Name: immunolabeling and counting ribbon synapses in young adult and aged gerbil cochleae
Uploaded: 2022-04-21T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner Lichun Zhang for å bidra til å etablere metoden og Fluorescence Microscopy Service Unit, Carl von Ossietzky University of Oldenburg, for bruk av bildeanleggene. Denne forskningen ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy -EXC 2177/1.

Alle protokoller og prosedyrer ble godkjent av relevante myndigheter i Niedersachsen, Tyskland, med tillatelsesnummer AZ 33.19-42502-04-15/1828 og 33.19-42502-04-15/1990. Denne protokollen er for mongolske gerbils (M. unguiculatus) av begge kjønn. Ung voksen refererer til en alder av 3-12 måneder, mens gerbils anses å være 36 måneder og eldre. Når det ikke er oppgitt noe annet, kan buffere og løsninger tilberedes og lagres i kjøleskapet i opptil flere måneder (4-8 °C). Før bruk må du forsikre deg om ...

<ol>
	<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+and+age-related+hearing+loss:+new+perspectives+and+potential+therapies+[version+1;+peer+review.">Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review.</a> F1000Research. 6 (927), (2017).</li><li>Heeringa, A. N., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+cochlea:+Towards+unraveling+the+functional+contributions+of+strial+dysfunction+and+synaptopathy.">The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy.</a> Hearing. 376, 111-124 (2019).</li><li>Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+gradients+of+ribbon+size+and+AMPA+receptor+expression+underlie+sensitivity+differences+among+cochlear-nerve/hair-cell+synapses.">Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).</li><li>Khimich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+synaptic+ribbons+are+essential+for+synchronous+auditory+signalling.">Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling.</a> Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).</li><li>Pangr&#353;i&#269;, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+requires+otoferlin-dependent+efficient+replenishment+of+synaptic+vesicles+in+hair+cells.">Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells.</a> Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).</li><li>Meyer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+synapse+number,+structure+and+function+in+the+cochlea.">Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea.</a> Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).</li><li>Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+gradients+of+ribbon+volume+and+AMPA-receptor+patch+volume+in+cochlear+afferent+synapses+on+gerbil+inner+hair+cells.">Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells.</a> Hearing Research. 364, 81-89 (2018).</li><li>Steenken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decline+in+cochlear+ribbon+synapses+and+its+relation+to+different+metrics+of+auditory-nerve+activity.">Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity.</a> Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).</li><li>Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+differences+among+afferent+synapses+on+cochlear+hair+cells:+Correlations+with+spontaneous+discharge+rate.">Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate.</a> Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olivocochlear+innervation+maintains+the+normal+modiolar-pillar+and+habenular-cuticular+gradients+in+cochlear+synaptic+morphology.">Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).</li><li>Reijntjes, D. O. J., K&#246;ppl, C., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+gradients+in+inner+hair+cell-auditory+nerve+fiber+pre-+and+postsynaptic+proteins+differ+across+mouse+strains.">Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains.</a> Hearing Research. 390, 107933 (2020).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve.">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li><li>Bourien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+auditory+nerve+fibers+to+compound+action+potential+of+the+auditory+nerve.">Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+An+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Batrel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+potentials+recorded+at+the+round+window+enable+the+detection+of+low+spontaneous+rate+fibers+in+gerbil+auditory+nerve.">Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).</li><li>Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -. L., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+hearing+loss+in+gerbil:+Round+window+assays+of+synapse+loss.">Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).</li><li>Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+auditory+thresholds+and+loss+of+ribbon+synapses+at+inner+hair+cells+in+aged+gerbils.">Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils.</a> Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).</li><li>Cheal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gerbil:+A+unique+model+for+research+on+aging.">The gerbil: A unique model for research on aging.</a> Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).</li><li>Gates, G. A., Mills, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presbycusis.">Presbycusis.</a> The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).</li><li>Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+sensitivity+of+the+gerbil,+Meriones+unguiculatis.">Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li><li>M&#252;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+place-frequency+map+of+the+adult+and+developing+gerbil.">The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+intact+rodent+organ+of+Corti+for+RNAscope+and+immunolabeling,+confocal+microscopy,+and+quantitative+analysis.">Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).</li><li>Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+migration+and+reorganization+after+noise+exposure+suggests+regeneration+in+a+mature+mammalian+cochlea.">Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).</li><li>Gray, D. A., Woulfe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+and+aging:+a+matter+of+toxic+waste.">Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste.</a> Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).</li><li>Li, H. -. S., Hultcrantz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+degeneration+of+the+organ+of+Corti+in+two+genotypes+of+mice.">Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice.</a> ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).</li><li>Kobrina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+anatomical+and+physiological+markers+of+auditory+system+degeneration+with+behavioral+hearing+assessments+in+a+mouse+(Mus+musculus)+model+of+age-related+hearing+loss.">Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss.</a> Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).</li><li>Moreno-Garc&#237;a, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+role+of+lipofuscin+in+age-related+neurodegeneration.">An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).</li><li>Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+myocardial+tissue+with+digital+autofluorescence+microscopy.">Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy.</a> Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).</li><li>Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+gradients+in+the+size+of+inner+hair+cell+ribbons+emerge+before+the+onset+of+hearing+in+rats.">Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).</li><li>Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neural+degeneration+in+the+human+cochlea:+Evidence+for+hidden+hearing+loss+in+the+aging+ear.">Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear.</a> Neuroscience. 407, 8-20 (2019).</li></ol>

