Name: culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes
Uploaded: 2022-03-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes at JoVE.com

Nous remercions les membres du Département des sciences biologiques de l’Université George Washington pour leur lecture critique du manuscrit. Toutes les figures graphiques ont été réalisées à l’aide de BioRender. Recherche dans l’I. E., J. H., et D. O’H. les laboratoires ont été soutenus par l’Université George Washington et le Columbian College of Arts and Sciences, facilitant les fonds et les fonds de recherche interdisciplinaires.

1. Production de juvéniles infectieux de nématodes symbiotiques
<ol><li>Couvrir une boîte de Pétri (10 cm) avec un morceau de papier filtre et ajouter environ 10 à 15 larves de Galleria mellonella (Figure 1A).</li>
	<li>À l’aide d’une pipette, distribuer 2 mL d’eau contenant environ 25 à 50 UI par suspension de 10 μL sur les vers de cire. Conservez la boîte de Petri dans une armoire à température ambiante.</li>
	<li>Selon l’humidité du papier f...

<ol>
	<li>Lacey, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+pathogens+as+biological+control+agents:+Back+to+the+future.">Insect pathogens as biological control agents: Back to the future.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).</li><li>Ozakman, Y., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematode+infection+and+antinematode+immunity+in+Drosophila.">Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila.</a> Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).</li><li>Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+virulence+factors+from+Heterorhabditis+bacteriophora+highlight+its+utility+as+a+model+parasite+among+Clade+V+nematodes.">Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes.</a> International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).</li><li>Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+faces+of+nematode+infection:+Virulence+and+immunomodulatory+molecules+from+nematode+parasites+of+mammals,+insects+and+plants.">The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).</li><li>Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+immune+responses+to+nematode+parasites.">Insect immune responses to nematode parasites.</a> Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).</li><li>Eleftherianos, I., Heryanto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+insights+into+the+insect+immune+response+to+nematode+infection.">Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection.</a> Genes. 12 (2), 202 (2021).</li><li>Ciche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+genome+of+Heterorhabditis+bacteriophora.">The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora.</a> WormBook. , 1-9 (2007).</li><li>Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partners+in+crime:+symbiont-assisted+resource+acquisition+in+Steinernema+entomopathogenic+nematodes.">Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes.</a> Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).</li><li>Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -. H., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+is+a+self-fertilizing+hermaphrodite+and+a+genetically+tractable+system+for+the+study+of+parasitic+and+mutualistic+symbiosis.">The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis.</a> Genetics. 220 (1), (2021).</li><li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus:+two+roads+to+the+same+destination.">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).</li><li>Abd-Elgawad, M. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photorhabdus+spp.:+An+overview+of+the+beneficial+aspects+of+mutualistic+bacteria+of+insecticidal+nematodes.">Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes.</a> Plants. 10 (8), 1660 (2021).</li><li>Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+of+the+genus+Xenorhabdus,+a+novel+source+of+bioactive+compounds.">Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).</li><li>Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematodes,+bacteria,+and+flies:+a+tripartite+model+for+nematode+parasitism.">Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism.</a> Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).</li><li>Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+infecting+Drosophila+adult+flies+with+insect+pathogenic+nematodes.">A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes.</a> Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).</li><li>Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+gene+transcription+in+Drosophila+adult+flies+infected+by+entomopathogenic+nematodes+and+their+mutualistic+bacteria.">Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).</li><li>Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+tri-trophic+interaction+between+insects,+nematodes+and+Photorhabdus.">Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus.</a> Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).</li><li>Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+insect+pathogen+bacteria+Bacillus+thuringiensis+and+Xenorhabdus/Photorhabdus+occupy+their+hosts.">How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).</li><li>Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photorhabdus+and+a+host+of+hosts.">Photorhabdus and a host of hosts.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).</li><li>Ozakman, Y., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+interactions+between+Drosophila+and+the+pathogen+Xenorhabdus.">Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus.</a> Microbiological Research. 240, 126568 (2020).</li><li>Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+generating+axenic+entomopathogenic+nematodes.">An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes.</a> BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).</li><li>Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+entomopathogenic+nematode,+Steinernema+carpocapsae,+reared+on+mutant+and+wild-type+Xenorhabdus+nematophila.">Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila.</a> Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).</li><li>McMullen, J. G., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+rearing+of+entomopathogenic+nematodes+(Steinernematidae+and+Heterorhabditidae).">In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae).</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).</li></ol>

Comprendre la base moléculaire de l’infection par les nématodes entomopathogènes et de l’immunité anti-nématodes des insectes nécessite la séparation des parasites des bactéries associées mutuellement 13,15,16. Les nématodes entomopathogènes H. bacteriophora et S. carpocapsae vivent respectivement avec les bactéries à Gram négatif P. luminescens et X. nematophila,<sup class="...

La recherche sur les nématodes entomopathogènes (EPN) s’est intensifiée au cours des dernières années en raison principalement de l’utilité de ces parasites dans les stratégies de lutte intégrée contre les ravageurs et de leur implication dans la recherche biomédicale fondamentale 1,2. Des études récentes ont établi l’EPN comme organisme modèle dans lequel examiner les composants génétiques des nématodes qui sont activés au cours des différentes étapes du processus d’infection. Ces informations fournissent des indices critiques sur la nature et le nombre de molécules sécrétées par les parasites pour modifier la physiologie de l’hôte et déstabiliser la réponse immunitaire innée des insectes 3,4. Simultanément, ces connaissances sont généralement complétées par de nouveaux détails sur le type de voies de signalisation immunitaire de l’insecte hôte et les fonctions qu’elles régulent pour restreindre l’entrée et la propagation des agents pathogènes 5,6. Comprendre ces processus est crucial pour envisager les deux côtés de l’interaction dynamique entre l’EPN et leurs hôtes insectes. Une meilleure appréciation de la relation EPN-insecte hôte facilitera sans aucun doute des études similaires avec des nématodes parasites de mammifères, ce qui peut conduire à l’identification et à la caractérisation des facteurs d’infection qui interfèrent avec le système immunitaire humain.
Les nématodes EPN Heterorhabditis sp. et Steinernema sp. peuvent infecter un large éventail d’insectes, et leur biologie a été intensément étudiée précédemment. Les deux parasites nématodes diffèrent dans leur mode de reproduction, Heterorhabditis étant autofertilisé et Steinernema subissant une reproduction amphimique, bien que récemment S. hermaphroditum se reproduise par auto-fécondation d’hermaphrodites ou par parthénogenèse 7,8,9. Une autre différence entre les nématodes Heterorhabditis et Steinernema est leur mutualisme symbiotique avec deux genres distincts de bactéries à Gram négatif, Photorhabdus et Xenorhabdus, respectivement, qui sont tous deux de puissants agents pathogènes des insectes. Ces bactéries se trouvent au stade juvénile infectieux (IJ) vivant librement et non nourrissant de l’EPN, qui détectent les hôtes sensibles, accèdent à l’hémocèle d’insecte où ils libèrent leurs bactéries associées qui se répliquent rapidement et colonisent les tissus des insectes. L’EPN et leurs bactéries produisent des facteurs de virulence qui désarment les défenses des insectes et nuisent à l’homéostasie. Après la mort des insectes, les SI nématodes se développent pour devenir des EPN adultes et compléter leur cycle de vie. Une nouvelle cohorte d’IJ formée en réponse à la privation de nourriture et à la surpopulation dans le cadavre d’insectes émerge finalement dans le sol pour chasser les hôtes appropriés 9,10,11,12.
Ici, un protocole efficace pour maintenir, amplifier et manipuler génétiquement les nématodes EPN est décrit. En particulier, le protocole décrit la réplication des IJ symbiotiques de H. bacteriophora et de S. carpocapsae , la génération de nématodes inématiques, la production d’hermaphrodites de H. bacteriophora pour la microinjection, la préparation de l’ARNds et la technique de microinjection. Ces méthodes sont essentielles pour comprendre la base moléculaire de la pathogénicité des nématodes et l’immunité anti-nématodes de l’hôte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Megascript T7 Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>611770250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T25</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T75</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChoiceTaq Mastermix</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>C775Y42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470200-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn syrup</td>
			<td>MP Biomedicals/VWR</td>
			<td>IC10141301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Femtotips Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28320-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galleria mellonella waxorms</td>
			<td>Petco</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-464</td>
			<td>50 x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loop</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-3</td>
			<td>1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td>LB agar miller powder 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>LB broth miller powder 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM IRB Inverted Research Microscope</td>
			<td>Microscope Central</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacConkey medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M7408-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76332-064</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305155</td>
			<td>22G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient broth</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>70122-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partitioned Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490005-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-732</td>
			<td>Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Azenta</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>BAF199230001</td>
			<td>Bel-Art Disposable Pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>60 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 10 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-192</td>
			<td>35 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone #3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>211693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes

Les nématodes entomopathogènes des genres Heterorhabditis et Steinernema sont des parasites obligatoires des insectes qui vivent dans le sol. La principale caractéristique de leur cycle de vie est l’association mutualiste avec les bactéries Photorhabdus et Xenorhabdus, respectivement. Les parasites nématodes sont capables de localiser et d’entrer dans des hôtes d’insectes appropriés, de subvertir la réponse immunitaire des insectes et de se multiplier efficacement pour produire la prochaine génération qui chassera activement de nouvelles proies d’insectes à infecter. En raison des propriétés de leur cycle de vie, les nématodes entomopathogènes sont des agents de lutte biologique populaires, qui sont utilisés en combinaison avec des insecticides pour lutter contre les insectes nuisibles agricoles destructeurs. Simultanément, ces nématodes parasites représentent un outil de recherche pour analyser la pathogénicité des nématodes et les réponses anti-nématodes de l’hôte. Cette recherche est facilitée par le développement récent de techniques génétiques et d’approches transcriptomiques pour comprendre le rôle des molécules sécrétées par les nématodes au cours de l’infection. Ici, un protocole détaillé sur le maintien des nématodes entomopathogènes et l’utilisation d’une procédure d’élimination des gènes est fourni. Ces méthodologies favorisent davantage la caractérisation fonctionnelle des facteurs d’infection par les nématodes entomopathogènes.

Pour évaluer le statut des nématodes H. bacteriophora qui ont subi l’axenisation, la présence ou l’absence de colonies bactériennes de P. luminescens dans les IJ a été déterminée. Pour ce faire, une pastille d’environ 500 UI qui avait déjà été stérilisée en surface et homogénéisée dans le PBS a été collectée. Le traitement témoin positif consistait en une pastille d’environ 500 IJ provenant de la culture de nématodes contenant des bactéries symbiotiques P. luminescens<...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes at JoVE.com

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Les nématodes entomopathogènes vivent en symbiose avec les bactéries et, ensemble, ils infectent avec succès les insectes en sapant leur système immunitaire inné. Pour promouvoir la recherche sur la base génétique de l’infection par les nématodes, des méthodes de maintien et de manipulation génétique des nématodes entomopathogènes sont décrites.

Cultiver et manipuler génétiquement des nématodes entomopathogènes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Un protocole efficace pour maintenir et amplifier les nématodes entomopathogènes est essentiel pour comprendre la base moléculaire de la pathogénicité des nématodes et l’immunité anti-nématodes de l’hôte. Ce protocole nous permet de produire un grand nombre d’Heterorhabditis bacteriophora symbiotiques et axeniques et de Steinernema carpocapsae IJs en utilisant l’insecte hôte, Galleria mellonella. Commencez par recouvrir la boîte de Pétri d’un morceau de papier filtre et ajoutez environ 10 à 15 larves de Galleria mellonella.À l’aide d’une pipette, distribuer deux millilitres d’eau contenant environ 25 à 50 juvéniles infectieux pour 10 microlitres de suspension sur les vers de cire. Et conservez la boîte de Petri dans une armoire à température ambiante. Selon l’humidité du papier filtre, ajoutez un à deux millilitres d’eau tous les deux jours.Les vers de cire infectés par des juvéniles infectieux meurent généralement dans les 48 heures. Préparez les pièges à eau de White environ 10 jours après que les vers de cire ont été infectés par les juvéniles infectieux. Transférez soigneusement les insectes morts sur la partie non trempée du papier filtre.Utilisez de l’eau du robinet pour remplir la boîte de Petri inférieure et placez un bouchon d’un tube de 15 millilitres comme espaceur pour la ventilation. Utilisez de l’eau du robinet au lieu de l’eau déminéralisée ou désionisée pour éviter l’agrégation des nématodes et assurez-vous que le niveau d’eau dans le piège à eau atteint environ la moitié de la hauteur de la boîte de Pétri. Lorsque l’eau de la petite boîte de Pétri devient trouble à cause des nématodes, utilisez une pipette pour déplacer la nouvelle génération de juvéniles infectieux dans une fiole de culture cellulaire T25 ou T75.Plus tard, ajoutez de l’eau du robinet jusqu’à 40% de volume ou jusqu’à ce que la densité appropriée soit atteinte. Et stockez la fiole de culture cellulaire horizontalement pour éviter la congestion des nématodes. Transfert répété de juvéniles infectieux dans des flacons de culture cellulaire et ajout d’eau jusqu’à ce que les juvéniles infectieux cessent de sortir des carcasses d’insectes dans environ trois à cinq jours.À l’aide d’une boucle d’inoculation, grattez plusieurs flocons d’une culture congelée de Photorhabdus temperata Ret16 sur une plaque MacConkey et des stries pour des colonies individuelles. Incuber la plaque pendant deux à trois jours à 28 degrés Celsius. Après l’incubation, inoculer 10 millilitres de bouillon LB avec une colonie sur gélose MacConkey dans un tube de 50 millilitres et incuber la culture pendant la nuit à 28 degrés Celsius dans un incubateur agité.Après l’incubation, transférer 100 microlitres de culture pendant la nuit d’un tube de 50 millilitres dans un nouveau tube de microcentrifugation, puis laver 100 de la culture pendant la nuit avec 900 microlitres de PBS à force unique par centrifusion, dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, à 17 900 fois g. Décantez le surnageant. Ensuite, diluez la culture 10 fois dans un PBS à force unique et laissez le tube sur de la glace.Maintenant, immergez les vers de cire dans une solution à 70% d’éthanol. Après avoir séché les insectes avec une serviette en papier, placez-les dans un tube de 50 millilitres. Placez le tube sur de la glace pendant 20 minutes pour immobiliser les vers de cire.Utilisez du papier filtre pour couvrir les moitiés supérieure et inférieure d’une boîte de Pétri. Utilisez le couvercle de la boîte de Petri recouvert de papier filtre comme support de base pour l’injection. Humidifiez dans le papier filtre de la boîte de Petri inférieure et transférez-le sur de la glace pour aider les vers de cire injectés à récupérer.Pipette 50 microlitres de bactéries glacées sur un morceau de Parafilm puis préparer une seringue à aiguille de raffineur de calibre 22 et appuyer doucement sur le piston pour retirer l’air à l’extrémité de l’aiguille. Garder un ver de cire près de l’extrémité postérieure sous le stéréoscope. Injecter une culture bactérienne dans la face dorsale du thorax.De préférence à la jonction entre deux segments juste en dessous de la cuticule parallèle au ver de cire pour minimiser les dommages internes et faire attention à la façon dont le corps larvaire commence à gonfler. Ensuite, transférez les insectes injectés dans la boîte de Petri de récupération. Et une fois que tous les insectes sont injectés et placés dans la boîte de récupération, placez la boîte de Petri dans l’obscurité.Les vers de cire succombent deux jours après l’injection et apparaissent rouge brique après environ trois à quatre jours. Cependant, les insectes de couleur brune indiquent une infection bactérienne infructueuse. Sept jours après l’infection, transférez les insectes de la couleur rouge brique caractéristique sur une boîte de Petri recouverte de papier filtre frais et répétez la production de juvéniles infectieux de nématodes symbiotiques.Pour commencer la stérilisation de surface, recueillir suffisamment de symbiotiques, Heterorhabditis bacteriophora et de juvéniles infectieux axeniques candidats par centrifugation. Pour fabriquer une pastille dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre, ajoutez 500 microlitres d’eau de Javel à 5 % à la pastille dans chaque tube de microcentrifugation et inversez le tube. Après une incubation de 10 minutes, centrifuger à 17 900 fois g pendant une minute et retirer le surnageant.Ensuite, lavez la pastille avec un millilitre d’eau stérile. Centrifugez-le, retirez le surnageant et répétez cette procédure quatre fois de plus. Le graphique montre les résultats de l’évaluation de l’état des nématodes Heterorhabditis bacteriophora qui ont subi une axenisation.Heterorhabditis bacteriophora de la culture mère portait des cellules symbiotiques Photorhabdus luminescens. Cependant, les nématodes dépourvus de leurs bactéries Associées Photorhabdus luminescens étaient axeniques. Pour maintenir la reproductibilité de votre expérience, striez toujours fraîchement de la culture bactérienne d’une colonie fraîche et retirez la culture pendant la nuit avant qu’elle n’atteigne la face stationnaire.N’utilisez que le ver de cire Galleria rouge brique pour le piège à eau de White et jetez le reste. Après cette procédure, les nématodes peuvent être utilisés pour étudier l’interaction avec le système immunitaire des insectes. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour explorer les bases moléculaires du parasitisme des nématodes et de l’immunité anti-nématodes de l’hôte.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Écrans à haut débit et faible avec Les nématodes à galles Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

Recherche

Immunologie et infection

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

Parasite induite génétiquement Driven maladies auto-immunes coeur de Chagas dans le modèle de poulet

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases ...

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

TransFLP - Une méthode pour modifier génétiquement<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Basé sur la transformation naturelle et FLP-recombinaison

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Application clinique de<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia de culture du système nerveux central néonatale et de l&#39;adulte

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

La culture et entretien<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Dans un environnement anaérobie

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Nettoyage sélectif des nématodes sauvages de Caenorhabditis pour enrichir les bactéries du microbiome intestinal

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

Protocole économique et efficace pour isoler et cultiver des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

Culture de lymphocytes en microgravité simulée à l’aide d’un système de culture cellulaire rotatif

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Génération de sporozoïtes génétiquement modifiés à Plasmodium berghei

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of ...