三磷酸化是生物学中普遍存在的5'修饰RNA，越来越多地用于生物技术应用。这里概述的方案能够对通过标准自动合成制备的任何寡核苷酸进行5'三磷酸化。化学三磷酸化作用于含有RNA，DNA或非天然核酸的寡核苷酸。
在这里，合成三磷酸化的左手L-RNA，生物D-RNA的对映异构体，被纯化并用于核糖体反应。三磷酸化在自动寡核苷酸合成后和脱保护前进行。这些步骤在这里没有显示，但研究人员应该熟悉两者的标准方法。
首先，确保磷酸化工作空间具有至少具有两条管路的气体歧管，并且鼓泡器连接到压力可调的干燥氩气源，因为三磷酸化反应必须在氩气下进行。然后将一毫升塑料注射器连接到管路上，以方便连接到反应装置。接下来，收集设备，包括一毫升塑料注射器，一个三通聚丙烯旋塞阀，不粘结针，1.5毫升聚丙烯管，一个小金属刮刀，并将它们存放在密封容器或干燥器中，室温下干燥剂在使用前至少一天。
在氩气压力下，从密封瓶中取出30毫升无水1，4-二恶烷。转移到干燥的30毫升玻璃瓶中，加入干燥陷阱。用橡胶隔膜密封，并存放在带有干燥剂的干燥器中。
类似地，制备30毫升N，N-二甲基甲酰胺、乙腈以及三份二恶烷和一份吡啶的混合物。如手稿中所述，将固体三丁基焦磷酸铵与二甲基甲酰胺和三丁胺混合在30毫升玻璃瓶中制备TBAP溶液。添加三个绘图陷印。
用橡胶隔膜将瓶子密封在氩气下，用氩气泡30分钟。使用自动DNA / RNA合成器在合成柱上制备具有游离5'羟基的寡核苷酸后。通过将柱塞从干燥的一毫升注射器中取出来准备腔室。
使用剪刀或剃须刀片切掉注射器的顶部，并将注射器连接到合成柱上。在注射器的顶部，连接三通旋塞阀，并将旋塞阀的侧入口连接到带有鼓泡器的干燥氩气源，以便旋塞阀的顶部入口充当试剂注入端口。将此操作员固定在带有夹具的支架上，并用蜡密封膜密封所有上游接头。
然后调整旋塞阀，使注射口关闭，设备向氩气源开放。关闭起泡器，让低压下的氩气流过作用室五分钟。重新打开起泡器后，将注射器连接到合成柱的底部，这将是废物注射器。
接下来，使用废液注射器反复拉动氩气穿过柱子，然后在柱塞完全推入的情况下重新连接注射器。要添加试剂或溶剂，请将针头连接到干燥的氩气源上，然后将其插入试剂或溶剂瓶隔中，注意不要将针头浸入瓶中内容物中。然后用针头组装一个干燥的注射器，并将其插入试剂或溶剂瓶隔中，而不将其浸入瓶内物品中。
然后，用氩气填充注射器，从隔膜中取出针头并排出氩气。在注射器中充满氩气并再次排出后，在氩气压力下用所需体积的溶剂或试剂填充注射器。调整旋塞阀，使氩气源关闭，注入口打开。
一旦快速调整设备上的停止，从源瓶中取出填充的注射器和针头，擦去粘在针头侧面或尖端的任何溶剂，然后将针头插入注射口。随后将试剂排出到操作人员的反室中，取出针头并关闭注射口，同时将设备重新打开至氩源。使用废注射器轻轻地从反室中吸取液体，一直通过合成柱，以便现在所有液体都保存在废液注射器中。
现在慢慢地将溶液推回合成柱中，确保色谱柱中没有气泡。要混合或搅拌，请用废注射器在色谱柱上轻轻上下拉溶液。要从色谱柱中取出试剂或溶剂，请将溶液缓慢拉入废注射器中。
在大部分溶液进入废注射器后，拉入氩气以冲洗柱中的剩余溶剂。接下来，取下废液注射器接头周围的蜡密封膜。然后取出注射器并丢弃废物溶液。
