Name: bottom-up in vitro methods to assay the ultrastructural organization, membrane reshaping, and curvature sensitivity behavior of septins
Uploaded: 2022-08-17T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins at JoVE.com

Wij danken Patricia Bassereau en Daniel Lévy voor hun nuttige adviezen en discussies. Dit werk heeft de steun gekregen van het ANR (Agence Nationale de la Recherche) voor de financiering van het project "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 en het project "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin wordt gefinancierd door de Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" en Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa werd ondersteund door Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink werd ondersteund door de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) via de 'BaSyC-Building a Synthetic Cell'. Zwaartekrachtsuitkering (024.003.019). Wij danken de Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) en Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). We bedanken de Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, lid van de Franse nationale onderzoeksinfrastructuur France-BioImaging (ANR10-INBS-04).

1. Bepaling van membraanhervormen met behulp van gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs)
OPMERKING: In deze sectie worden GUVs gegenereerd om de membraanvervormingen na te bootsen die mogelijk worden veroorzaakt door septines in een cellulaire context. Inderdaad, in cellen worden septines vaak gevonden op plaatsen met micrometerkrommingen. GUVs hebben afmetingen variërend van enkele tot tientallen micrometers en kunnen worden vervormd. Ze zijn dus geschikt om eventuele septin...

<ol>
	<li>Finger, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reining+in+cytokinesis+with+a+septin+corral.">Reining in cytokinesis with a septin corral.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).</li><li>Barral, Y., Kinoshita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+shed+light+onto+septin+assemblies+and+function.">Structural insights shed light onto septin assemblies and function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).</li><li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+septin+diffusion+barrier+at+the+base+of+the+primary+cilium+maintains+ciliary+membrane+protein+distribution.">A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution.</a> Science. 329 (5990), 436-439 (2010).</li><li>Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+septin+family+in+spermiogenesis.">The role of the septin family in spermiogenesis.</a> Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).</li><li>Addi, C., Bai, J., Echard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+microtubule,+septin+and+ESCRT+filament+remodeling+during+late+steps+of+cytokinesis.">Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).</li><li>Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+microtubule-dependent+transport+by+septin+GTPases.">Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases.</a> Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).</li><li>Spiliotis, E. T., Nakos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+functions+of+actin-+and+microtubule-associated+septins.">Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins.</a> Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).</li><li>Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Po&#252;s, C., Baillet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+its+BORG2+and+BORG3+effectors+control+the+subcellular+localization+of+septins+between+actin+stress+fibers+and+microtubules.">Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules.</a> Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).</li><li>Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+septin-dependent+diffusion+barrier+at+dendritic+spine+necks.">A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks.</a> PloS One. 9 (12), 113916 (2014).</li><li>Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+surface+protein+of+guinea+pig+sperm+exhibits+free+diffusion+in+its+domain.">A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain.</a> The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).</li><li>Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-dependent+compartmentalization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+yeast+polarized+growth.">Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth.</a> The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).</li><li>Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+septin+cytoskeleton+facilitates+membrane+retraction+during+motility+and+blebbing.">The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing.</a> The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).</li><li>Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+functions+in+organ+system+physiology+and+pathology.">Septin functions in organ system physiology and pathology.</a> Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).</li><li>Angelis, D., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+mutations+in+human+cancers.">Septin mutations in human cancers.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).</li><li>Takehashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+3+gene+polymorphism+in+Alzheimer's+disease.">Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease.</a> Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).</li><li>Shuman, B., Momany, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+from+protists+to+people.">Septins from protists to people.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+septins:+supramolecular+organization+of+heterooligomers+and+the+mechanism+of+filament+assembly.">Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).</li><li>Iv, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+animal+septins+using+recombinant+human+septin+octamers+with+distinct+SEPT9+isoforms.">Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms.</a> Journal of cell science. 134 (15), (2021).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reshaping+by+micrometric+curvature+sensitive+septin+filaments.">Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments.</a> Nature communications. 10 (1), 420 (2019).</li><li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+plasma+membrane+curvature+is+recognized+by+the+septin+cytoskeleton.">Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton.</a> The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li><li>Patzig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin/anillin+filaments+scaffold+central+nervous+system+myelin+to+accelerate+nerve+conduction.">Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction.</a> eLife. 5, 17119 (2016).</li><li>Szuba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+binding+controls+ordered+self-assembly+of+animal+septins.">Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins.</a> eLife. 10, 63349 (2021).</li><li>Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-mediated+uniform+bracing+of+phospholipid+membranes.">Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes.</a> Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+promotes+budding+yeast+septin+filament+assembly+and+organization.">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization.</a> Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-based+readout+of+PI(4,5)P2+incorporation+into+membranes+of+giant+unilamellar+vesicles.">Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles.</a> Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD.">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-100+nm+wrinkling+of+polydimethylsiloxane+by+double+frontal+oxidation.">Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation.</a> Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).</li><li>Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontal+vitrification+of+PDMS+using+air+plasma+and+consequences+for+surface+wrinkling.">Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling.</a> Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).</li><li>Franck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+plaques+and+associated+actin+anchor+intermediate+filaments+in+skeletal+muscle.">Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).</li><li>Elkhatib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+clathrin/AP-2+lattices+pinch+collagen+fibers+to+support+3D+cell+migration.">Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration.</a> Science. 356 (6343), (2017).</li><li>Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+thin+coatings+of+Au/Pd,+Pt+and+Cr+produced+by+magnetron+sputtering+for+FE-SEM.">A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM.</a> Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).</li></ol>

