Name: immunolabeling and counting ribbon synapses in young adult and aged gerbil cochleae
Uploaded: 2022-04-21T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae at JoVE.com

Los autores reconocen a Lichun Zhang por ayudar a establecer el método y a la Unidad de Servicio de Microscopía de Fluorescencia, Universidad Carl von Ossietzky de Oldenburg, para el uso de las instalaciones de imágenes. Esta investigación fue financiada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania -EXC 2177/1.

Todos los protocolos y procedimientos fueron aprobados por las autoridades competentes de Baja Sajonia, Alemania, con los números de permiso AZ 33.19-42502-04-15/1828 y 33.19-42502-04-15/1990. Este protocolo es para jerbos mongoles (M. unguiculatus) de ambos sexos. Adulto joven se refiere a la edad de 3-12 meses, mientras que los jerbos se consideran de 36 meses o más. Cuando no se indique lo contrario, los tampones y las soluciones se pueden preparar y almacenar en el refrigerador hasta por varios meses (4-8 ...

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	<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+and+age-related+hearing+loss:+new+perspectives+and+potential+therapies+[version+1;+peer+review.">Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review.</a> F1000Research. 6 (927), (2017).</li><li>Heeringa, A. N., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+cochlea:+Towards+unraveling+the+functional+contributions+of+strial+dysfunction+and+synaptopathy.">The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy.</a> Hearing. 376, 111-124 (2019).</li><li>Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+gradients+of+ribbon+size+and+AMPA+receptor+expression+underlie+sensitivity+differences+among+cochlear-nerve/hair-cell+synapses.">Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).</li><li>Khimich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+synaptic+ribbons+are+essential+for+synchronous+auditory+signalling.">Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling.</a> Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).</li><li>Pangr&#353;i&#269;, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+requires+otoferlin-dependent+efficient+replenishment+of+synaptic+vesicles+in+hair+cells.">Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells.</a> Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).</li><li>Meyer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+synapse+number,+structure+and+function+in+the+cochlea.">Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea.</a> Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).</li><li>Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+gradients+of+ribbon+volume+and+AMPA-receptor+patch+volume+in+cochlear+afferent+synapses+on+gerbil+inner+hair+cells.">Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells.</a> Hearing Research. 364, 81-89 (2018).</li><li>Steenken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decline+in+cochlear+ribbon+synapses+and+its+relation+to+different+metrics+of+auditory-nerve+activity.">Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity.</a> Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).</li><li>Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+differences+among+afferent+synapses+on+cochlear+hair+cells:+Correlations+with+spontaneous+discharge+rate.">Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate.</a> Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olivocochlear+innervation+maintains+the+normal+modiolar-pillar+and+habenular-cuticular+gradients+in+cochlear+synaptic+morphology.">Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).</li><li>Reijntjes, D. O. J., K&#246;ppl, C., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+gradients+in+inner+hair+cell-auditory+nerve+fiber+pre-+and+postsynaptic+proteins+differ+across+mouse+strains.">Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains.</a> Hearing Research. 390, 107933 (2020).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve.">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li><li>Bourien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+auditory+nerve+fibers+to+compound+action+potential+of+the+auditory+nerve.">Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+An+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Batrel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+potentials+recorded+at+the+round+window+enable+the+detection+of+low+spontaneous+rate+fibers+in+gerbil+auditory+nerve.">Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).</li><li>Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -. L., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+hearing+loss+in+gerbil:+Round+window+assays+of+synapse+loss.">Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).</li><li>Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+auditory+thresholds+and+loss+of+ribbon+synapses+at+inner+hair+cells+in+aged+gerbils.">Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils.</a> Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).</li><li>Cheal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gerbil:+A+unique+model+for+research+on+aging.">The gerbil: A unique model for research on aging.</a> Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).</li><li>Gates, G. A., Mills, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presbycusis.">Presbycusis.</a> The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).</li><li>Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+sensitivity+of+the+gerbil,+Meriones+unguiculatis.">Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li><li>M&#252;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+place-frequency+map+of+the+adult+and+developing+gerbil.">The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+intact+rodent+organ+of+Corti+for+RNAscope+and+immunolabeling,+confocal+microscopy,+and+quantitative+analysis.">Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).</li><li>Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+migration+and+reorganization+after+noise+exposure+suggests+regeneration+in+a+mature+mammalian+cochlea.">Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).</li><li>Gray, D. A., Woulfe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+and+aging:+a+matter+of+toxic+waste.">Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste.</a> Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).</li><li>Li, H. -. S., Hultcrantz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+degeneration+of+the+organ+of+Corti+in+two+genotypes+of+mice.">Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice.</a> ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).</li><li>Kobrina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+anatomical+and+physiological+markers+of+auditory+system+degeneration+with+behavioral+hearing+assessments+in+a+mouse+(Mus+musculus)+model+of+age-related+hearing+loss.">Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss.</a> Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).</li><li>Moreno-Garc&#237;a, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+role+of+lipofuscin+in+age-related+neurodegeneration.">An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).</li><li>Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+myocardial+tissue+with+digital+autofluorescence+microscopy.">Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy.</a> Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).</li><li>Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+gradients+in+the+size+of+inner+hair+cell+ribbons+emerge+before+the+onset+of+hearing+in+rats.">Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).</li><li>Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neural+degeneration+in+the+human+cochlea:+Evidence+for+hidden+hearing+loss+in+the+aging+ear.">Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear.</a> Neuroscience. 407, 8-20 (2019).</li></ol>