然后，用新的干式注射器替换废注射器并重新密封接头。组装三磷酸化装置后，通过向反室中加入200微升吡啶二恶烷开始三磷酸化反应，如前所述。但不要将样品拉到合成柱上。
如手稿中所述，将SalPCl溶解在二恶烷中后，将其添加到反室并使用干燥注射器加载到合成柱上。然后让它反应15分钟，然后使用废物注射器除去并丢弃SalPCl溶液，如前所述。在除去SalPCl溶液后，立即将250微升TBAP溶液加入反室并加载到合成柱上。
让它用搅拌反应20分钟，并如前所述丢弃。之后，用0.5毫升N，N-二甲基甲酰胺洗涤色谱柱，然后用0.5毫升乙腈洗涤，每次加入后除去溶剂。加入氧化剂溶液后，取出并再次用乙腈洗涤色谱柱，使用所示的相同程序，拆卸设备并用5毫升乙腈洗涤色谱柱。
之后，干燥色谱柱。从固体载体中切割出三磷酸化寡核苷酸，并使用手稿中描述的标准方案进行脱保护。接下来，将干燥的脱保护寡核苷酸溶解在尿素加载缓冲液中，加热至80摄氏度，然后加载到聚丙烯酰胺凝胶上，并在25至35瓦下运行一至两个小时。
在凝胶电泳结束时，取出凝胶板后，将其拆卸并用聚氯乙烯薄膜包裹凝胶。接下来，通过用254纳米紫外光背影来识别产品条带，并使用剃须刀片切除主要产品条带。通过塑料注射器挤出或机械粉碎切除的凝胶。
对于短于15个核苷酸的寡核苷酸，在三倍于凝胶体积的核酸酶游离水中洗脱至少12小时，搅拌或摇晃。然后通过将溶液通过装有0.2微米过滤器的注射器来除去固体凝胶块，并通过冻干浓缩。浓缩后，使用一次性尺寸排阻柱除去残留的盐和礼炮，并通过冻干浓缩，如前所述。
如手稿中所述，制备含有聚合酶核酶和L-RNA引物模板以及三磷酸三核苷酸的10微升RNA溶液后，将其加热至90摄氏度一分钟，并在PCR热循环仪中以每秒0.2摄氏度的速度将其冷却至23摄氏度。在17摄氏度下孵育RNA溶液后，随着反应的进行，通过添加10微升两倍浓度的起始缓冲液来停止反应，取10微升等分试样并在pH 8下用5微升0.5摩尔EDTA淬灭，并按照手稿中所述处理每个样品以分离RNA。将沉淀的RNA溶解在10微升的正式凝胶上样缓冲液中，并制备未反应的末端标记引物，如文中所述。
制备样品后，加热至80摄氏度。在每孔中加载5微升样品，并以40瓦特运行凝胶约40分钟。从支架上取下凝胶板后，使用荧光或磷光凝胶扫描仪进行扫描，以可视化交叉手性L-RNA延伸产物。
凝胶纯化后，紫外线背影显示5'三磷酸盐作为单一主要产物的存在，如AAA和CCC DNA三聚体以及GAA L-RNA三聚体所示。5'羟基侧产物通常可见为较慢的迁移条带，通过DNA三聚体的质谱分离和鉴定。凝胶纯化过程中的其他条带与未纯化反应产物的质谱中的5'二磷酸盐，单磷酸盐和H-膦酸盐侧产物相关。
5'三磷酸产物显示对应于5'三磷酸以及5'二和单磷酸质量的初级质量峰。化学上三磷酸相关的L-RNA三核苷酸与L-RNA引物和L-RNA模板一起用于PAGE分析的RNA聚合反应，并使用荧光凝胶扫描仪进行成像。用黑色圆圈标记的扩展产物展示了由模板编码的锤头核酶的L-RNA版本的合成。
在三磷酸化过程中暴露于水中会降低产量。按照步骤制备干燥试剂并仔细组装反应装置。缓慢地将流体穿过设备，以避免密封破裂。
化学三磷酸化对于制备非生物寡核苷酸三磷酸盐（包括左手RNA）至关重要。这使得生物学中发现的RNA分子的镜像版本的交叉手性核酶合成成为可能。