Zoals hierboven vermeld, is een lipidenmengsel gebruikt dat de PI(4,5)P2-opname in de lipide bilaag verbetert en zo septine-membraaninteracties vergemakkelijkt. Inderdaad, we hebben elders25 aangetoond dat ontluikende gist septines interageren met blaasjes op een PI(4,5)P2-specifieke manier. Deze lipidesamenstelling werd empirisch aangepast door het screenen van meerdere samenstellingen en wordt nu veel gebruikt door de auteurs. PI(4,5)P2 lipiden moeten zorgvuldig ...

Septines zijn cytoskeletale filamentvormende eiwitten die interageren met lipidembranen. Septines zijn alomtegenwoordig in eukaryoten en essentieel voor tal van cellulaire functies. Ze zijn geïdentificeerd als de belangrijkste regulatoren van celdeling in ontluikende gist en zoogdieren 1,2. Ze zijn betrokken bij membraanhervormingsgebeurtenissen, ciliogenese3 en spermiogenese4. In zoogdiercellen kunnen septines ook interageren met actine en microtubuli 5,6,7 in een bindmiddel van Rho GTPases (BORG)-afhankelijke manier8. In verschillende weefsels (neuronen9, trilharen3, spermatozoa10) zijn septines geïdentificeerd als regulatoren van diffusiebarrières voor membraangebonden componenten11. Van septines is ook aangetoond dat ze membraanbleseming en uitsteekselvorming reguleren12. Septines, die multitaskende eiwitten zijn, zijn betrokken bij het ontstaan van verschillende veel voorkomende ziekten13. Hun misregulatie wordt geassocieerd met de opkomst van kankers14 en neurodegeneratieve ziekten15.
Afhankelijk van het organisme verzamelen verschillende septinesubeenheden (twee bij Caenorhabditis elegans tot 13 bij mensen) zich om complexen te vormen waarvan de organisatie varieert op een weefselafhankelijke manier16. De basis septinebouwsteen verzamelt twee tot vier subeenheden, aanwezig in twee kopieën en zelf geassembleerd op een staafachtige palindromische manier. In ontluikende gist zijn septines octamerisch17,18. In situ worden septines vaak gelokaliseerd op locaties met micrometerkromming; ze worden gevonden op delingsvernauwingsplaatsen, aan de basis van trilharen en dendrieten, en aan de annulus van spermatozoa19,20. Aan het membraan lijkt de rol van septines dubbel te zijn: ze zijn betrokken bij het hervormen van de lipide bilayer en bij het handhaven van de membraanintegriteit21. Daarom is het onderzoeken van de biofysische eigenschappen van septinefilamentvormende eiwitten en / of subeenheden aan het membraan cruciaal voor het begrijpen van hun rol. Om specifieke eigenschappen van septines in een goed gecontroleerde omgeving te ontleden, zijn bottom-up in vitro benaderingen geschikt. Tot nu toe hebben slechts enkele groepen de biofysische eigenschappen van septines in vitrobeschreven 20,22,23. Daarom blijft, in vergelijking met andere cytoskeletale filamenten, de huidige kennis over het gedrag van septines in vitro beperkt.
Dit protocol beschrijft hoe de organisatie van septinefilamenten, membraanhervormen en krommingsgevoeligheid kan worden geanalyseerd19. Hiervoor is een combinatie van optische en elektronenmicroscopiemethoden (fluorescentiemicroscopie, cryo-elektronenmicroscopie [cryo-EM] en scanningelektronenmicroscopie [SEM]) gebruikt. De membraanomvorming van micrometergrote gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) wordt gevisualiseerd met behulp van fluorescentie optische microscopie. De analyse van de opstelling en ultrastructuur van septinefilamenten gebonden aan lipideblaasjes wordt uitgevoerd met behulp van cryo-EM. Analyse van septinekrommingsgevoeligheid wordt uitgevoerd met behulp van SEM, door het gedrag te bestuderen van septinefilamenten gebonden aan vaste-ondersteunde lipide bilayers afgezet op golvende substraten van variabele krommingen, wat de analyse van krommingsgevoeligheid voor zowel positieve als negatieve krommingen mogelijk maakt. In vergelijking met eerdere analyse 20,24, hier, stellen we voor om een combinatie van methoden te gebruiken om grondig te analyseren hoe septines zichzelf kunnen assembleren, synergetisch het membraan kunnen vervormen en krommingsgevoelig kunnen zijn. Dit protocol wordt verondersteld nuttig te zijn en aan te passen aan elk filamenteus eiwit dat een affiniteit voor membranen vertoont.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td></td>