Med metoden som er skissert i denne protokollen, er det mulig å immunolabel IHCer og synaptiske strukturer i cochlea fra unge voksne og eldre gerbils, identifisere antatt funksjonelle synapser ved samlokalisering av pre- og postsynaptiske elementer, tildele dem til individuelle IHCer og kvantifisere antall, volum og plassering. Antistoffene som brukes i denne tilnærmingen merket også ytre hårceller (OHCer, myoVIIa) og deres presynaptiske bånd. Videre er et levedyktig alternativ for immunolmering av både IHCer og O...

Aldersrelatert hørselstap er en av verdens mest utbredte sykdommer som rammer mer enn en tredjedel av verdens befolkning i alderen 65 år og eldre1 år. De underliggende årsakene er fortsatt under debatt og aktivt undersøkes, men kan omfatte tap av spesialiserte synapser som forbinder indre hårceller (IHCer) med afferent auditive nervefibre2. Disse båndsynapsene består av en presynaptisk struktur som har vesicles fylt med nevrotransmitterglutamat bundet til den, samt postsynaptiske α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) glutamatreseptorer 3,4,5. I gerbil, ~ 20 afferent auditive nervefibre kontakt en IHC 6,7,8. Fibre på IHC vendt mot modiolus er imot store synaptiske bånd, mens fibrene som forbinder på søylesiden av IHC står overfor små synaptiske bånd (dvs. hos katter9, gerbils7, marsvin10 og mus 3,11,12,13,14). Videre, i gerbil, er størrelsen på presynaptiske bånd og postsynaptiske glutamatplaster positivt korrelert 7,14. Fibre som er imot store bånd på modiolarsiden av IHC er små i kaliber og har lave spontane priser og høye terskler15. Det er bevis på at lav spontan hastighetsfibre er mer sårbare for støyeksponering10 og ototoksiske legemidler16 enn høy-spontane lavterskelfibre, som ligger på søylesiden av IHCer15.
Tapet av båndsynapser er den tidligste degenerative hendelsen i cochlea nevral aldersrelatert hørselstap, mens tapet av spiral ganglionceller og deres afferent auditive nervefibre henger etter17,18. Elektrofysiologiske korrelasjoner inkluderer opptak av auditive hjernestammeresponser17 og sammensatte virkningspotensialer8; Disse gjenspeiler imidlertid ikke finesser av synapsetap, siden lav spontane hastighetsfibre ikke bidrar til disse tiltakene16. Mer lovende elektrofysiologiske beregninger er den massepotensial-avledede nevrale indeksen19 og peristimulus tidsrespons20. Disse er imidlertid bare pålitelige hvis dyret ikke har andre cochleapatologier, utover auditivt nervefibertap, som påvirker aktiviteten til de resterende auditive nervefibrene8. Videre var atferdsvurderte terskler i gerbil ikke korrelert med synapsetall21. Derfor er pålitelig kvantifisering av overlevende båndsynapser og dermed antall funksjonelle hørselsnervefibre bare mulig ved direkte undersøkelse av cochleavevet.
Den mongolske gerbil (Meriones unguiculatus) er en egnet dyremodell for å studere aldersrelatert hørselstap. Den har en kort levetid, har lavfrekvent hørsel som ligner på mennesker, er lett å vedlikeholde og viser likheter med menneskelige patologier relatert til aldersrelatert hørselstap 2,22,23,24. Gerbils regnes som alderen når de når 36 måneder, som er nær slutten av deres gjennomsnittlige levetid22. Viktigst, et aldersrelatert tap av båndsynapser har blitt demonstrert hos gerbils oppdratt og alderen i stille omgivelser 8,21.
Her presenteres en protokoll for immunolabel, dissekering og analyse av cochlea fra gerbils i forskjellige aldre, fra unge voksne til eldre. Antistoffer rettet mot komponenter i presynapsen (CtBP2), postsynaptiske glutamatreseptorplaster (GluA2) og IHCer (myoVIIa) brukes. En autofluorescence quencher påføres som reduserer bakgrunnen i alderen cochlea og lar fluorescenssignalet være intakt. Videre er det gitt en beskrivelse av hvordan man dissekerer cochlea for å undersøke både sensorisk epitel og stria vaskulærris. Cochlealengden måles for å muliggjøre valg av distinkte cochlea-lokasjoner som tilsvarer spesifikke beste frekvenser25. Kvantifisering av synapsenumre utføres med den fritt tilgjengelige programvaren ImageJ26. Ytterligere kvantifisering av synapsevolumer og steder innenfor den enkelte HC utføres med programvare tilpasset skrevet i Matlab. Denne programvaren er ikke gjort offentlig tilgjengelig, da forfatterne mangler ressurser til å gi profesjonell dokumentasjon og støtte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V biotin-free</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse)</td>
