Name: immunolabeling and counting ribbon synapses in young adult and aged gerbil cochleae
Uploaded: 2022-04-21T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae at JoVE.com

Författarna erkänner Lichun Zhang för att ha hjälpt till att etablera metoden och Fluorescensmikroskopi serviceenheten, Carl von Ossietzky University of Oldenburg, för användning av bildbehandlingsanläggningarna. Denna forskning finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tyska forskningsstiftelsen) under Tysklands Excellensstrategi -EXC 2177/1.

Alla protokoll och förfaranden godkändes av de behöriga myndigheterna i Niedersachsen, Tyskland, med tillståndsnummer AZ 33.19-42502-04-15/1828 och 33.19-42502-04-15/1990. Detta protokoll är för mongoliska gerbiler (M. unguiculatus) av båda könen. Ung vuxen avser åldern 3-12 månader, medan gerbiler anses vara i åldern 36 månader och äldre. Om inget annat anges kan buffertar och lösningar beredas och förvaras i kylen i upp till flera månader (4-8 °C). Se till att buffertarna och lösningarna inte...

<ol>
	<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+and+age-related+hearing+loss:+new+perspectives+and+potential+therapies+[version+1;+peer+review.">Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review.</a> F1000Research. 6 (927), (2017).</li><li>Heeringa, A. N., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+cochlea:+Towards+unraveling+the+functional+contributions+of+strial+dysfunction+and+synaptopathy.">The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy.</a> Hearing. 376, 111-124 (2019).</li><li>Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+gradients+of+ribbon+size+and+AMPA+receptor+expression+underlie+sensitivity+differences+among+cochlear-nerve/hair-cell+synapses.">Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).</li><li>Khimich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+cell+synaptic+ribbons+are+essential+for+synchronous+auditory+signalling.">Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling.</a> Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).</li><li>Pangr&#353;i&#269;, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+requires+otoferlin-dependent+efficient+replenishment+of+synaptic+vesicles+in+hair+cells.">Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells.</a> Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).</li><li>Meyer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+of+synapse+number,+structure+and+function+in+the+cochlea.">Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea.</a> Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).</li><li>Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+gradients+of+ribbon+volume+and+AMPA-receptor+patch+volume+in+cochlear+afferent+synapses+on+gerbil+inner+hair+cells.">Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells.</a> Hearing Research. 364, 81-89 (2018).</li><li>Steenken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+decline+in+cochlear+ribbon+synapses+and+its+relation+to+different+metrics+of+auditory-nerve+activity.">Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity.</a> Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).</li><li>Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+differences+among+afferent+synapses+on+cochlear+hair+cells:+Correlations+with+spontaneous+discharge+rate.">Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate.</a> Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).</li><li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates.">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li><li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice.">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li><li>Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olivocochlear+innervation+maintains+the+normal+modiolar-pillar+and+habenular-cuticular+gradients+in+cochlear+synaptic+morphology.">Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).</li><li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes,+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB/nJ+mouse.">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).</li><li>Reijntjes, D. O. J., K&#246;ppl, C., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+gradients+in+inner+hair+cell-auditory+nerve+fiber+pre-+and+postsynaptic+proteins+differ+across+mouse+strains.">Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains.</a> Hearing Research. 390, 107933 (2020).</li><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve.">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li><li>Bourien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+auditory+nerve+fibers+to+compound+action+potential+of+the+auditory+nerve.">Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).</li><li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+cochlear+synaptopathy:+An+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline.">Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li><li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis:+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue.">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li><li>Batrel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+potentials+recorded+at+the+round+window+enable+the+detection+of+low+spontaneous+rate+fibers+in+gerbil+auditory+nerve.">Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).</li><li>Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -. L., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-induced+hearing+loss+in+gerbil:+Round+window+assays+of+synapse+loss.">Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).</li><li>Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+auditory+thresholds+and+loss+of+ribbon+synapses+at+inner+hair+cells+in+aged+gerbils.">Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils.</a> Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).</li><li>Cheal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gerbil:+A+unique+model+for+research+on+aging.">The gerbil: A unique model for research on aging.</a> Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).</li><li>Gates, G. A., Mills, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presbycusis.">Presbycusis.</a> The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).</li><li>Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+sensitivity+of+the+gerbil,+Meriones+unguiculatis.">Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li><li>M&#252;ller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cochlear+place-frequency+map+of+the+adult+and+developing+gerbil.">The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+intact+rodent+organ+of+Corti+for+RNAscope+and+immunolabeling,+confocal+microscopy,+and+quantitative+analysis.">Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).</li><li>Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+migration+and+reorganization+after+noise+exposure+suggests+regeneration+in+a+mature+mammalian+cochlea.">Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).</li><li>Gray, D. A., Woulfe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofuscin+and+aging:+a+matter+of+toxic+waste.">Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste.</a> Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).</li><li>Li, H. -. S., Hultcrantz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+degeneration+of+the+organ+of+Corti+in+two+genotypes+of+mice.">Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice.</a> ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).</li><li>Kobrina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+anatomical+and+physiological+markers+of+auditory+system+degeneration+with+behavioral+hearing+assessments+in+a+mouse+(Mus+musculus)+model+of+age-related+hearing+loss.">Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss.</a> Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).</li><li>Moreno-Garc&#237;a, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+role+of+lipofuscin+in+age-related+neurodegeneration.">An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).</li><li>Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+myocardial+tissue+with+digital+autofluorescence+microscopy.">Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy.</a> Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).</li><li>Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+gradients+in+the+size+of+inner+hair+cell+ribbons+emerge+before+the+onset+of+hearing+in+rats.">Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).</li><li>Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neural+degeneration+in+the+human+cochlea:+Evidence+for+hidden+hearing+loss+in+the+aging+ear.">Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear.</a> Neuroscience. 407, 8-20 (2019).</li></ol>

