elektrofysiologische of psychofysische gehoortests.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Kinematics and Ground Reaction Force Determination: A Demonstration Quantifying Locomotor Abilities of Young Adult, Middle-aged, and Geriatric Rats

Kinematica en Ground Reaction Force Vaststelling: een demonstratie kwantificeren Locomotorische Vaardigheden van de Young Adult, van middelbare leeftijd, en geriatrische ratten

Behavior, in its broadest definition, can be defined as the motor manifestation of physiologic processes.  As such, all behaviors manifest through the ...

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Gerichte Training van Ultrasone Spreken in Aged en Parkinson ratten

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Cerebrovasculaire Gieten van de volwassen muis voor 3D Imaging en morfologische analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hele Mount immunolabeling van olfactorische receptor neuronen in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescentie en Bioluminescentie beeldvorming van Subcellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged hippocampus Neuronen

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

High-Resolution Kwantitatieve immunogoud Analyse van membraanreceptoren op het netvlies Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Gecombineerde optogenetische en Freeze-fractuur Replica immunokleuring Input-specifieke Regeling van glutamaatreceptoren in de Mouse amygdala Onderzoek

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Morfologische en functionele evaluatie van het lint synapsen op specifieke frequentiegebieden van de muis cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Morfologische en functionele evaluatie van Axons en hun Synapsen tijdens Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Cultuur van neurosferen afgeleid van de neurogene niches in Adult Prairie Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...