Con el método descrito en este protocolo, es posible inmunoetiquetar IHC y estructuras sinápticas en cócleas de jerbos adultos jóvenes y envejecidos, identificar presuntas sinapsis funcionales mediante la colocalización de elementos pre y postsinápticos, asignarlos a IHC individuales y cuantificar su número, volumen y ubicación. Los anticuerpos utilizados en este enfoque también etiquetaron las células ciliadas externas (OHC; myoVIIa) y sus cintas presinápticas. Además, una alternativa viable para el inmunoe...

La pérdida de audición relacionada con la edad es una de las enfermedades más prevalentes del mundo que afecta a más de un tercio de la población mundial de 65 años o más1. Las causas subyacentes aún están en debate y se están investigando activamente, pero pueden incluir la pérdida de las sinapsis especializadas que conectan las células ciliadas internas (IHC) con las fibras nerviosas auditivas aferentes2. Estas sinapsis de cinta comprenden una estructura presináptica que tiene vesículas llenas del neurotransmisor glutamato atado a ella, así como receptores postsinápticos de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico (AMPA) glutamato 3,4,5. En el jerbo, ~ 20 fibras nerviosas auditivas aferentes entran en contacto con un IHC 6,7,8. Las fibras en el IHC frente al modiolus se oponen a las cintas sinápticas grandes, mientras que las fibras que se conectan en el lado del pilar del IHC se enfrentan a pequeñas cintas sinápticas (es decir, en gatos9, jerbos7, conejillos de indias10 y ratones 3,11,12,13,14). Además, en el jerbo, el tamaño de las cintas presinápticas y los parches de glutamato postsináptico se correlacionan positivamente 7,14. Las fibras que se oponen a las cintas grandes en el lado modiolar de la IHC son de calibre pequeño y tienen bajas tasas espontáneas y umbrales altos15. Existe evidencia de que las fibras de baja tasa espontánea son más vulnerables a la exposición al ruido10 y a los fármacos ototóxicos16 que las fibras de bajo umbral altamente espontáneas, que se encuentran en el lado del pilar de los IHC15.
La pérdida de sinapsis de cinta es el evento degenerativo más temprano en la pérdida auditiva relacionada con la edad neuronal coclear, mientras que la pérdida de células ganglionares espirales y sus fibras nerviosas auditivas aferentes se queda atrásde 17,18. Los correlatos electrofisiológicos incluyen registros de respuestas auditivas del tronco encefálico17 y potenciales de acción compuesto8; sin embargo, estos no reflejan las sutilezas de la pérdida de sinapsis, ya que las fibras de baja tasa espontánea no contribuyen a estas medidas16. Las métricas electrofisiológicas más prometedoras son el índice neuronal derivado del potencial de masa19 y la respuesta de tiempo periestímulo20. Sin embargo, estos solo son confiables si el animal no tiene otras patologías cocleares, más allá de la pérdida de fibras nerviosas auditivas, que afecten la actividad de las fibras nerviosas auditivas restantes8. Además, los umbrales evaluados conductualmente en el jerbo no se correlacionaron con los números de sinapsis21. Por lo tanto, la cuantificación confiable de las sinapsis de cinta sobrevivientes y, por lo tanto, el número de fibras nerviosas auditivas funcionales solo es posible mediante el examen directo del tejido coclear.
El jerbo mongol (Meriones unguiculatus) es un modelo animal adecuado para estudiar la pérdida auditiva relacionada con la edad. Tiene una vida útil corta, tiene audición de baja frecuencia similar a la humana, es fácil de mantener y muestra similitudes con patologías humanas relacionadas con la pérdida auditiva relacionada con la edad 2,22,23,24. Los jerbos se consideran envejecidos cuando alcanzan los 36 meses de edad, que está cerca del final de su vida útil promedio22. Es importante destacar que se ha demostrado una pérdida de sinapsis de cinta relacionada con la edad en jerbos criados y envejecidos en ambientes tranquilos 8,21.