			<td>BD Biosciences, Eysins</td>
			<td>612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse (IgG1)-AF 488</td>
			<td>Molecular Probes Inc.</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit)</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25e6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade Holder &#38; Breaker - Flat Jaws</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10052-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Artery Scissors - Ball Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LH26.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Surgical Blade</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>0473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti-rabbit (IgG)-AF647</td>
			<td>Life Technologies-Molecular Probes</td>
			<td>A-31573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12468750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8040.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Blade</td>
			<td>PLANO</td>
			<td>112-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G19 Cannula</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9003633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse (IgG2a)-AF568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>N68542.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essentials</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol, Immersion oil 518F</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>10539438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4062957E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISM596D</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KL 1600 LED</td>
			<td>Schott</td>
			<td>150.600</td>
			<td>light source for stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application suite X</td>
			<td>Leica Microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 system</td>
			<td>Leica Microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>The Mathworks Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14512-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-100 Orbital-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-M100</td>
			<td>for use in cold environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narcoren (pentobarbital)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ni-Ei</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Europe B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish without vents</td>
			<td>Avantor VWR</td>
			<td>390-1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31434-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Cap Containers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K305.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Halsted-Mosquito Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91308-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160; X</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors, 3mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrax VXR basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0002819000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>953300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild TYP 355110 (Stereomicroscope)</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td></td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabeling and counting ribbon synapses in young adult and aged gerbil cochleae

