Name: culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes
Uploaded: 2022-03-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes at JoVE.com

우리는 원고의 비판적 읽기에 대한 조지 워싱턴 대학의 생물 과학과의 구성원에게 감사드립니다. 모든 그래픽 수치는 BioRender를 사용하여 제작되었습니다. I. E., J. H., 및 D. O'H.에서의 연구. 실험실은 George Washington University와 Columbian College of Arts and Sciences가 기금과 학제 간 연구 기금을 촉진하여 지원해 왔습니다.

1. 공생선충류 감염성 청소년의 생산
<ol><li>페트리 접시 (10cm)를 여과지로 덮고 약 10-15 마리의 갤러리아 멜로 넬라 유충을 첨가하십시오 (그림 1A).</li>
	<li>피펫을 사용하여 현탁액 10 μL 당 약 25-50 IJ를 함유하는 물 2 mL를 왁스 웜 상에 분주한다. 페트리 접시를 실온에서 캐비닛에 보관하십시오.</li>
	<li>여과지의 습기에 따라 2 일마다 1-2 mL의 물을 첨가하십?...

<ol>
	<li>Lacey, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+pathogens+as+biological+control+agents:+Back+to+the+future.">Insect pathogens as biological control agents: Back to the future.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).</li><li>Ozakman, Y., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematode+infection+and+antinematode+immunity+in+Drosophila.">Nematode infection and antinematode immunity in Drosophila.</a> Trends in Parasitology. 37 (11), 1002-1013 (2021).</li><li>Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+virulence+factors+from+Heterorhabditis+bacteriophora+highlight+its+utility+as+a+model+parasite+among+Clade+V+nematodes.">Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes.</a> International Journal of Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).</li><li>Bobardt, S. D., Dillman, A. R., Nair, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+faces+of+nematode+infection:+Virulence+and+immunomodulatory+molecules+from+nematode+parasites+of+mammals,+insects+and+plants.">The two faces of nematode infection: Virulence and immunomodulatory molecules from nematode parasites of mammals, insects and plants.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 2983 (2020).</li><li>Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+immune+responses+to+nematode+parasites.">Insect immune responses to nematode parasites.</a> Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).</li><li>Eleftherianos, I., Heryanto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+insights+into+the+insect+immune+response+to+nematode+infection.">Transcriptomic insights into the insect immune response to nematode infection.</a> Genes. 12 (2), 202 (2021).</li><li>Ciche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+genome+of+Heterorhabditis+bacteriophora.">The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora.</a> WormBook. , 1-9 (2007).</li><li>Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partners+in+crime:+symbiont-assisted+resource+acquisition+in+Steinernema+entomopathogenic+nematodes.">Partners in crime: symbiont-assisted resource acquisition in Steinernema entomopathogenic nematodes.</a> Current Opinion in Insect Science. 32, 22-27 (2019).</li><li>Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -. H., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+entomopathogenic+nematode+Steinernema+hermaphroditum+is+a+self-fertilizing+hermaphrodite+and+a+genetically+tractable+system+for+the+study+of+parasitic+and+mutualistic+symbiosis.">The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis.</a> Genetics. 220 (1), (2021).</li><li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus:+two+roads+to+the+same+destination.">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Molecular Microbiology. 64 (2), 260-268 (2007).</li><li>Abd-Elgawad, M. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photorhabdus+spp.:+An+overview+of+the+beneficial+aspects+of+mutualistic+bacteria+of+insecticidal+nematodes.">Photorhabdus spp.: An overview of the beneficial aspects of mutualistic bacteria of insecticidal nematodes.</a> Plants. 10 (8), 1660 (2021).</li><li>Dreyer, J., Malan, A. P., Dicks, L. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+of+the+genus+Xenorhabdus,+a+novel+source+of+bioactive+compounds.">Bacteria of the genus Xenorhabdus, a novel source of bioactive compounds.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3177 (2018).</li><li>Hallem, E. A., Rengarajan, M., Ciche, T. A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematodes,+bacteria,+and+flies:+a+tripartite+model+for+nematode+parasitism.">Nematodes, bacteria, and flies: a tripartite model for nematode parasitism.</a> Current Biology. 17 (10), 898-904 (2007).</li><li>Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+infecting+Drosophila+adult+flies+with+insect+pathogenic+nematodes.">A novel method for infecting Drosophila adult flies with insect pathogenic nematodes.</a> Virulence. 3 (3), 339-347 (2012).</li><li>Castillo, J. C., Shokal, U., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+gene+transcription+in+Drosophila+adult+flies+infected+by+entomopathogenic+nematodes+and+their+mutualistic+bacteria.">Immune gene transcription in Drosophila adult flies infected by entomopathogenic nematodes and their mutualistic bacteria.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 179-185 (2013).</li><li>Eleftherianos, I., Joyce, S., Ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+tri-trophic+interaction+between+insects,+nematodes+and+Photorhabdus.">Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus.</a> Parasitology. 137 (11), 1695-1706 (2010).</li><li>Nielsen-LeRoux, C., Gaudriault, S., Ramarao, N., Lerelcus, D., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+insect+pathogen+bacteria+Bacillus+thuringiensis+and+Xenorhabdus/Photorhabdus+occupy+their+hosts.">How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 220-231 (2012).</li><li>Waterfield, N. R., Ciche, T., Clarke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photorhabdus+and+a+host+of+hosts.">Photorhabdus and a host of hosts.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 557-574 (2009).</li><li>Ozakman, Y., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+interactions+between+Drosophila+and+the+pathogen+Xenorhabdus.">Immune interactions between Drosophila and the pathogen Xenorhabdus.</a> Microbiological Research. 240, 126568 (2020).</li><li>Yadav, S., Shokal, U., Forst, S., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+generating+axenic+entomopathogenic+nematodes.">An improved method for generating axenic entomopathogenic nematodes.</a> BMC Research Notes. 8 (1), 1-6 (2015).</li><li>Mitani, D. K., Kaya, H. K., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+entomopathogenic+nematode,+Steinernema+carpocapsae,+reared+on+mutant+and+wild-type+Xenorhabdus+nematophila.">Comparative study of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae, reared on mutant and wild-type Xenorhabdus nematophila.</a> Biological Control. 29 (3), 382-391 (2004).</li><li>McMullen, J. G., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+rearing+of+entomopathogenic+nematodes+(Steinernematidae+and+Heterorhabditidae).">In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae).</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52096 (2014).</li></ol>

엔토모병원성 선충류 감염 및 곤충 항선충류 면역의 분자 기초를 이해하려면 상호 연관된 박테리아 13,15,16으로부터 기생충의 분리가 필요하다. 엔토모병원성 선충류 H. bacteriophora 및 S. carpocapsae는 각각 그람 음성 박테리아 P. luminescens 및 X. nematophila와 함께 살며,17. 두 박테리아 종 모...

entomopathogenic nematodes (EPN)에 대한 연구는 통합 해충 관리 전략에서 이러한 기생충의 유용성과 기본 생물 의학 연구 1,2에 대한 참여로 인해 지난 몇 년 동안 강화되었습니다. 최근 연구들은 EPN을 감염 과정의 여러 단계에서 활성화되는 선충류 유전 성분을 검사하는 모델 유기체로 확립했다. 이 정보는 숙주 생리학을 변화시키고 곤충 선천적 면역 반응을 불안정하게 하기 위해 기생충에 의해 분비되는 분자의 성질 및 수에 대한 중요한 단서를 제공한다(3,4). 동시에,이 지식은 일반적으로 곤충 숙주 면역 신호 전달 경로의 유형과 병원균 5,6의 진입 및 확산을 제한하기 위해 규제하는 기능에 대한 새로운 세부 사항에 의해 보완됩니다. 이러한 과정을 이해하는 것은 EPN과 곤충 숙주 간의 역동적 인 상호 작용의 양면을 구상하는 데 중요합니다. EPN-곤충 숙주 관계에 대한 더 나은 인식은 의심 할 여지없이 포유류 기생 선충류와의 유사한 연구를 촉진 할 것이며, 이는 인간 면역 체계를 방해하는 감염 인자의 확인 및 특성화로 이어질 수 있습니다.
EPN 선충류 Heterorhabditis sp. 및 Steinernema sp.는 광범위한 곤충을 감염시킬 수 있으며 생물학은 이전에 집중적으로 연구되었습니다. 두 선충류 기생충은 이종 횡문염이 스스로 수정되고 Steinernema가 양서류 번식을 겪고있는 번식 방식이 다르지만 최근에는 S. hermaphroditum이 헤르마프로디테스의 자체 수정 또는 분파생성 7,8,9을 통해 번식하는 것으로 나타났습니다. Heterorhabditis와 Steinernema 선충류의 또 다른 차이점은 곤충의 강력한 병원균 인 그람 음성 박테리아 인 Photorhabdus와 Xenorhabdus의 두 가지 별개의 속을 가진 공생 적 상호 작용입니다. 이 박테리아는 EPN의 자유 생활 및 비 먹이 감염성 청소년 (IJ) 단계에서 발견되며, 민감한 숙주를 탐지하고 곤충 헤모코엘에 접근하여 빠르게 복제되는 관련 박테리아를 방출하고 곤충 조직을 식민지화합니다. EPN과 박테리아 모두 곤충 방어를 해제하고 항상성을 손상시키는 독성 요인을 생성합니다. 곤충 사망 후, 선충류 IJ는 성인 EPN이되어 수명주기를 완료하기 위해 발전합니다. 곤충 사체 내에서 식량 부족과 과밀에 대응하여 형성된 새로운 IJ의 코호트가 마침내 토양에서 나타나 적절한 숙주 9,10,11,12를 사냥합니다.
여기에서, EPN 선충류를 유지, 증폭 및 유전적으로 조작하기 위한 효율적인 프로토콜이 기재되어 있다. 특히, 프로토콜은 공생 H. 박테리오포라 및 S. carpocapsae IJs의 복제, 축삭 선충류 IJs의 생성, 미세주사를 위한 H. 박테리오포라 헤르마프로디테스의 생산, dsRNA의 제조, 및 미세주사 기술을 개략적으로 기술한다. 이러한 방법은 선충류 병원성 및 숙주 항선충류 면역의 분자 기초를 이해하는 데 필수적입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Megascript T7 Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>611770250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T25</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask T75</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChoiceTaq Mastermix</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>C775Y42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470200-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn syrup</td>
			<td>MP Biomedicals/VWR</td>
			<td>IC10141301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Femtotips Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28320-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galleria mellonella waxorms</td>
