Name: immunolabeling and counting ribbon synapses in young adult and aged gerbil cochleae
Uploaded: 2022-04-21T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae at JoVE.com

저자들은 Lichun Zhang이 이미징 시설의 사용을 위해 Oldenburg의 Carl von Ossietzky University of Oldenburg의 Fluorescent Microscopy Service Unit과 방법을 수립하는 데 도움을 준 것을 인정합니다. 이 연구는 독일의 우수성 전략 -EXC 2177/1에 따라 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation)가 자금을 지원했습니다.

모든 프로토콜과 절차는 독일 니더작센주의 관련 당국에 의해 승인되었으며, 허가 번호는 AZ 33.19-42502-04-15/1828 및 33.19-42502-04-15/1990입니다. 이 프로토콜은 남녀 모두의 몽골 게르빌 (M. unguiculatus)을위한 것입니다. 젊은 성인은 3-12 개월의 나이를 말하며, gerbils는 36 개월 이상에서 노인으로 간주됩니다. 달리 언급되지 않은 경우, 완충액 및 용액을 제조하고 최대 수개월 (4-8 °C) 동안 냉장고에 저...

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	<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+and+age-related+hearing+loss:+new+perspectives+and+potential+therapies+[version+1;+peer+review.">Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review.</a> F1000Research. 6 (927), (2017).</li><li>Heeringa, A. N., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+cochlea:+Towards+unraveling+the+functional+contributions+of+strial+dysfunction+and+synaptopathy.">The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy.</a> Hearing. 376, 111-124 (2019).</li><li>Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+gradients+of+ribbon+size+and+AMPA+receptor+expression+underlie+sensitivity+differences+among+cochlear-nerve/hair-cell+synapses.">Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).</li><li>Khimich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+synaptic+ribbons+are+essential+for+synchronous+auditory+signalling.">Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling.</a> Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).</li><li>Pangr&#353;i&#269;, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+requires+otoferlin-dependent+efficient+replenishment+of+synaptic+vesicles+in+hair+cells.">Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells.</a> Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).</li><li>Meyer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+synapse+number,+structure+and+function+in+the+cochlea.">Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea.</a> Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).</li><li>Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+gradients+of+ribbon+volume+and+AMPA-receptor+patch+volume+in+cochlear+afferent+synapses+on+gerbil+inner+hair+cells.">Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells.</a> Hearing Research. 364, 81-89 (2018).</li><li>Steenken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decline+in+cochlear+ribbon+synapses+and+its+relation+to+different+metrics+of+auditory-nerve+activity.">Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity.</a> Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).</li><li>Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+differences+among+afferent+synapses+on+cochlear+hair+cells:+Correlations+with+spontaneous+discharge+rate.">Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate.</a> Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olivocochlear+innervation+maintains+the+normal+modiolar-pillar+and+habenular-cuticular+gradients+in+cochlear+synaptic+morphology.">Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).</li><li>Reijntjes, D. O. J., K&#246;ppl, C., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+gradients+in+inner+hair+cell-auditory+nerve+fiber+pre-+and+postsynaptic+proteins+differ+across+mouse+strains.">Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains.</a> Hearing Research. 390, 107933 (2020).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve.">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li><li>Bourien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+auditory+nerve+fibers+to+compound+action+potential+of+the+auditory+nerve.">Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+An+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Batrel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+potentials+recorded+at+the+round+window+enable+the+detection+of+low+spontaneous+rate+fibers+in+gerbil+auditory+nerve.">Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).</li><li>Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -. L., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+hearing+loss+in+gerbil:+Round+window+assays+of+synapse+loss.">Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).</li><li>Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+auditory+thresholds+and+loss+of+ribbon+synapses+at+inner+hair+cells+in+aged+gerbils.">Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils.</a> Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).</li><li>Cheal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gerbil:+A+unique+model+for+research+on+aging.">The gerbil: A unique model for research on aging.</a> Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).</li><li>Gates, G. A., Mills, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presbycusis.">Presbycusis.</a> The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).</li><li>Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+sensitivity+of+the+gerbil,+Meriones+unguiculatis.">Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li><li>M&#252;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+place-frequency+map+of+the+adult+and+developing+gerbil.">The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+intact+rodent+organ+of+Corti+for+RNAscope+and+immunolabeling,+confocal+microscopy,+and+quantitative+analysis.">Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).</li><li>Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+migration+and+reorganization+after+noise+exposure+suggests+regeneration+in+a+mature+mammalian+cochlea.">Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).</li><li>Gray, D. A., Woulfe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+and+aging:+a+matter+of+toxic+waste.">Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste.</a> Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).</li><li>Li, H. -. S., Hultcrantz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+degeneration+of+the+organ+of+Corti+in+two+genotypes+of+mice.">Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice.</a> ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).</li><li>Kobrina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+anatomical+and+physiological+markers+of+auditory+system+degeneration+with+behavioral+hearing+assessments+in+a+mouse+(Mus+musculus)+model+of+age-related+hearing+loss.">Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss.</a> Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).</li><li>Moreno-Garc&#237;a, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+role+of+lipofuscin+in+age-related+neurodegeneration.">An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).</li><li>Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+myocardial+tissue+with+digital+autofluorescence+microscopy.">Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy.</a> Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).</li><li>Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+gradients+in+the+size+of+inner+hair+cell+ribbons+emerge+before+the+onset+of+hearing+in+rats.">Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).</li><li>Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neural+degeneration+in+the+human+cochlea:+Evidence+for+hidden+hearing+loss+in+the+aging+ear.">Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear.</a> Neuroscience. 407, 8-20 (2019).</li></ol>

