Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultivierung und zum Passieren einer wichtigen Zellpopulation in der Lunge und etabliert eine physiologisch relevante Plattform für die Umweltexposition. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zur Untersuchung der Lungenbiologie im Kontext von Homöostase und Krankheit eingesetzt werden kann. Diese Methode kann Einblicke liefern, insbesondere in Lungenerkrankungen, die Lungenbläschen betreffen, einschließlich solcher, die durch genetische Varianten, Umweltexpositionen, Infektionserreger oder eine Kombination dieser Faktoren verursacht werden.
Ich und Rhiannon Werder werden das Verfahren demonstrieren, unterstützt von Kristy Abo, einer MD, Doktorandin, und Olivia Hix, einer Laborleiterin aus unseren Labors. Aspirieren Sie zunächst das gesamte CK DCI-Medium aus den 3D-Matrixtröpfchen, die Alveolosphären enthalten, die aus der gerichteten Differenzierung in der 12-Well-Platte abgeleitet sind. Fügen Sie einen Milliliter Dispase pro Tröpfchen hinzu.
Pipettieren Sie das Tröpfchen vorsichtig mit einer P-1000-Pipette in die Dispase. Nach der Inkubation werden die dissoziierten Organoide von einem Matrixtröpfchen in der Dispase in ein 15-Milliliter-Konusröhrchen übertragen. Fügen Sie 10 Milliliter Modified Dulbecco's Medium von Iscove hinzu und zentrifugieren Sie bei 300 x g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Saugen Sie den Überstand so weit wie möglich ab. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter 0,05% Trypsin pro Tröpfchen und übertragen Sie es zurück auf die 12-Well-Platte. Inkubieren Sie dies bei 37 Grad Celsius für 12 bis 15 Minuten, bevor Sie die Dissoziation unter dem Mikroskop beobachten und vermeiden Sie es, die Zellen zu überpipettieren.
Am Ende der Inkubation erhält man eine Einzelzellsuspension. Stoppen Sie die Wirkung von Trypsin mit einem gleichen Volumen an fetalem Rinderserum, das Medium enthält, gefolgt von einer Zentrifuge bei 300 x g für fünf Minuten. Waschen Sie die Zellen mit 10 Millilitern IMDM vor der nächsten Zentrifugation.
Suspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen zum Zählen. Und dann zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Erzeugen Sie Alveolosphären, indem Sie Einzelzellsuspension von iAT2-Zellen in der 3D-Matrix oder auf Zellkultureinlagen für die Luft-Flüssig-Grenzflächenkultur plattieren.
Bestimmen Sie nach dem Zählen der Zellen die Anzahl der gewünschten Zellen, die in der 3D-Matrix wiedergegeben werden sollen, und zentrifieren Sie die Zellen bei 300 x g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich mit einer Pipette und suspendieren Sie die Zellen in der 3D-Matrix schnell. Dosieren Sie einen 3D-Matrixtropfen mit einer P-200-Pipette in eine Vertiefung aus vorgewärmter 12-Well-Platte, ohne Blasen im Matrixtröpfchen zu erzeugen und ohne dass sich die Zellsuspension bei der Abgabe mehrerer Tröpfchen absetzen kann.
Legen Sie die Platte für 20 bis 30 Minuten in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator, damit die Matrixtröpfchen polymerisieren können, und fügen Sie dann einen Milliliter CK DCI 10 Mikromolar Y-27632-Medium pro Vertiefung hinzu, um das Matrixtröpfchen abzudecken. Wechseln Sie das Medium nach 72 Stunden in CK DCI ohne 10 Mikromolar Y-27632 und ersetzen Sie es alle 48 bis 72 Stunden durch frisches CK DCI. Bereiten Sie frisch beschichtete 6,5-Millimeter-Zellkultureinsätze eine Stunde vor der Verwendung vor, indem Sie die 2D-Matrix in Dulbeccos modifizierter Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 zur Arbeitslösung verdünnen.
Dann 100 Mikroliter der verdünnten Matrix pro 6,5 Millimeter Zellkultureinsatz hinzufügen. Lassen Sie die Matrix in einem 37 Grad Celsius Inkubator für 30 Minuten oder bei Raumtemperatur ab einer Stunde polymerisieren. Saugen Sie die überschüssige Matrix mit einer Pipette aus den Zellkultureinsätzen ab.
Spülen Sie es mit DMEM F-12 ab und saugen Sie diese Wäsche sofort ab, bevor Sie die Zellen hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für fünf Minuten und entfernen Sie so viel Überstand wie möglich. Resuspendieren Sie die Zellen im entsprechenden Volumen, um mit 100 Mikrolitern CK DCI 10 Mikromolar Y-27632 pro Zellkultureinsatz zu säen, und fügen Sie 100 Mikroliter in das apikale Kompartiment des Zellkultureinsatzes hinzu.
Rühren Sie die Platte vorsichtig in einem Kreuzmuster, um die gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, und überprüfen Sie sie unter einem Mikroskop bei 10X Objektiv. Geben Sie 500 Mikroliter CK DCI 10 Mikromolar Y-27632 in das basolaterale Kompartiment jedes Zellkultureinsatzes und aspirieren Sie 48 Stunden nach der Aussaat das apikale Medium mit einer Pipette, um die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu initiieren. Nach 72 Stunden wechseln Sie das basolaterale Medium zu CK DCI ohne 10 Mikromolar Y-27632, gefolgt von einem Austausch des basolateralen Mediums durch frisches CK DCI alle 48 bis 72 Stunden für bis zu 28 Tage nach der Beschichtung.
Die repräsentativen Ergebnisse der Durchflusszytometrie demonstrieren die einfache Visualisierung für die SPC2-Linie, wobei ein tdTomato-Reporter auf das endogene Tensidprotein C-Locus ausgerichtet ist und das Typ-2-Alveolarepithelzellenprogramm im Laufe der Zeit in Kultur verfolgt wird. Das IPSC-abgeleitete alveoläre Typ-2-Zelltensid C tdTomato-Expression wurde beibehalten, wenn es in der 3D-Matrix als Kugeln neu plattiert und auf Zellkultureinlagen plattiert wurde. Der transepitheliale elektrische Widerstand kann gemessen werden, um die Integrität der Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur zu bestimmen.
Vermeiden Sie bei diesem Verfahren eine übermäßige Dissoziation durch mechanische Pipettierung oder enzymatischen Aufschluss, da dies zu einer geringen Zelllebensfähigkeit und einem schlechten Überleben führen kann. Weitere Methoden, die nach diesem Verfahren durchgeführt werden, sind Messungen des transepithelialen elektrischen Widerstands zur Bestimmung der Barriereintegrität, Zugabe von Viren oder Verbindungen zur Stimulation der Zellen, Immunfluoreszenz und RNA-, Protein- oder Überstandssammlung. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher, um neue Fragen der Lungenbiologie und Krankheiten zu untersuchen, wie zum Beispiel, wie Viren wie SARS COVID-2 oder Verbindungen wie elektronische Zigarettendämpfe das Alveolarepithel beeinflussen.