Med den metod som beskrivs i detta protokoll är det möjligt att immunmärka IHC och synaptiska strukturer i cochleae från unga vuxna och äldre gerbiler, identifiera förmodade funktionella synapser genom samlokalisering av pre- och postsynaptiska element, fördela dem till enskilda IHC och kvantifiera deras antal, volym och plats. Antikropparna som användes i detta tillvägagångssätt märkte också yttre hårceller (OHC; myoVIIa) och deras presynaptiska band. Dessutom är ett livskraftigt alternativ för immunmä...

Åldersrelaterad hörselnedsättning är en av världens vanligaste sjukdomar som drabbar mer än en tredjedel av världens befolkning i åldern 65 år och äldre1. De bakomliggande orsakerna diskuteras fortfarande och undersöks aktivt men kan inkludera förlusten av de specialiserade synapserna som förbinder inre hårceller (IHC) med afferenta hörselnervfibrer2. Dessa bandsynapser består av en presynaptisk struktur som har vesiklar fyllda med neurotransmittorn glutamat bunden till den, liksom postsynaptisk α-amino-3-hydroxi-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra (AMPA) glutamatreceptorer 3,4,5. I gerbilen kommer ~20 afferenta hörselnervfibrer i kontakt med en IHC 6,7,8. Fibrer på IHC som vetter mot modiolus står emot stora synaptiska band, medan fibrerna som förbinder på pelarsidan av IHC möter små synaptiska band (dvs. hos katter9, gerbiler7, marsvin10 och möss 3,11,12,13,14). Vidare, i gerbilen, är storleken på de presynaptiska banden och de postsynaptiska glutamatplåsterna positivt korrelerade 7,14. Fibrer som står emot stora band på den modiolära sidan av IHC är små i kaliber och har låga spontana hastigheter och höga trösklar15. Det finns bevis för att fibrer med låg spontan hastighet är mer sårbara för bullerexponering10 och ototoxiska läkemedel16 än fibrer med hög spontan låg tröskel, som ligger på pelarsidan av IHC15.
Förlusten av bandsynapser är den tidigaste degenerativa händelsen vid cochleär neural åldersrelaterad hörselnedsättning, medan förlusten av spiral ganglionceller och deras afferenta hörselnervfibrer ligger efter17,18. Elektrofysiologiska korrelat inkluderar inspelningar av auditiva hjärnstamssvar17 och sammansatta åtgärdspotentialer8; dessa återspeglar emellertid inte subtiliteterna av synapsförlust, eftersom fibrer med låg spontan hastighet inte bidrar till dessa åtgärder16. Mer lovande elektrofysiologiska mätvärden är masspotential-härledd neuralt index19 och peristimulus tidsrespons20. Dessa är emellertid endast tillförlitliga om djuret inte har några andra cochleära patologier, utöver hörselnervfiberförlust, som påverkar aktiviteten hos de återstående hörselnervfibrerna8. Dessutom var beteendebedömda trösklar i gerbilen inte korrelerade med synapsnummer21. Därför är tillförlitlig kvantifiering av överlevande bandsynapser och därmed antalet funktionella hörselnervfibrer endast möjlig genom direkt undersökning av cochleärvävnaden.
Den mongoliska gerbilen (Meriones unguiculatus) är en lämplig djurmodell för att studera åldersrelaterad hörselnedsättning. Den har en kort livslängd, har lågfrekvent hörsel som liknar människor, är lätt att underhålla och visar likheter med mänskliga patologier relaterade till åldersrelaterad hörselnedsättning 2,22,23,24. Gerbils anses vara åldrade när de når 36 månaders ålder, vilket är nära slutet av deras genomsnittliga livslängd22. Viktigt är att en åldersrelaterad förlust av bandsynapser har visats i gerbiler upphöjda och åldrade i tysta miljöer 8,21.
Här presenteras ett protokoll för att immunmärka, dissekera och analysera cochleae från gerbiler i olika åldrar, från unga vuxna till äldre. Antikroppar riktade mot komponenter i presynapsen (CtBP2), postsynaptiska glutamatreceptorplåster (GluA2) och IHC (myoVIIa) används. En autofluorescenssläckare appliceras som minskar bakgrunden i åldriga cochleae och lämnar fluorescenssignalen intakt. Vidare ges en beskrivning av hur man dissekerar snäckan för att undersöka både det sensoriska epitelet och stria vascularis. Cochleärlängden mäts för att möjliggöra val av distinkta cochleära platser som motsvarar specifika bästa frekvenser25. Kvantifiering av synapsnummer utförs med den fritt tillgängliga programvaran ImageJ26. Ytterligare kvantifiering av synapsvolymer och platser inom den enskilda HC utförs med programvara anpassad i Matlab. Denna programvara görs inte offentligt tillgänglig, eftersom författarna saknar resurser för att tillhandahålla professionell dokumentation och support.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V biotin-free</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse)</td>