이 프로토콜에 설명 된 방법을 사용하면 젊은 성인 및 노인 게르빌의 달팽이관에서 IHC 및 시냅스 구조를 면역표지하고, 시냅스 전후 및 사후 시냅스 요소의 공동 국소화를 통해 추정 된 기능적 시냅스를 확인하고, 개별 IHC에 할당하고, 수, 부피 및 위치를 정량화 할 수 있습니다. 이 접근법에 사용된 항체는 또한 외부 모발 세포 (OHCs; myoVIIa) 및 그들의 시냅스 전 리본을 표지하였다. 또한, IHC와 OHC ?...

연령 관련 난청은 65세 이상 1세 이상 세계 인구의 3분의1 이상에 영향을 미치는 세계에서 가장 널리 퍼진 질병 중 하나입니다. 근본적인 원인은 여전히 논쟁 중이며 적극적으로 조사되고 있지만 구심성 청각 신경 섬유2와 내부 모발 세포 (IHC)를 연결하는 특수 시냅스의 손실을 포함 할 수 있습니다. 이러한 리본 시냅스는 신경 전달 물질 글루타메이트로 채워진 소포뿐만 아니라 시냅스 후 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산(AMPA) 글루타메이트 수용체 3,4,5로 채워진 소포를 갖는 시냅스 전 구조를 포함한다. 게르빌에서, ~20개의 구심성 청각 신경 섬유가 하나의 IHC 6,7,8에 접촉한다. 모디올러스를 향하는 IHC 상의 섬유는 큰 시냅스 리본과 반대되는 반면, IHC의 기둥 측에 연결되는 섬유는 작은 시냅스 리본(즉, 고양이9, 게르빌7, 기니피그 10, 및 마우스 3,11,12,13,14)을 직면한다. 또한, 게르빌에서는 시냅스 전 리본과 시냅스 후 글루타메이트 패치의 크기가 7,14와 양의 상관 관계가 있습니다. IHC의 모디올라 쪽에 있는 큰 리본에 반대되는 섬유는 구경이 작고 낮은 자발적 속도와 높은 임계값(15)을 갖는다. 낮은 자발적 속도 섬유가 IHCs(15)의 기둥 측에 위치하는 높은 자발적 저역치 섬유보다 소음 노출(10) 및 이독성 약물(16)에 더 취약하다는 증거가 있다.
리본 시냅스의 손실은 달팽이관 신경 연령 관련 청력 손실에서 가장 초기의 퇴행성 사건이며, 나선형 신경절 세포와 구심성 청각 신경 섬유의 손실은17,18보다 뒤쳐집니다. 전기생리학적 상관관계는 청각 뇌간 반응(17) 및 복합 작용 전위(8)의 기록을 포함한다; 그러나, 이들은 시냅스 손실의 미묘함을 반영하지 않는데, 이는 낮은 자발적 속도 섬유가 이들 측정(16)에 기여하지 않기 때문이다. 더 유망한 전기생리학적 메트릭들은 질량 전위-유도 신경 지수(19) 및 주변 자극 시간 응답(20)이다. 그러나, 이들은 동물이 청각 신경 섬유 손실을 넘어 나머지 청각 신경 섬유의 활성에 영향을 미치는 다른 달팽이관 병리가없는 경우에만 신뢰할 수 있습니다8. 또한, 게르빌에서 행동적으로 평가된 역치는 시냅스 번호21과 상관관계가 없었다. 따라서, 생존하는 리본 시냅스의 신뢰할 수 있는 정량화, 따라서, 기능적 청각 신경 섬유의 수는 달팽이관 조직의 직접적인 검사에 의해서만 가능하다.
몽골 게르빌 (Meriones unguiculatus)은 연령과 관련된 청력 손실을 연구하기에 적합한 동물 모델입니다. 수명이 짧고 인간과 비슷한 저주파 청력을 가지며 유지가 쉽고 연령 관련 청력 손실과 관련된 인간 병리와 유사성을 보여줍니다 2,22,23,24. Gerbils는 평균 수명22의 끝 부분에 가까운 36 개월에 도달하면 노화 된 것으로 간주됩니다. 중요하게도, 리본 시냅스의 연령과 관련된 손실은 조용한 환경에서 양육되고 노화 된 게르빌에서 입증되었습니다 8,21.
여기에서는 젊은 성인에서 노인에 이르기까지 다양한 연령대의 게르빌에서 달팽이관을 면역표지, 해부 및 분석하기위한 프로토콜이 제시됩니다. 시냅스 전 (CtBP2), 시냅스 후 글루타메이트 수용체 패치 (GluA2) 및 IHC (myoVIIa)의 성분에 대해 지시된 항체가 사용된다. 노화된 달팽이관의 배경을 감소시키고 형광 신호를 그대로 유지하는 자가형광 소광기가 적용됩니다. 또한, 달팽이관을 해부하여 감각 상피와 선조 혈관을 모두 검사하는 방법에 대한 설명이 제공됩니다. 달팽이관 길이는 특정 최적 주파수(25)에 대응하는 별개의 달팽이관 위치들의 선택을 가능하게 하기 위해 측정된다. 시냅스 수의 정량화는 자유롭게 이용가능한 소프트웨어 ImageJ26으로 수행된다. 개별 HC 내의 시냅스 부피 및 위치의 추가적인 정량화는 Matlab으로 작성된 소프트웨어 커스텀으로 수행됩니다. 이 소프트웨어는 저자가 전문적인 문서 및 지원을 제공 할 수있는 리소스가 부족하기 때문에 공개적으로 사용할 수 없습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V biotin-free</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse)</td>
			<td>BD Biosciences, Eysins</td>
			<td>612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse (IgG1)-AF 488</td>
			<td>Molecular Probes Inc.</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit)</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25e6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade Holder &#38; Breaker - Flat Jaws</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10052-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Artery Scissors - Ball Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LH26.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Surgical Blade</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>0473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti-rabbit (IgG)-AF647</td>
			<td>Life Technologies-Molecular Probes</td>
			<td>A-31573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12468750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8040.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Blade</td>
			<td>PLANO</td>
			<td>112-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G19 Cannula</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9003633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse (IgG2a)-AF568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>N68542.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essentials</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol, Immersion oil 518F</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>10539438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4062957E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISM596D</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KL 1600 LED</td>
			<td>Schott</td>
			<td>150.600</td>
			<td>light source for stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application suite X</td>
			<td>Leica Microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 system</td>
			<td>Leica Microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>The Mathworks Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14512-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-100 Orbital-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-M100</td>
			<td>for use in cold environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narcoren (pentobarbital)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ni-Ei</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Europe B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish without vents</td>
			<td>Avantor VWR</td>
			<td>390-1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31434-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Cap Containers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K305.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Halsted-Mosquito Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91308-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160; X</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors, 3mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrax VXR basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0002819000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>953300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild TYP 355110 (Stereomicroscope)</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td></td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabeling and counting ribbon synapses in young adult and aged gerbil cochleae