Tapet av båndsynapser som forbinder indre hårceller og afferent auditive nervefibre antas å være en årsak til aldersrelatert hørselstap. Den vanligste metoden for å oppdage tap av båndsynapser er immunolabeling fordi det gir mulighet for kvantitativ prøvetaking fra flere tonotopiske steder i en individuell cochlea. Imidlertid er strukturene av interesse begravet dypt inne i den benete cochlea. Gerbils brukes som dyremodell for aldersrelatert hørselstap. Her beskrives rutinemessige protokoller for fiksering, immunolabeling av gerbil cochlear whole mounts, confocal imaging og kvantifisering av synapsetall og volumer på båndet. Videre fremheves de spesielle utfordringene knyttet til å skaffe godt materiale fra verdifulle aldrende individer. 
Gerbils er euthanized og enten perfused kardiovaskulært, eller deres tympaniske bullae er forsiktig dissekert ut av skallen. Cochlea åpnes ved apex og base og overføres direkte til fikseringsmiddelet. Uavhengig av den opprinnelige metoden, blir cochlea postfixed og deretter avkalket. Vevet merkes deretter med primære antistoffer mot pre- og postsynaptiske strukturer og hårceller. Deretter inkuberes cochlea med sekundære fluorescensmerkede antistoffer som er spesifikke mot deres respektive primære. Cochlea av eldre gerbils blir deretter behandlet med en autofluorescence quencher for å redusere den typisk betydelige bakgrunnsfluorescensen av eldre dyrs vev. 
Til slutt dissekeres cochlea i 6-11 segmenter. Hele cochlealengden rekonstrueres slik at spesifikke cochleasteder kan bestemmes pålitelig mellom individer. Confocal bilde stabler, anskaffet sekvensielt, bidra til å visualisere hårceller og synapser på de valgte stedene. De konfomiske stablene er dekonvolverte, og synapsene telles enten manuelt ved hjelp av ImageJ, eller mer omfattende kvantifisering av synaptiske strukturer utføres med bildeanalyseprosedyrer som er spesialskrevet i Matlab.

Cochlea ble enten høstet etter kardiovaskulær perfusjon med fiksering av hele dyret eller raskt dissekert etter euthanizing dyret og nedsenkningsfast. Med sistnevnte metode holdt IHCene seg på plass under disseksjonen, mens i tilfeller av mislykket perfusjon og dermed utilstrekkelig fast vev, ble det sensoriske epitelet ofte ødelagt. Legg merke til at forfatterne opplevde tilfeller der fiksering av cochlea etter transkardiell perfusjon ikke var tilstrekkelig mens fiksering av hjernen fortsatt var tilstrekkelig. Vev f...

Watch this Scientific Journal Video about Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae at JoVE.com

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

En protokoll for behandling av unge voksne og aldrende gerbil cochlea ved å immunmerke de afferent synaptiske strukturer og hårceller, slukke autofluorescence i alderen vev, dissekere og estimere lengden på cochlea, og kvantifisere synapsene i bildestakker oppnådd med konfokal avbildning presenteres.