			<td>BD Biosciences, Eysins</td>
			<td>612044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse (IgG1)-AF 488</td>
			<td>Molecular Probes Inc.</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit)</td>
			<td>Proteus Biosciences</td>
			<td>25e6790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade Holder &#38; Breaker - Flat Jaws</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10052-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Artery Scissors - Ball Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>LH26.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Surgical Blade</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>0473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti-rabbit (IgG)-AF647</td>
			<td>Life Technologies-Molecular Probes</td>
			<td>A-31573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute 99.8%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12468750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8040.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Blade</td>
			<td>PLANO</td>
			<td>112-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G19 Cannula</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9003633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse (IgG2a)-AF568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>N68542.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essentials</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol, Immersion oil 518F</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>10539438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4062957E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISM596D</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td>peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KL 1600 LED</td>
			<td>Schott</td>
			<td>150.600</td>
			<td>light source for stereomicroscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application suite X</td>
			<td>Leica Microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 system</td>
			<td>Leica Microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>The Mathworks Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14512-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-100 Orbital-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-M100</td>
			<td>for use in cold environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narcoren (pentobarbital)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ni-Ei</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Europe B.V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish without vents</td>
			<td>Avantor VWR</td>
			<td>390-1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31434-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Cap Containers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>75.562.300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K305.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Halsted-Mosquito Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91308-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160; X</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors, 3mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrax VXR basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>0002819000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>953300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild TYP 355110 (Stereomicroscope)</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td></td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabeling and counting ribbon synapses in young adult and aged gerbil cochleae