Aquí, se presenta un protocolo para inmunoetiquetar, diseccionar y analizar cócleas de jerbos de diferentes edades, desde adultos jóvenes hasta ancianos. Se utilizan anticuerpos dirigidos contra componentes del presinaptaso (CtBP2), parches de receptores de glutamato postsinápticos (GluA2) y IHC (myoVIIa). Se aplica un silenciador de autofluorescencia que reduce el fondo en las cócleas envejecidas y deja intacta la señal de fluorescencia. Además, se da una descripción de cómo diseccionar la cóclea para examinar tanto el epitelio sensorial como la estría vascular. La longitud coclear se mide para permitir la selección de distintas ubicaciones cocleares que corresponden a las mejores frecuencias específicas25. La cuantificación de los números de sinapsis se lleva a cabo con el software gratuito ImageJ26. La cuantificación adicional de los volúmenes y ubicaciones de sinapsis dentro del HC individual se realiza con un software personalizado escrito en Matlab. Este software no se pone a disposición del público, ya que los autores carecen de los recursos para proporcionar documentación y soporte profesional.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V biotin-free</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse)</td>
			<td>BD Biosciences, Eysins</td>
			<td>612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse (IgG1)-AF 488</td>
			<td>Molecular Probes Inc.</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit)</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25e6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade Holder &#38; Breaker - Flat Jaws</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10052-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Artery Scissors - Ball Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LH26.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Surgical Blade</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>0473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti-rabbit (IgG)-AF647</td>
			<td>Life Technologies-Molecular Probes</td>
			<td>A-31573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12468750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8040.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Blade</td>
			<td>PLANO</td>
			<td>112-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G19 Cannula</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9003633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse (IgG2a)-AF568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>N68542.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essentials</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol, Immersion oil 518F</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>10539438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4062957E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISM596D</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KL 1600 LED</td>
			<td>Schott</td>
			<td>150.600</td>
			<td>light source for stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application suite X</td>
			<td>Leica Microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 system</td>
			<td>Leica Microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>The Mathworks Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14512-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-100 Orbital-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-M100</td>
			<td>for use in cold environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narcoren (pentobarbital)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ni-Ei</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Europe B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish without vents</td>
			<td>Avantor VWR</td>
			<td>390-1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31434-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Cap Containers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K305.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Halsted-Mosquito Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91308-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160; X</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors, 3mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrax VXR basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0002819000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>953300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild TYP 355110 (Stereomicroscope)</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td></td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabeling and counting ribbon synapses in young adult and aged gerbil cochleae