Immunolabeling og telling bånd synapser i ung voksen og alderen Gerbil Cochleae

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

Denne protokollen muliggjør evaluering av synaptisk integritet i cochlea av gerbil i alle aldre. Dette er viktig for grunnleggende forskning på hørselsproblemer, spesielt på grunn av aldring. Protokollen er relativt rask og gir kvantitative data fra flere steder langs cochlea.Videre adresserer det et bestemt problem med aldring vev ved hjelp av en autofluorescence quencher. Degenerasjon av synapser er det tidligste tegn på tap av funksjon i cochlea. Kvantifisere det er et viktig verktøy i forskning mot å utvikle ikke-invasive diagnostiske verktøy for synaptopati.Cochlear disseksjonen er den viktigste delen som trenger praksis, så det er bedre å starte med ikke-eksperimentell cochli. Begynn med å fjerne bullae. Klipp beinet med saks eller knekk beinet med tang og fjern det med tang for å nå cochlea.Fjern malleus, incus og halvcirkelformede kanaler. Fjern forsiktig benet som dekker toppen av cochlea og riper cochleabenet med tang for å lage små hull på toppen og i basal sving eller forsiktig stikke hull på begge steder. Overfør umiddelbart bullae til minst 50 milliliter kaldt fikseringsmiddel.For å kutte cochli i halvparten, plasser et stykke barberblad lenger enn den spolede lengden på cochlea i en bladholder. Plasser deretter cochlea i en Petri-tallerken under et stereomikroskop. Klipp bort overflødig vev med et barberblad eller med fin saks.Hold cochlea på plass med fine tang og kutt i halvparten langs modiolusen. Forbered en 5% løsning av autofluorescence quencher ved å blande den med 70% etanol. Plasser cochli i denne løsningen og inkuber den i ett minutt ved romtemperatur på en shaker etterfulgt av vask tre ganger med en milliliter PBS i fem minutter.For disseksjon av cochlea, samle to fine tang, super-fine tang, vannas, vår saks, en bladholder, et barberblad, og fyll polystyrol Petri parabolen og lokket med PBS. Bryt stykker fra barberbladet for å oppnå en skjæreflate på to til fire millimeter. Klipp cochlea i halvparten som vist i delen for vevsforberedelse.Fest cochleahalvdelen forsiktig med tang slik at kuttkanten vender oppover. Bruk fin vår saks for å kutte bort beinet av cochlea over helicotrema dekker apex. Bruk deretter saks for å isolere den apikale svingen ved å kutte gjennom modiolus og auditiv nerve og scala vestibuli.Lag to kutt på hver side av cochleabenet ovenfor, eller hvis stria vaskulærris ikke er nødvendig for videre evaluering, direkte gjennom stria vaskulærris i midtsvingen. Bruk barberbladet til å skille cochleastykkene. Alternativt kan du kutte mellom Organ of Corti og stria vascularis.La stria vaskulærris koblet til spiral ligament og fjerne dekalcified bein ved hjelp av tang. Deretter overfører du cochleastykkene til et Petri-parabollokk fylt med PBS. Fjern overflødig vev på søylen og modiolarsidene slik at hele monteringene senere vil ligge på lysbildet så flatt som mulig.Store cochlea stykker, spesielt de som stammer fra basal sving, bør kuttes i to stykker. Fjern forsiktig tectorialmembranen med superfine tang. Plasser cochleastykkene på et glid inn i en dråpe monteringsmedium, og sørg for at Organ of Corti vender opp.Flytt cochleastykket inn i sagittalplanet og se etter invaginering av spirallembussen i nærheten av de indre hårcellene. Denne invaginasjonen av spirallembussen kan ses tydeligere i de midterste og basale cochleastykkene. Overfør hele cochlea og hele stria vascularis på mikroskopet lysbilde ved å gjenta disse trinnene.Dekk slip lysbildet og legg svart neglelakk rundt kantene for tetting. Tørk i mørket og lagre dem på fire grader Celsius. Åpne en kopi av de dekonvolverte stablene i ImageJ-programvare lastet med BioVoxxel-plugin.Del kanalene ved å klikke på Bilde, deretter Farge og deretter Del kanaler. Slå dem sammen ved å klikke på Bilde, deretter Farge, og deretter Slå sammen kanaler for å tilordne forskjellige farger. Konverter bildet til en RGB-stakk ved å klikke på Bilde, gå deretter til Farge og klikk Stable til RGB.Juster lysstyrken og kontrasten ved å klikke på Bilde, Juster og deretter Lysstyrke/kontrast. Bruk