내부 모발 세포와 구심성 청각 신경 섬유를 연결하는 리본 시냅스의 손실은 연령 관련 청력 손실의 한 원인으로 간주됩니다. 리본 시냅스의 손실을 검출하는 가장 일반적인 방법은 개별 달팽이관의 여러 토노토픽 위치에서 정량적 샘플링을 허용하기 때문에 면역 표지입니다. 그러나 관심있는 구조는 뼈 달팽이관 깊숙이 묻혀 있습니다. Gerbils는 연령 관련 청력 손실에 대한 동물 모델로 사용됩니다. 여기에서는 고정, 게르빌 달팽이관 전체 마운트, 공초점 이미징 및 리본 시냅스 수 및 부피 정량화를 위한 일상적인 프로토콜이 설명된다. 또한, 귀중한 노화 된 개인으로부터 좋은 재료를 얻는 것과 관련된 특별한 도전이 강조됩니다. 
Gerbils는 안락사되어 심혈관적으로 관류되거나 고막 bullae가 두개골에서 조심스럽게 해부됩니다. 달팽이관은 정점과 기저부에서 열리고 고정제로 직접 옮겨집니다. 초기 방법에 관계없이, 달팽이관은 후고정되고 이후에 탈석회화됩니다. 그런 다음 조직은 시냅스 전후 구조 및 모발 세포에 대한 일차 항체로 표지됩니다. 다음에, 달팽이관은 그들의 각각의 일차 것들에 특이적인 이차 형광 태깅된 항체와 함께 인큐베이션된다. 노화 된 gerbils의 달팽이관은 자기 형광 소광기로 처리되어 오래된 동물 조직의 전형적으로 실질적인 배경 형광을 줄입니다. 
마지막으로, 달팽이관은 6-11 개의 세그먼트로 해부됩니다. 전체 달팽이관 길이는 특정 달팽이관 위치가 개인간에 안정적으로 결정될 수 있도록 재구성됩니다. 순차적으로 획득된 공초점 이미지 스택은 선택한 위치에서 모발 세포와 시냅스를 시각화하는 데 도움이 됩니다. 공초점 스택은 디컨볼루브되고 시냅스는 ImageJ를 사용하여 수동으로 계산되거나 Matlab에서 사용자 정의 작성된 이미지 분석 절차를 사용하여 시냅스 구조의보다 광범위한 정량화가 수행됩니다.

달팽이관은 전체 동물의 고정으로 심혈관 관류 후 수확하거나 동물을 안락사시키고 침지 고정 한 후 신속하게 해부했습니다. 후자의 방법으로, IHCs는 해부 동안 제자리에 머물렀고, 반면, 관류가 실패하여 조직이 불충분하게 고정 된 경우, 감각 상피는 종종 파괴되었습니다. 저자들은 뇌의 고정이 여전히 적절하면서 심질 관류 후 달팽이관의 고정이 불충분 한 경우에 직면했습니다. 열등한 관류로...

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Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

구심성 시냅스 구조 및 모발 세포를 면역표지하고, 노화된 조직에서 자가형광을 담금질하고, 달팽이관의 길이를 해부 및 추정하고, 공초점 영상으로 얻은 이미지 스택에서 시냅스를 정량화함으로써 젊은 성인 및 노인 게르빌 달팽이관을 처리하기 위한 프로토콜이 제시된다.