			<td>Elmasonic S10H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bodipy-TR-Ceramide</td>
			<td>invitrogen, Thermo Fischer scientific</td>
			<td>11504726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>nikon</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk or confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>CPD300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water generator</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td>F1CA38083B</td>
			<td>MilliQ integral 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg L-&#945;-phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field Emission Gun SEM (FESEM)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Gemini SEM500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>50-262-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum grease, Dow corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD software</td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td></td>
			<td>software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids</td>
			<td>Eloise</td>
			<td>01883-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal evaporator</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>EM ACE600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA71, NOA81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxyde 4%</td>
			<td>delta microscopies</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>L&#246;ser</td>
			<td></td>
			<td>15 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td></td>
			<td>pascal 2005 SD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma generator</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing equipment</td>
			<td>leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>EMGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td></td>
			<td>Tecnai G2 200 kV, LaB6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>22451</td>
			<td>this product is not available for purchase any longer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax plates, Vitrex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up in vitro methods to assay the ultrastructural organization, membrane reshaping, and curvature sensitivity behavior of septins

Membraanremodellering vindt constant plaats op het plasmamembraan en in cellulaire organellen. Om de rol van de omgeving (ionische condities, eiwit- en lipidensamenstellingen, membraankromming) en de verschillende partners geassocieerd met specifieke membraanhervormingsprocessen volledig te ontleden, ondernemen we in vitro bottom-up benaderingen. In de afgelopen jaren is er grote belangstelling geweest voor het onthullen van de rol van septine-eiwitten geassocieerd met belangrijke ziekten. Septines zijn essentiële en alomtegenwoordige cytoskeletale eiwitten die interageren met het plasmamembraan. Ze zijn betrokken bij celdeling, celmotiliteit, neuromorfogenese en spermiogenese, naast andere functies. Het is daarom belangrijk om te begrijpen hoe septines interageren en organiseren op membranen om vervolgens membraanvervormingen te induceren en hoe ze gevoelig kunnen zijn voor specifieke membraankrommingen. Dit artikel heeft tot doel het samenspel te ontcijferen tussen de ultrastructuur van septines op moleculair niveau en de membraanremodellering op micronschaal. Daartoe werden ontluikende gist- en zoogdierseptinecomplexen recombinant tot expressie gebracht en gezuiverd. Een combinatie van in vitro assays werd vervolgens gebruikt om de zelfassemblage van septines aan het membraan te analyseren. