Detta protokoll beskriver en metod för odling och passering av en viktig cellpopulation i lungan och etablerar en fysiologiskt relevant plattform för miljöexponering. Den största fördelen med denna teknik är att den kan användas för att undersöka lungbiologi i samband med homeostas och sjukdom. Denna metod kan ge insikter, särskilt om lungsjukdomar som påverkar lungalveoler, inklusive de som orsakas av genetiska varianter, miljöexponeringar, smittämnen eller en kombination av dessa faktorer.
Demonstrerar proceduren kommer att vara jag och Rhiannon Werder, assisterad av Kristy Abo, en MD, doktorand, och Olivia Hix, en laboratoriechef från våra laboratorier. Först aspirera alla CK DCI-mediet från 3D-matrisdropparna som innehåller alveolosfärer härledda från riktad differentiering i 12-brunnsplattan. Tillsätt en milliliter dispas per droppe.
Pipettera försiktigt droppen i dispasen med en P-1000-pipett. Efter inkubation överför de dissocierade organoiderna från en matrisdroppe i dispasen till ett 15-milliliter koniskt rör. Tillsätt 10 ml Iscove's Modified Dulbecco's Medium och centrifugera vid 300 x g i fem minuter vid rumstemperatur.
Aspirera supernatanten så mycket som möjligt. Resuspend cellerna i en milliliter 0,05% trypsin per droppe och överför den tillbaka till 12-brunnsplattan. Inkubera detta vid 37 grader Celsius i 12 till 15 minuter innan du observerar dissociationen under mikroskopet och undvik att pipettera cellerna.
Vid slutet av inkubationen erhålles en enda cellsuspension. Stoppa trypsins verkan med en lika stor volym fetalt bovint seruminnehållande medium, följt av centrifug vid 300 x g i fem minuter. Tvätta cellerna med 10 ml IMDM före nästa centrifugering.
Återsuspendera cellerna i en lämplig volym för räkning. Och räkna sedan cellerna med en hemocytometer. Generera alveolosfärer genom att plätera encellssuspension av iAT2-celler i 3D-matrisen eller på cellodlingsinsatser för luft-vätskegränssnittsodling.
Efter att ha räknat cellerna bestämmer du antalet önskade celler som ska spelas upp i 3D-matrisen och centrifugerar cellerna vid 300 x g i fem minuter vid rumstemperatur. Ta bort så mycket supernatant som möjligt med en pipett och resuspendera snabbt cellerna i 3D-matrisen. Dispensera en 3D-matrisdroppe i en brunn med förvärmd 12-brunnsplatta med en P-200-pipett utan att skapa bubblor i matrisdroppen och utan att låta cellsuspensionen sätta sig medan flera droppar dispenseras.
Placera plattan i en 37 grader Celsius inkubator i 20 till 30 minuter för att låta matrisdropparna polymerisera, tillsätt sedan en milliliter CK DCI 10 mikromolar Y-27632 medium per brunn för att täcka matrisdroppen. Byt medium till CK DCI utan 10 mikromolar Y-27632 efter 72 timmar och byt ut det med färsk CK DCI var 48: e till 72: e timme. Förbered nybelagda 6,5 millimeters cellodlingsinsatser en timme före användning genom att späda ut 2D-matrisen i Dulbeccos modifierade Eagle Medium /Nutrient Mixture F-12 till arbetslösningen.
Tillsätt sedan 100 mikroliter av den utspädda matrisen per 6,5 millimeter cellodlingsinsats. Låt matrisen polymerisera i en 37 grader Celsius inkubator i 30 minuter eller vid rumstemperatur från en timme. Aspirera överskottsmatrisen från cellodlingsinsatserna med hjälp av en pipett.
Skölj den med DMEM F-12 och aspirera omedelbart denna tvätt innan du lägger till cellerna. Centrifugera cellerna vid 300 x g i fem minuter och ta bort så mycket supernatant som möjligt. Återsuspendera cellerna i lämplig volym för att fröa med 100 mikroliter CK DCI 10 mikromolar Y-27632 per cellodlingsinsats och tillsätt 100 mikroliter till det apikala facket i cellodlingsinsatsen.
Agitera försiktigt plattan i ett korsmönster för att säkerställa en jämn fördelning av celler och kontrollera den under ett mikroskop vid 10X mål. Tillsätt 500 mikroliter av CK DCI 10 mikromolar av Y-27632 till basolateralfacket i varje cellodlingsinsats, och 48 timmar efter sådd, aspirera det apikala mediet med hjälp av en pipett för att initiera luft-vätskegränssnittet. Efter 72 timmar byter du basolateralmediet till CK DCI utan 10 mikromolar Y-27632, följt av att ersätta det basolaterala mediet med färsk CK DCI var 48: e till 72: e timme i upp till 28 dagar efter plätering.
De representativa flödescytometriresultaten visar hur lätt det är att visualisera för SPC2-linjen med en tdTomato-reporter riktad mot det endogena ytaktiva proteinet C-locus och spårning av typ 2 alveolära epitelceller program över tid i odling. Det IPSC-härledda alveolära typ 2-celltensaktiva proteinet C tdTomato-uttrycket bibehölls när det pläterades om i 3D-matrisen som sfärer och när det pläterades på cellodlingsinsatser. Transepitelial elektrisk resistans kan mätas för att bestämma integriteten hos luft-vätskegränssnittskulturen.
När du försöker denna procedur undvik överdriven dissociation genom antingen mekanisk pipettering eller enzymatisk matsmältning eftersom detta kan leda till låg cellviabilitet och dålig överlevnad. Ytterligare metoder som utförs efter denna procedur är mätningar av transepitelial elektrisk resistens mot analysbarriärintegritet, tillsats av virus eller föreningar för att stimulera cellerna, immunofluorescens och RNA, protein eller supernatantuppsamling. Denna teknik banade väg för forskare att utforska nya lungbiologiska och sjukdomsfrågor, till exempel hur virus som SARS COVID-2 eller föreningar som elektroniska cigarettångor påverkar det alveolära epitelet.