젊은 성인과 노인 Gerbil Cochleae의 면역 표지 및 카운팅 리본 시냅스

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

이 프로토콜은 모든 연령대의 게르빌 달팽이관에서 시냅스 무결성을 평가할 수있게합니다. 이것은 청력 문제, 특히 노화로 인한 근본적인 연구에 중요합니다. 이 프로토콜은 비교적 빠르며 달팽이관을 따라 여러 위치에서 정량적 데이터를 생성합니다.또한, 자가형광 소광제를 사용함으로써 노화 조직의 특정 문제를 해결한다. 시냅스의 퇴행은 달팽이관에서 기능 상실의 가장 초기 징후입니다. 이를 정량화하는 것은 시냅스 병증을위한 비 침습적 진단 도구를 개발하기위한 연구에서 중요한 도구입니다.달팽이관 해부는 연습이 필요한 가장 중요한 부분이므로 실험적이지 않은 달팽이관으로 시작하는 것이 좋습니다. 불레를 제거하는 것으로 시작하십시오. 가위로 뼈를 자르거나 포셉으로 뼈를 부수고 집게로 제거하여 달팽이관에 도달하십시오.malleus, incus 및 반원형 운하를 제거하십시오. 달팽이관의 꼭대기를 덮고있는 뼈를 조심스럽게 제거하고 포셉으로 달팽이관 뼈를 긁어 정점과 기저 회전에 작은 구멍을 만들거나 조심스럽게 두 위치에 구멍을 뚫습니다. 즉시 bullae를 적어도 50 밀리리터의 차가운 고정제로 옮깁니다.달팽이관을 반으로 자르려면 달팽이관의 코일 길이보다 긴 면도날 조각을 블레이드 홀더에 넣으십시오. 그런 다음 달팽이관을 스테레오 현미경으로 페트리 접시에 넣으십시오. 면도날 또는 미세한 가위로 과도한 조직을 잘라냅니다.달팽이관을 미세한 포셉으로 제자리에 고정시키고 모디올러스를 따라 반으로 자릅니다. 이를 70%에탄올과 혼합하여 자가형광 소광제의 5% 용액을 제조하였다. 이 용액에 달팽이를 넣고 진탕기 상에서 실온에서 일분 동안 인큐베이션한 다음, 다섯 분 동안 PBS 한 밀리리터로 세 번 세척하였다.달팽이관의 해부를 위해 두 개의 미세 포셉, 초미세 포셉, 바나, 스프링 가위, 블레이드 홀더, 면도날을 수집하고 폴리스티롤 페트리 접시와 그 뚜껑을 PBS로 채 웁니다. 면도날에서 조각을 부수어 두 ~ 네 밀리미터의 절단면을 얻습니다. 조직 준비를위한 섹션에 표시된 것처럼 달팽이관을 반으로 자릅니다.인공와우 반쪽을 포셉으로 조심스럽게 고정하여 절단 가장자리가 위쪽을 향하게하십시오. 정점을 덮고있는 헬리코트 리아 위의 달팽이관의 뼈를 자르기 위해 미세한 봄 가위를 사용하십시오. 그런 다음 가위를 사용하여 모디올러스와 청각 신경 및 스칼라 전정을 절단하여 정점 회전을 분리하십시오.위의 달팽이관 뼈의 양쪽에 두 개의 절단을하거나, 추가 평가를 위해 줄무늬 혈관이 필요하지 않은 경우 중간 회전의 선조골 혈관을 통해 직접 절단하십시오. 면도날을 사용하여 달팽이관 조각을 분리하십시오. 또는 코르티 기관과 줄무늬 혈관 사이를 자릅니다.나선형 인대에 연결된 선조골 혈관을 떠나 포셉을 사용하여 석회화 된 뼈를 제거하십시오. 다음으로, 달팽이관 조각을 PBS로 채워진 페트리 접시 뚜껑으로 옮긴다. 기둥과 모디올라 측면의 과도한 조직을 제거하여 나중에 전체 마운트가 가능한 한 평평하게 슬라이드에 놓이도록하십시오.큰 달팽이관 조각, 특히 기저 회전에서 유래 한 조각은 두 조각으로 절단해야합니다. 초미세 포셉으로 지각 막을 조심스럽게 제거하십시오. 달팽이관 조각을 슬라이드 위에 올려 놓고 장착 매체 한 방울에 넣고 코르티 오르간이 위로 향하도록 합니다.달팽이관 조각을 시상면으로 옮기고 내부 모발 세포에 가까운 나선형 사지의 질내 삽입을 찾으십시오. 나선형 림푸스의이 질은 중간 및 기저 달팽이관 조각에서보다 명확하게 볼 수 있습니다. 전체 달팽이관과 전체 선조체 혈관을 이러한 단계를 반복하여 현미경 슬라이드 상에 옮깁니다.덮개는 슬라이드를 미끄러 뜨리고 밀봉을 위해 가장자리 주위에 검은 매니큐어를 추가합니다. 어둠 속에서 말리고 섭씨 네 도에 보관하십시오. BioVoxxel 플러그인으로로드 된 ImageJ 소프트웨어에서 deconvolved 스택의 사본을 엽니 다.이미지, 색상, 채널 분할을 차례로 클릭하여 채널을 분할합니다. 이미지, 색상 등을 클릭한 다음 채널 병합을 클릭하여 서로 다른 색상을 할당하여 병합합니다. 이미지를 클릭하여 이미지를 RGB 스택으로 변환 한 다음 색상으로 이동하여 RGB로 스택을 클릭하십시오.이미지, 조정 및 밝기/대비를 클릭하여 밝기와 대비를 조정합니다. 자동 또는 슬라이더를 사용하여 시냅스 전후 구조와 내부 모발 세포 레이블이 배경과 구별되는지 확인합니다. 스택 내의 원하는 위치를 클릭하여 텍스트 도구로 다섯 개의 내부 모발 셀에 레이블을 지정합니다.그런 다음 분석, 도구로 이동하여 ROI 관리자를 선택합니다. 체크 박스 레이블을 선택하여 점으로 숫자에 레이블을 지정합니다. 관심 있는 내부 모발 세포를 확대합니다.점 도구를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 다중 점 모드를 선택합니다. Z 차원을 스크롤하고 시냅스 후 글루타메이트 패치와 병치된 사전 시냅스 리본으로 식별되는 기능 리본 시냅스를 계산합니다. 관심있는 모든 구조를 선택한 후 ROI 관리자 추가를 클릭 한 다음 임의의 이름을 클릭하고 이름 바꾸기를 선택하십시오.손 도구를 사용하여 이미지를 조정하여 다음 내부 헤어 셀을 완전히 표시합니다. 다중 점 도구에서 점 도구로 변경하여 이전에 저장된 데이터에 더 많은 누점이 추가되지 않도록 합니다. 다음 내부 헤어 셀 내에서 관심있는 구조를 클릭하고 멀티 포인트 도구로 변경하십시오.모든 내부 모발 세포가 평가될 때까지 ROI Manager에서 기능성 리본 시냅스를 계속 추가합니다. ROI 관리자에서 데이터 세트를 클릭한 다음 측정을 클릭합니다. 측정된 데이터 요소를 나열하는 새 창이 나타날 때까지 기다렸다가 파일 및 다른 이름으로 저장을 클릭하여 이 목록을 스프레드시트로 저장합니다.ROI 관리자에서 모두 표시를 활성화하여 이미지를 저장합니다. Flatten을 클릭하여 포인트 레이블을 스택에 영구적으로 추가하고 동의를 클릭하여 변경 사항을 저장하여 닫으십시오. 10 개월 된 젊은 게르빌의 달팽이관에서 Z 스택 돌출부는 흰색 점선으로 윤곽이 그려진 미오신 7A 표지 된 내부 모발 세포가 배경과 뚜렷한 대조를 이룬 것으로 나타났습니다.시냅스 전 리본은 녹색으로 표시된 항-CtBP2 2개로 표지되었고, 시냅스 후 글루타메이트 패치는 적색으로 표시된 항-GluA2로 표지되었다. 38 개월 된 오래된 게르빌에서 달팽이관은 자기 형광 소광기로 처리되었으며 시냅스 전후 구조를 명확하게 볼 수있는 뚜렷한 내부 모발 세포를 보여주었습니다. 면역 표지의 안정성을 시험하기 위해, 어린 게르빌에서 달팽이관의 동일한 조각을 석 달 및 29 1/2 개월 후에 이미징했다.감소된 신호 대 잡음비에도 불구하고, 기능적 시냅스는 뚜렷하고 정량화될 수 있었다. 절단이 실패하더라도 나머지 조직 조각을 장착하여 나중에 전체 달팽이관 길이를 가장 정확하게 추정하십시오. 이 프로토콜의 데이터는 전기 생리학 또는 정신 물리학 적 청력 검사와 개별적으로 상관 관계가 있고 그 전에 특히 유용합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Kinematics and Ground Reaction Force Determination: A Demonstration Quantifying Locomotor Abilities of Young Adult, Middle-aged, and Geriatric Rats

운동학 및 그라운드 반력 결정 : 젊은 성인, 중년과 노인 쥐의 데모 Quantifying 운전하는 능력

Behavior, in its broadest definition, can be defined as the motor manifestation of physiologic processes.  As such, all behaviors manifest through the ...

연구

신경과학

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

세 Parkinsonian 쥐의 초음파 Vocalizations의 타겟 트레이닝

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

3D 이미징 및 형태학의 분석을위한 성인 마우스 뇌혈관 캐스팅

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

하는 세포 칼슘의 형광 및 생물 발광 영상<sup&gt; 2 +</sup&gt; 노인 해마 신경 세포에서

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고해상도 양이 Immunogold 분석

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Optogenetic 및 동결 골절 복제 Immunolabeling는 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특정 배열을 검사하기 위해 결합

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

드로소필라 멜라노가스터에서 축사 사망 시축과 시냅스의 형태학적 및 기능적 평가

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

성인 프레리 볼레스의 신경질성 틈새에서 파생된 신경구 의 문화

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...