Se supone que la pérdida de sinapsis de cinta que conectan las células ciliadas internas y las fibras nerviosas auditivas aferentes es una de las causas de la pérdida auditiva relacionada con la edad. El método más común para detectar la pérdida de sinapsis de cinta es el inmunoetiquetado porque permite el muestreo cuantitativo de varias ubicaciones tonotópicas en una cóclea individual. Sin embargo, las estructuras de interés están enterradas profundamente dentro de la cóclea ósea. Los jerbos se utilizan como modelo animal para la pérdida de audición relacionada con la edad. Aquí, se describen los protocolos de rutina para la fijación, el inmunoetiquetado de montajes enteros cocleares de jerbos, las imágenes confocales y la cuantificación de los números y volúmenes de sinapsis de cinta. Además, se destacan los desafíos particulares asociados con la obtención de buen material de personas valiosas que envejecen. 
Los jerbos son sacrificados y perfundidos cardiovascularmente, o sus bullas timpánicas se diseccionan cuidadosamente fuera del cráneo. Las cócleas se abren en el ápice y la base y se transfieren directamente al fijador. Independientemente del método inicial, las cócleas se fijan posteriormente y posteriormente se descalcifican. Luego, el tejido se etiqueta con anticuerpos primarios contra estructuras pre y postsinápticas y células ciliadas. A continuación, las cócleas se incuban con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia que son específicos contra sus respectivos primarios. Las cócleas de los jerbos envejecidos se tratan con un silenciador de autofluorescencia para reducir la fluorescencia de fondo típicamente sustancial de los tejidos de los animales más viejos. 
Finalmente, las cócleas se diseccionan en 6-11 segmentos. Toda la longitud coclear se reconstruye de tal manera que las ubicaciones cocleares específicas se pueden determinar de manera confiable entre individuos. Las pilas de imágenes confocales, adquiridas secuencialmente, ayudan a visualizar las células ciliadas y las sinapsis en las ubicaciones elegidas. Las pilas confocales se descontorbanican, y las sinapsis se cuentan manualmente utilizando ImageJ, o se lleva a cabo una cuantificación más extensa de las estructuras sinápticas con procedimientos de análisis de imágenes escritos a medida en Matlab.

Las cócleas se cosecharon después de la perfusión cardiovascular con fijador de todo el animal o se diseccionaron rápidamente después de la eutanasia del animal y se fijaron por inmersión. Con este último método, los IHC permanecieron en su lugar durante la disección, mientras que, en casos de perfusión fallida y, por lo tanto, de tejido insuficientemente fijo, el epitelio sensorial a menudo se destruyó. Tenga en cuenta que los autores encontraron casos en los que la fijación de las cócleas después de la pe...

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Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

Se presenta un protocolo para el procesamiento de cócleas de jerbos adultos jóvenes y ancianos mediante el inmunoetiquetado de las estructuras sinápticas aferentes y las células ciliadas, el apagado de la autofluorescencia en el tejido envejecido, la disección y estimación de la longitud de las cócleas y la cuantificación de las sinapsis en pilas de imágenes obtenidas con imágenes confocales.

Sinapsis de cinta de inmunoetiquetado y conteo en cócleas de jerbos jóvenes y ancianos