Förlusten av bandsynapser som förbinder inre hårceller och afferenta hörselnervfibrer antas vara en orsak till åldersrelaterad hörselnedsättning. Den vanligaste metoden för att detektera förlusten av bandsynapser är immunmärkning eftersom det möjliggör kvantitativ provtagning från flera tonotopiska platser i en enskild cochlea. Strukturerna av intresse är dock begravda djupt inne i den beniga cochlea. Gerbils används som en djurmodell för åldersrelaterad hörselnedsättning. Här beskrivs rutinprotokoll för fixering, immunmärkning av gerbil cochleära helfästen, konfokal avbildning och kvantifiering av bandsynapsnummer och volymer. Vidare lyfts de särskilda utmaningar som är förknippade med att få bra material från värdefulla åldrande individer fram. 
Gerbiler avlivas och antingen perfuseras kardiovaskulärt, eller så dissekeras deras tympaniska bullae noggrant ut ur skallen. Cochleae öppnas vid toppen och basen och överförs direkt till fixativet. Oavsett den ursprungliga metoden postfixeras cochleae och avkalkas därefter. Vävnaden märks sedan med primära antikroppar mot pre- och postsynaptiska strukturer och hårceller. Därefter inkuberas cochleae med sekundära fluorescensmärkta antikroppar som är specifika mot deras respektive primära. Cochleae hos åldrade gerbiler behandlas sedan med en autofluorescenssläckare för att minska den typiskt betydande bakgrundsfluorescensen hos äldre djurs vävnader. 
Slutligen dissekeras cochleae i 6-11 segment. Hela cochleärlängden rekonstrueras så att specifika cochleära platser kan bestämmas på ett tillförlitligt sätt mellan individer. Konfokala bildstaplar, förvärvade sekventiellt, hjälper till att visualisera hårceller och synapser på de valda platserna. De konfokala stackarna är dekonvolverade, och synapserna räknas antingen manuellt med hjälp av ImageJ, eller så utförs mer omfattande kvantifiering av synaptiska strukturer med bildanalysprocedurer specialskrivna i Matlab.

Cochleae skördades antingen efter kardiovaskulär perfusion med fixering av hela djuret eller dissekerades snabbt efter avlivning av djuret och nedsänkningsfixerade. Med den senare metoden stannade IHC: erna på plats under dissektion, medan i fall av misslyckad perfusion och därmed otillräckligt fixerad vävnad förstördes det sensoriska epitelet ofta. Observera att författarna stötte på fall där fixering av cochleae efter transkardiell perfusion var otillräcklig medan fixering av hjärnan fortfarande var till...

Watch this Scientific Journal Video about Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae at JoVE.com

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

Ett protokoll för bearbetning av unga vuxna och äldre gerbil cochleae genom att immunmärka de afferenta synaptiska strukturerna och hårcellerna, släcka autofluorescens i åldrig vävnad, dissekera och uppskatta längden på cochleae och kvantifiera synapserna i bildstaplar erhållna med konfokal avbildning presenteras.

Immunmärkning och räkning av bandsynapser hos unga vuxna och äldre Gerbil Cochleae

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

Detta protokoll möjliggör utvärdering av den synaptiska integriteten i snäckan hos gerbilen i alla åldrar. Detta är viktigt för grundforskningen om hörselproblem, särskilt på grund av åldrande. Protokollet är relativt snabbt och ger kvantitativa data från flera platser längs snäckan.Dessutom behandlar den ett specifikt problem med åldrande vävnad genom att använda en autofluorescenssläckare. Degeneration av synapser är det tidigaste tecknet på förlust av funktion i snäckan. Kvantifiering av det är ett viktigt verktyg i forskning för att utveckla icke-invasiva diagnostiska verktyg för synaptopati.Den cochleära dissektionen är den viktigaste delen som behöver övas, så det är bättre att börja med icke-experimentell cochli. Börja med att ta bort bullae. Skär benet med sax eller spricka benet med pincett och ta bort det med pincett för att nå snäckan.Ta bort malleus, incus och halvcirkelformade kanaler. Ta försiktigt bort benet som täcker toppen av hörselsnäckan och repa cochlearbenet med pincett för att göra små hål vid toppen och i basal svängen eller stick försiktigt hål på båda platserna. Överför omedelbart bullae till minst 50 ml kallt fixativ.För att skära cochli i hälften, placera en bit rakblad längre än den lindade längden på cochlea i en bladhållare. Placera sedan snäckan i en petriskål under ett stereomikroskop. Skär bort överflödig vävnad med ett rakblad eller med fin sax.Håll snäckan på plats med fina pincett och skär i hälften längs modiolusen. Förbered en 5% lösning av autofluorescenssläckaren genom att blanda den med 70% etanol. Placera cochli i denna lösning och inkubera den i en minut vid rumstemperatur på en shaker följt av tvättning tre gånger med en milliliter PBS i fem minuter.För dissektion av snäckan, samla två fina pincett, superfina pincett, vannas, fjädersax, en bladhållare, ett rakblad och fyll polystyrol Petri-skålen och dess lock med PBS. Bryt bitar från rakbladet för att få en skäryta på två till fyra millimeter. Skär snäckan i hälften som visas i avsnittet för vävnadsberedning.Fixera försiktigt cochlearhalvan med tången så att skäreggen är vänd uppåt. Använd en fin fjädersax för att skära bort snäckans ben ovanför helikotreman som täcker toppen. Använd sedan sax för att isolera den apikala svängen genom att skära igenom modiolus och hörselnerven och scala vestibuli.Gör två snitt på varje sida av cochleärbenet ovan, eller om stria vascularis inte behövs för vidare utvärdering, direkt genom stria vascularis i mittsvängen. Använd rakbladet för att separera cochlealagbitarna. Alternativt kan du klippa mellan Cortis organ och stria vascularis.Lämna stria vascularis ansluten till spiralbandet och ta bort det avkalkade benet med pincett. Överför sedan cochlealagdbitarna till ett petriskålslock fyllt med PBS. Ta bort överflödig vävnad på pelaren och modiolära sidor så att hela fästena senare kommer att ligga på bilden så platt som möjligt.Stora cochleära bitar, i synnerhet de som härrör från basalvarven, ska skäras i två delar. Ta försiktigt bort tectorialmembranet med superfina pincett. Placera cochleastyckena på en rutschkana i en droppe monteringsmedium och se till att Corti-orgeln är vänd uppåt.Flytta in den cochleära biten i sagittalplanet och leta efter invagination av spiral limbus i närheten av de inre hårcellerna. Denna invagination av spiral limbus kan ses tydligare i de mellersta och basala cochleära bitarna. Överför hela snäckan och hela stria vascularis till mikroskopglaset genom att upprepa dessa steg.Täck glida bilden och tillsätt svart nagellack runt kanterna för tätning. Torka i mörkret och förvara dem vid fyra grader Celsius. Öppna en kopia av de dekonvolverade stackarna i ImageJ-programvaran laddad med BioVoxxel-plugin.Dela kanalerna genom att klicka på Bild, sedan Färg och sedan Dela kanaler. Slå samman dem genom att klicka på Bild, sedan Färg och sedan Slå samman kanaler för att tilldela olika färger. Konvertera bilden till en RGB-stapel genom att klicka på Bild, gå sedan till Färg och klicka på Stapla till RGB.Justera ljusstyrkan och kontrasten genom att klicka på Bild, Justera och sedan Ljusstyrka / Kontrast. Använd antingen auto eller skjutreglage för att säkerställa att de pre- och postsynaptiska strukturerna och de inre hårcellsetiketterna skiljer sig från bakgrunden. Märk fem inre hårceller med textverktyget genom att klicka på önskad plats i stapeln.Gå sedan till Analysera, sedan Verktyg och välj ROI Manager. Markera etiketterna i kryssrutan för att märka punkterna med ett nummer. Zooma in på den inre hårcellen av intresse.Högerklicka på punktverktyget för att välja Flerpunktsläge. Bläddra igenom Z-dimensionen och räkna de funktionella bandsynapserna, som identifieras av ett pre-synaptiskt band i samband med en postsynaptisk glutamatplåster. När du har valt alla strukturer av intresse klickar du på Lägg till ROI Manager, klickar sedan på det godtyckliga namnet och väljer Byt namn.Med handverktyget justerar du bilden så att nästa inre hårcell visas helt. Byt från flerpunktsverktyg till punktverktyg för att undvika att lägga till mer punkt i tidigare lagrade data. Klicka på en struktur av intresse i nästa inre hårcell och byt till Multi-point tool.Fortsätt att lägga till den funktionella bandsynapsen i ROI Manager tills alla inre hårceller har utvärderats. Klicka på en datauppsättning i ROI Manager och sedan på Mät. Vänta tills ett nytt fönster visas som visar mätdatapunkterna och klicka på Arkiv och Spara som för att spara listan som ett kalkylblad.Spara bilden genom att aktivera Visa alla i ROI-hanteraren. Klicka på Platta för att permanent lägga till punktetiketterna i stapeln och klicka på Godkänn att stänga genom att spara ändringarna. Z-stackprojektioner från snäckan hos en ung gerbil i åldern 10 månader visar att de myosin 7A-märkta inre hårcellerna som skisseras här av vita streckade linjer stod i skarp kontrast till bakgrunden.De pre-synaptiska banden var märkta med anti-CtBP2 två visade i grönt, medan de postsynaptiska glutamatplåsterna var märkta med anti-GluA2 som visades i rött. Snäckan från en gammal gerbil i åldern 38 månader behandlades med autofluorescenssläckaren och visade distinkta inre hårceller med tydligt synliga pre- och postsynaptiska strukturer. För att testa immunmärkningens stabilitet avbildades samma bit cochlea från den unga gerbilen efter tre månader och 29 1/2 månad.Trots det reducerade signal-brusförhållandet var de funktionella synapserna distinkta och kvantifierbara. Även om ett snitt misslyckas, montera den återstående vävnadsbiten för att senare uppskatta hela cochleärlängden mest exakt. Data från detta protokoll är särskilt värdefulla om de föregås av, och sedan individuellt korreleras med, elektrofysiologiska eller psykofysiska hörseltester.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Kinematics and Ground Reaction Force Determination: A Demonstration Quantifying Locomotor Abilities of Young Adult, Middle-aged, and Geriatric Rats

Kinematik och Ground Reaction Force Fastställande: En demonstration kvantifiera rörelseapparaten förmåga unga vuxna, medelålders och geriatrisk Råttor

Behavior, in its broadest definition, can be defined as the motor manifestation of physiologic processes.  As such, all behaviors manifest through the ...

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Målinriktad träning av Ultrasonic vocalizations i Aged och Parkinsons Råttor

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Cerebrovaskulära Gjutning av de vuxna mus för 3D-avbildning och morfologisk analys

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hela Mount immunomärkning av luktreceptor nervceller i<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenn

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescens och Bioluminescence avbildning av Subcellulär Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; I Aged hippocampus nervceller

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Högupplösta Kvantitativ immunogold Analys av membranreceptorer på näthinnan Ribbon synapser

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Kombinerade optogenetic och Freeze-fraktur Replica immunomärkning att granska Input specifika Arrangemang av glutamatreceptorer i mus Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Morfologisk och funktionell utvärdering av band synapser vid specifika frekvensområden i Mouse cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Morfologisk och funktionell utvärdering av Axons och deras synapser under Axon death i Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Kultur av neurosfärer som härrör från neurogena nischer i Adult Prairie Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...