enten automatisk eller glidebryter for å sikre at pre- og postsynaptiske strukturer og de indre hårcelleetikettene er forskjellige fra bakgrunnen. Merk fem indre hårceller med tekstverktøyet ved å klikke på ønsket sted i stabelen.Deretter går du til Analyser, deretter Verktøy og velger ROI Manager. Merk av i avmerkingsboksetikettene for å merke punktene med et tall. Zoom inn på den indre hårcellen av interesse.Høyreklikk på punktverktøyet for å velge Flerpunktsmodus. Bla gjennom Z-dimensjonen og tell de funksjonelle båndsynapsene, som identifiseres av et presynaptisk bånd i sammenstilling til en postsynaptisk glutamatplaster. Etter å ha valgt alle strukturene av interesse, klikker du på Legg til ROI Manager, klikker deretter på det vilkårlige navnet og velger Gi nytt navn.Med håndverktøyet justerer du bildet for å vise den neste indre hårcellen fullstendig. Bytt fra flerpunktsverktøy til punktverktøy for å unngå å legge til mer puncta i de tidligere lagrede dataene. Klikk på en struktur av interesse i neste indre hårcelle og bytt til Multi-point verktøy.Fortsett å legge til det funksjonelle båndet synapse i ROI Manager til alle de indre hårcellene er evaluert. Klikk på et datasett i ROI Manager og deretter på Mål. Vent til det vises et nytt vindu som viser de målte datapunktene, og klikk Fil og Lagre som for å lagre denne listen som et regneark.Lagre bildet ved å aktivere Vis alle i ROI Manager. Klikk På Slå sammen for å legge til punktetikettene permanent i stabelen og klikk på Godta for å lukke ved å lagre endringene. Z stack projeksjoner fra cochlea av en ung gerbil i alderen 10 måneder viser at myosin 7A-merkede indre hårceller skissert her av hvite stiplede linjer var i skarp kontrast til bakgrunnen.De presynaptiske båndene ble merket med anti-CtBP2 to vist i grønt, mens de postsynaptiske glutamatplastene ble merket med anti-GluA2 vist i rødt. Cochlea fra en gammel gerbil i alderen 38 måneder ble behandlet med autofluorescence quencher og viste tydelige indre hårceller med tydelig synlige pre-og postsynaptiske strukturer. For å teste stabiliteten til immunolabelingen ble det samme cochleastykket fra den unge gerbil avbildet etter tre måneder og 29 1/2 måneder.Til tross for det reduserte signal-til-støy-forholdet, var de funksjonelle synapsene distinkte og kvantifiserbare. Selv om et kutt svikter, monterer du det gjenværende vevet for senere å estimere hele cochlealengden mest nøyaktig. Dataene fra denne protokollen er spesielt verdifulle hvis de innledes av, og deretter individuelt korrelert med elektrofysiologiske eller psykofysiske hørselstester.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Kinematics and Ground Reaction Force Determination: A Demonstration Quantifying Locomotor Abilities of Young Adult, Middle-aged, and Geriatric Rats

Behavior, in its broadest definition, can be defined as the motor manifestation of physiologic processes.  As such, all behaviors manifest through the ...

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Cerebrovaskulær Støping av Adult Mouse for 3D Imaging og morfologisk analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hele Mount immunolabeling av olfactory Receptor nevroner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescens og Bioluminesens Imaging av subcellulære Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; I Aged hippocampus nevroner

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Høy oppløsning Kvantitativ immungull Analyse av membranreseptorer på retina Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Kombinert optogenetic og Freeze-brudd Replica Immunolabeling å undersøke Input-spesifikke Tilrettelegging av glutamatreseptorer i Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Morfologiske og funksjonell evaluering av Ribbon synapser på spesifikke frekvens regioner av Mouse cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Morfologisk og funksjonell evaluering av axoner og deres synapser under Axon Death i Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Kultur av neurosfærer avledet fra nevrogene nisjer i Voksen Prairie Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...