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

Este protocolo permite la evaluación de la integridad sináptica en la cóclea del jerbo de todas las edades. Esto es importante para la investigación fundamental sobre los problemas de audición, en particular, debido al envejecimiento. El protocolo es relativamente rápido y produce datos cuantitativos de varias ubicaciones a lo largo de la cóclea.Además, aborda un problema específico del envejecimiento del tejido mediante el uso de un silenciador de autofluorescencia. La degeneración de las sinapsis es el signo más temprano de pérdida de función en la cóclea. Cuantificarlo es una herramienta importante en la investigación hacia el desarrollo de herramientas de diagnóstico no invasivas para la sinaptopatía.La disección coclear es la parte más crucial que necesita práctica, por lo que es mejor comenzar con cocleíes no experimentales. Comience por quitar las ampollas. Cortar el hueso con tijeras o romper el hueso con fórceps y retirarlo con fórceps para llegar a la cóclea.Retire el malleus, el incus y los canales semicirculares. Retire con cuidado el hueso que cubre el ápice de la cóclea y rasque el hueso coclear con fórceps para hacer pequeños agujeros en el ápice y en el giro basal o haga agujeros con cuidado en ambos lugares. Transfiera inmediatamente las ampollas a al menos 50 mililitros de fijador frío.Para cortar el cochli por la mitad, coloque un trozo de cuchilla de afeitar más largo que la longitud enrollada de la cóclea en un soporte de cuchilla. Luego, coloque la cóclea en una placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico. Corte el exceso de tejido con una cuchilla de afeitar o con tijeras finas.Sostenga la cóclea en su lugar con fórceps finos y córtela por la mitad a lo largo del modiolus. Prepare una solución al 5% del calmante de autofluorescencia mezclándolo con etanol al 70%. Coloque el cochli en esta solución e incube durante un minuto a temperatura ambiente en un agitador seguido de lavar tres veces con un mililitro de PBS durante cinco minutos.Para la disección de la cóclea, recoja dos pinzas finas, pinzas súper finas, vannas, tijeras de resorte, un soporte de cuchilla, una hoja de afeitar y llene la placa de Petri de poliestirol y su tapa con PBS. Rompe piezas de la cuchilla de afeitar para obtener una superficie de corte de dos a cuatro milímetros. Corte la cóclea por la mitad como se muestra en la sección para la preparación del tejido.Fije cuidadosamente la mitad coclear con las pinzas de tal manera que el borde cortado esté orientado hacia arriba. Use tijeras finas de resorte para cortar el hueso de la cóclea por encima del helicotrema que cubre el ápice. Luego, use tijeras para aislar el giro apical cortando a través del modiolus y el nervio auditivo y los vestibuli de la scala.Haga dos cortes a cada lado del hueso coclear por encima, o si la estría vascular no es necesaria para una evaluación adicional, directamente a través de la estría vascular del giro medio. Usa la hoja de afeitar para separar las piezas cocleares. Alternativamente, corte entre el órgano de Corti y la estría vascular.Deje la estría vascular conectada al ligamento espiral y retire el hueso descalcificado con fórceps. A continuación, transfiera las piezas cocleares a una tapa de placa de Petri llena de PBS. Retire el exceso de tejido en el pilar y los lados modiolares de modo que todos los soportes se queden más tarde en la corredera lo más plano posible.Las piezas cocleares grandes, en particular, las que se originan en el giro basal, deben cortarse en dos pedazos. Retire con cuidado la membrana tectorial con pinzas súper finas. Coloque las piezas cocleares en una diapositiva en una gota de medio de montaje, asegurándose de que el Órgano de Corti esté hacia arriba.Desplace la pieza coclear hacia el plano sagital y busque la invaginación del limbo espiral muy cerca de las células ciliadas internas. Esta invaginación del limbo espiral se puede ver más claramente en las piezas cocleares medias y basales. Transfiera toda la cóclea y toda la estría vascular al portaobjetos del microscopio repitiendo estos pasos.Cubra el deslizamiento de la diapositiva y agregue esmalte de uñas negro alrededor de los bordes para el sellado. Secar en la oscuridad y almacenarlos a cuatro grados centígrados. Abra una copia de las pilas descontorneadas en el software ImageJ cargado con el complemento BioVoxxel.Divida los canales haciendo clic en Imagen, luego en Color y luego en Dividir canales. Combínalos haciendo clic en Imagen, luego en Color y luego en Combinar canales para asignar diferentes colores. Convierta la imagen en una pila RGB haciendo clic en Imagen, luego vaya a Color y haga clic en Pila a RGB.Ajuste el brillo y el contraste haciendo clic en Imagen, Ajustar y, a continuación, Brillo/Contraste. Use auto