Этот протокол описывает метод культивирования и прохождения важной клеточной популяции в легких и устанавливает физиологически значимую платформу для воздействия окружающей среды. Основным преимуществом этого метода является то, что его можно использовать для исследования биологии легких в контексте гомеостаза и болезни. Этот метод может дать представление, особенно о легочных заболеваниях, влияющих на альвеолы легких, в том числе вызванных генетическими вариантами, воздействием окружающей среды, инфекционными агентами или комбинацией этих факторов.
Демонстрировать процедуру будут я и Рианнон Вердер, которым помогают Кристи Або, доктор медицинских наук, аспирант, и Оливия Хикс, менеджер лаборатории из наших лабораторий. Во-первых, аспирировать всю среду CK DCI из 3D-матричных капель, содержащих альвеолосферы, полученные из направленной дифференцировки в 12-луночной пластине. Добавьте один миллилитр диспазы на каплю.
Аккуратно пипсируйте каплю в диспазу с помощью пипетки P-1000. После инкубации перенос диссоциированных органоидов из одной матричной капли в диспазу в 15-миллилитровую коническую трубку. Добавьте 10 миллилитров модифицированной среды Dulbecco от Iscove и центрифугу при 300 х г в течение пяти минут при комнатной температуре.
Аспирируйте супернатанта как можно больше. Повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре 0,05% трипсина на каплю и перенесите его обратно в 12-луночную пластину. Инкубируйте его при 37 градусах Цельсия в течение 12-15 минут, прежде чем наблюдать диссоциацию под микроскопом и избегайте чрезмерного пипетирования клеток.
В конце инкубации получают одноклеточную суспензию. Прекращают действие трипсина с равным объемом фетальной бычьей сыворотки, содержащей среду, с последующей центрифугой на 300 х г в течение пяти минут. Промыть клетки 10 миллилитрами IMDM перед следующей центрифугированием.
Повторно суспендировать ячейки в соответствующем объеме для подсчета. А затем подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Генерация альвеолосфер путем покрытия одноклеточной суспензии ячеек iAT2 в 3D-матрице или на вставках клеточной культуры для культуры взаимодействия воздух-жидкость.
После подсчета клеток определите количество желаемых ячеек для воспроизведения в 3D-матрице и центрифугируйте ячейки при 300 х г в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите как можно больше супернатанта с помощью пипетки и быстро повторно суспендируйте ячейки в 3D-матрице. Дозируйте одну 3D-матричную каплю в колодец предварительно расплавленной 12-луночной пластины с помощью пипетки P-200, не создавая пузырьков в матричной капле и не позволяя клеточной суспензии оседать при дозировании нескольких капель.
Поместите пластину в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 20-30 минут, чтобы дать каплям матрицы полимеризоваться, затем добавьте один миллилитр микромоляра CK DCI 10 среды Y-27632 на лунку, чтобы покрыть матричную каплю. Измените среду на CK DCI без 10 микромоляров Y-27632 через 72 часа и замените ее свежей CK DCI каждые 48-72 часа. Подготовьте свежепокрытые 6,5-миллиметровые вставки для культивирования клеток за час до использования, разбавляя 2D-матрицу в модифицированной среде / питательной смеси F-12 Dulbecco в рабочем растворе.
Затем добавляют 100 микролитров разбавленной матрицы на 6,5-миллиметровую вставку клеточной культуры. Дайте матрице полимеризоваться в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение 30 минут или при комнатной температуре от одного часа. Аспирируйте лишнюю матрицу из клеточных культурных вставок с помощью пипетки.
Промойте его DMEM F-12 и сразу же аспирируйте эту промывку перед добавлением клеток. Центрифугируйте клетки при 300 х г в течение пяти минут и удалите как можно больше супернатанта. Повторно суспендируют клетки в соответствующем объеме для посева 100 микролитрами CK DCI 10 микромоляров Y-27632 на клеточную культуру вставляют и добавляют 100 микролитров в апикальный отсек вставки клеточной культуры.
Аккуратно перемешайте пластину поперечным рисунком, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, и проверьте ее под микроскопом на объективе 10X. Добавьте 500 микролитров CK DCI 10 микромоляра Y-27632 к базолатеральному отсеку каждой вставки клеточной культуры и через 48 часов после посева аспирируйте аспиральную среду с помощью пипетки для инициирования воздушно-жидкостного интерфейса. Через 72 часа измените базолатеральную среду на CK DCI без 10 микромоляров Y-27632 с последующей заменой базолатеральной среды на свежую CK DCI каждые 48-72 часа в течение 28 дней после нанесения покрытия.
Результаты репрезентативной проточной цитометрии демонстрируют простоту визуализации для линии SPC2, имеющей репортер tdTomato, нацеленный на эндогенный сурфактантный белок C локус и отслеживание программы альвеолярных эпителиальных клеток типа 2 с течением времени в культуре. Экспрессия альвеолярного белка поверхностно-активного вещества типа 2 типа C tdTomato, полученная из IPSC, сохранялась при повторном нанесении в 3D-матрицу в виде сфер и при нанесении на вставки клеточной культуры. Трансепителиальное электрическое сопротивление может быть измерено для определения целостности культуры раздела воздух-жидкость.
При попытке этой процедуры избегайте чрезмерной диссоциации либо механической пипеткой, либо ферментативным пищеварением, поскольку это может привести к низкой жизнеспособности клеток и плохой выживаемости. Дополнительными методами, выполняемыми после этой процедуры, являются измерения трансэпителиального электрического сопротивления для анализа барьерной целостности, добавление вирусов или соединений для стимуляции клеток, иммунофлуоресценция и сбор РНК, белка или надподобия. Этот метод проложил путь для исследователей для изучения новых вопросов биологии легких и заболеваний, таких как вирусы, такие как SARS COVID-2 или соединения, такие как пары электронных сигарет, влияют на альвеолярный эпителий.