			<td>Petco</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-553-464</td>
			<td>50 x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil 700</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loop</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-3</td>
			<td>1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td>LB agar miller powder 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>LB broth miller powder 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM IRB Inverted Research Microscope</td>
			<td>Microscope Central</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacConkey medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M7408-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76332-064</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305155</td>
			<td>22G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient broth</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>70122-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partitioned Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490005-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-732</td>
			<td>Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Azenta</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>BAF199230001</td>
			<td>Bel-Art Disposable Pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>60 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 10 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-192</td>
			<td>35 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone #3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>211693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes

Heterorhabditis 및 Steinernema 속의 Entomopathogenic 선충류는 토양에 사는 곤충의 의무적 인 기생충입니다. 그들의 수명주기의 주요 특징은 박테리아 Photorhabdus 및 Xenorhabdus와의 상호 연관성입니다. 선충류 기생충은 적절한 곤충 숙주를 찾아 진입하고, 곤충 면역 반응을 전복시키고, 효율적으로 번식하여 새로운 곤충 먹이를 적극적으로 사냥하여 감염시킬 다음 세대를 생산할 수 있습니다. 수명주기의 특성으로 인해 엔토모 병원성 선충류는 파괴적인 농업 곤충 해충을 방제하기 위해 살충제와 함께 사용되는 인기있는 생물학적 방제제입니다. 동시에,이 기생 선충류는 선충류 병원성을 분석하고 항 선충류 반응을 숙주로하는 연구 도구를 나타냅니다. 이 연구는 감염 동안 선충류 분비 분자의 역할을 이해하기위한 유전 기술 및 전사 학적 접근법의 최근 개발에 의해 도움을받습니다. 여기에서, 엔토모병원성 선충류를 유지하고 유전자 녹다운 절차를 사용하는 것에 대한 상세한 프로토콜이 제공된다. 이러한 방법론은 엔토모병원성 선충류 감염 인자의 기능적 특성화를 더욱 촉진한다.

축삭화를 거친 H. 박테리오포라 선충류의 상태를 평가하기 위해, IJs에서 P. luminescens 박테리아 콜로니의 존재 또는 부재를 결정하였다. 이를 위해, PBS에서 이전에 표면 멸균 및 균질화되었던 대략 500개의 IJs의 펠릿을 수집하였다. 양성 대조군 처리는 공생 P. 발광 박테리아를 함유하는 선충류 배양물로부터의 대략 500 IJs의 펠릿으로 구성되었다. 축삭 및 양성 대조군 선충류의 펠?...

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Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic 선충류는 박테리아와 공생하며 함께 선천적 인 면역 체계를 손상시켜 곤충을 성공적으로 감염시킵니다. 선충류 감염의 유전 적 기초에 대한 연구를 촉진하기 위해 엔토모 병원성 선충류를 유지하고 유 전적으로 조작하는 방법이 설명됩니다.

Entomopathogenic Nematodes 배양 및 유전자 조작

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

엔토모병원성 선충류를 유지하고 증폭시키기 위한 효율적인 프로토콜은 선충류 병원성 및 숙주 항선충류 면역의 분자 기초를 이해하는 데 필수적이다. 이 프로토콜을 통해 우리는 곤충 숙주 인 Galleria mellonella를 사용하여 많은 수의 공생 및 축압 이종 횡문염 박테리오포라 및 Steinernema carpocapsae IJ를 생산할 수 있습니다. 페트리 접시를 여과지로 덮고 약 10 ~ 15 마리의 갤러리아 멜로 넬라 유충을 첨가하십시오.피펫을 사용하여 10 마이크로 리터의 현탁액 당 약 25 ~ 50 명의 감염성 청소년이 들어있는 2 밀리리터의 물을 왁스 웜에 분배하십시오. 그리고 페트리 접시를 실온에서 캐비닛에 보관하십시오. 여과지의 습기에 따라 이틀에 한 두 밀리리터의 물을 넣으십시오.감염성 청소년에 감염된 왁스 웜은 대개 48 시간 이내에 사망합니다. 왁스 웜이 감염성 청소년에게 감염된 후 약 10 일 후에 White의 물 함정을 준비하십시오. 죽은 곤충을 여과지의 흠뻑 젖지 않은 부분으로 조심스럽게 옮기십시오.수돗물을 사용하여 바닥 페트리 접시를 채우고 환기를위한 스페이서로 15 밀리리터 튜브의 캡을 놓습니다. 탈염수 또는 탈이온수 대신 수돗물을 사용하여 선충류가 응집되지 않도록하고 물 트랩의 수위가 페트리 접시의 높이의 약 절반에 도달하도록하십시오. 작은 페트리 접시의 물이 선충류로 인해 흐려지면 피펫을 사용하여 새로운 세대의 감염성 청소년을 T25 또는 T75 세포 배양 플라스크로 옮깁니다.나중에 수돗물을 최대 40 % 부피 또는 적절한 밀도에 도달 할 때까지 첨가하십시오. 선충류 혼잡을 피하기 위해 세포 배양 플라스크를 수평으로 저장한다. 감염성 청소년을 세포 배양 플라스크로 옮기고 감염성 청소년이 약 사흘에서 오일 내에 곤충 사체에서 출현하는 것을 멈출 때까지 물을 첨가하는 것을 반복하십시오.접종 루프를 사용하여 Photorhabdus temperata Ret16의 얼어 붙은 배양물의 여러 조각을 MacConkey 플레이트에 긁어 내고 단일 콜로니에 대한 줄무늬를 긁어냅니다. 플레이트를 섭씨 28도에서 이틀에서 사흘 동안 배양한다. 배양 후, LB 배양액 10 밀리리터를 맥콘키 한천에 콜로니와 함께 50 밀리리터 튜브에 접종하고, 진탕 배양기에서 섭씨 28도에서 밤새 배양물을 배양한다.인큐베이션 후, 밤새 배양된 100 마이크로리터를 50 밀리리터 튜브로부터 새로운 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 이어서 밤새 배양물을 원심주입에 의해 900 마이크로리터의 단일 강도 PBS로 100 마이크로리터로 세척하고, 1.5 밀리리터 마이크로원심분리 튜브에서, 17, 900 배 g에서 세척한다. 상층액을 데칸트하십시오. 다음으로, 배양물을 단일 강도 PBS로 10회 희석하고 튜브를 얼음 위에 두었다.이제 왁스 웜을 70 % 에탄올 용액에 담그십시오. 종이 타월로 곤충을 말린 후 50 밀리리터 튜브에 넣으십시오. 튜브를 얼음 위에 20 분 동안 올려 놓고 왁스 웜을 고정시킵니다.여과지를 사용하여 페트리 접시의 위쪽과 아래쪽 절반을 덮으십시오. 여과지로 덮인 페트리 접시 뚜껑을 주사를위한 기본 지지대로 사용하십시오. 바닥 페트리 접시의 여과지에 촉촉하고 얼음에 옮겨 주입 된 왁스 웜이 회복되도록 도와줍니다.파라필름 조각에 얼음 차가운 박테리아 50 마이크로리터를 피펫한 다음 22 게이지 정련제 바늘 주사기를 준비하고 플런저를 부드럽게 눌러 바늘 끝에서 공기를 제거하였다. 