o control deslizante para asegurarse de que las estructuras pre y postsinápticas y las etiquetas internas de las células ciliadas sean distintas del fondo. Etiquete cinco células ciliadas internas con la herramienta de texto haciendo clic en la ubicación deseada dentro de la pila.A continuación, vaya a Analizar, luego a Herramientas y seleccione ROI Manager. Marque las etiquetas de las casillas de verificación para etiquetar los puntos con un número. Haga zoom en la célula ciliada interna de interés.Haga clic derecho en la herramienta de punto para elegir el modo multipunto. Desplácese por la dimensión Z y cuente las sinapsis funcionales de la cinta, que se identifican mediante una cinta presináptica en yuxtaposición a un parche de glutamato postsináptico. Después de seleccionar todas las estructuras de interés, haga clic en Agregar el Administrador de ROI, luego haga clic en el nombre arbitrario y elija Cambiar nombre.Con la herramienta manual, ajuste la imagen para mostrar completamente la siguiente célula ciliada interna. Cambie de la herramienta Multipunto a la herramienta Punto para evitar agregar más puntos a los datos almacenados anteriormente. Haga clic en una estructura de interés dentro de la siguiente célula ciliada interna y cambie a la herramienta Multipunto.Continúe agregando la sinapsis de cinta funcional en el ROI Manager hasta que se evalúen todas las células ciliadas internas. Haga clic en un conjunto de datos en el Administrador de ROI y luego en Medir. Espere a que aparezca una nueva ventana que enumere los puntos de datos medidos y haga clic en Archivo y Guardar como para guardar esta lista como una hoja de cálculo.Guarde la imagen activando Mostrar todo en el Administrador de ROI. Haga clic en Aplanar para agregar permanentemente las etiquetas de punto a la pila y haga clic en Aceptar cerrar guardando los cambios. Las proyecciones de la pila Z de la cóclea de un jerbo joven de 10 meses de edad muestran que las células ciliadas internas marcadas con miosina 7A delineadas aquí por líneas discontinuas blancas estaban en marcado contraste con el fondo.Las cintas presinápticas se etiquetaron con anti-CtBP2 dos que se muestran en verde, mientras que los parches de glutamato post-sináptico se etiquetaron con anti-GluA2 que se muestra en rojo. La cóclea de un viejo jerbo de 38 meses fue tratada con el bloqueador de autofluorescencia y mostró distintas células ciliadas internas con estructuras pre y postsinápticas claramente visibles. Para probar la estabilidad del inmunoetiquetado, se tomó la imagen de la misma pieza de cóclea del jerbo joven después de tres meses y 29 meses y medio.A pesar de la reducción de la relación señal-ruido, las sinapsis funcionales eran distintas y cuantificables. Incluso si un corte falla, monte la pieza restante de tejido para luego estimar la longitud coclear completa con mayor precisión. Los datos de este protocolo son particularmente valiosos si están precedidos por, y luego correlacionados individualmente con, pruebas de audición electrofisiológicas o psicofísicas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Kinematics and Ground Reaction Force Determination: A Demonstration Quantifying Locomotor Abilities of Young Adult, Middle-aged, and Geriatric Rats

La cinemática y la reacción del suelo Determinación de la Fuerza: Una demostración de habilidades Locomotor Cuantificación de adultos jóvenes, de mediana edad, y las ratas de Geriatría

Behavior, in its broadest definition, can be defined as the motor manifestation of physiologic processes.  As such, all behaviors manifest through the ...

Investigación

Neurociencias

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

La formación específica de las vocalizaciones de ultrasonidos en las ratas viejas y Parkinson

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Fundición cerebrovascular del ratón adulto de imágenes en 3D y el análisis morfológico

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescencia y bioluminiscencia de imágenes de subcelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Envejecido en las neuronas del hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Combinados Optogenética y congelación-fractura Réplica Immunolabeling para Analizar Arreglo-entrada específica de glutamato receptores en el ratón amígdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Evaluación morfológica y funcional de sinapsis de cinta en regiones de frecuencia específica de la Cóclea de Ratones

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Evaluación morfológica y funcional de los axónyis y sus sinapsis durante la muerte de Axon en Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Cultura de las Neuroesferas Derivadas de los Nichos Neurogénicos en Voles de La Pradera Adulta

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...