왁스 웜을 스테레오 스코프 아래 후부 끝에 가깝게 유지합니다. 흉부의 등쪽에 박테리아 배양을 주입하십시오.바람직하게는 왁스 웜과 평행 한 큐티클 바로 아래의 두 세그먼트 사이의 접합부에서 내부 손상을 최소화하고 애벌레 몸체가 부풀어 오르기 시작하는 방법에주의를 기울이십시오. 다음으로, 주입 된 곤충을 회복 페트리 접시로 옮깁니다. 그리고 모든 곤충을 주입하고 회복 접시에 넣으면 페트리 접시를 어둠 속에 두십시오.왁스 웜은 주사 후 이틀 후에 굴복하고 약 사흘에서 나흘 후에 벽돌 빨간색으로 나타납니다. 그러나 갈색의 곤충은 실패한 박테리아 감염을 나타냅니다. 감염 후 칠일 후, 특징적인 벽돌 - 붉은 색의 곤충을 페트리 접시가 늘어선 신선한 여과지에 옮기고 공생 선충류 감염성 청소년의 생산을 반복하십시오.표면 살균을 시작하려면 원심분리를 통해 충분한 공생, 이종 횡문염 박테리오포라 및 후보 축삭 감염성 청소년을 수집하십시오. 1.5 밀리리터 원심분리 튜브에서 펠렛을 만들려면 500 마이크로 리터의 5 % 표백제를 각 마이크로 원심분리 튜브의 펠렛에 추가하고 튜브를 뒤집습니다. 10분 동안 배양한 후, 1분 동안 17, 900회 g에서 원심분리하여 상층액을 제거하였다.그런 다음 펠렛을 한 밀리리터의 멸균수로 씻으십시오. 원심 분리하고, 상층액을 제거하고이 과정을 네 번 더 반복하십시오. 그래프는 축삭화를 거친 이종횡문염 박테리오포라 선충류의 상태를 평가한 결과를 보여준다.스톡 배양물로부터의 이질횡문염 박테리오포라는 공생 광횡문부 발광 세포를 운반하였다. 그러나, 그들의 연관된 Photorhabdus luminescens 박테리아가 결여된 선충류는 축삭이었다. 실험의 재현성을 유지하려면 항상 신선한 식민지에서 박테리아 스톡 배양물을 갓 떼어내고 고정면에 도달하기 전에 하룻밤 동안 배양을 꺼냅니다.벽돌 빨간색 갤러리아 왁스 웜을 화이트의 물 함정에만 사용하고 나머지는 버리십시오. 이 절차 후, 선충류는 곤충 면역 체계와의 상호 작용을 조사하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술은 연구자가 선충류 기생의 분자 기초를 탐구하고 항 선충류 면역을 숙주로 삼을 수있는 길을 열어줍니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

루트 - 매듭 Nematodes과 높고 낮은 처리량 화면 Meloidogyne SPP.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

연구

면역학 및 감염병학

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

기생충은 치킨 모델에서 유전 힘입어 면역 Chagas의 심장 질환을 유발

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases ...

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

TransFLP - 유 전적으로 수정하는 방법<em&gt; 장염 cholerae</em&gt; 자연 변화와 FLP-재조합에 근거

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

배양 및 유지<em&gt; 클로 스트 리듐 디피</em&gt; 혐기성 환경에서

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

장내 미생물군유전체 박테리아를 위해 농축하는 야생 케노르하비티스 선충제의 선택적 세척

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

Rotary Cell Culture System을 사용하여 시뮬레이션된 미세중력에서 림프구 배양

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

유전자 변형 Plasmodium berghei Sporozoites 생성

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of ...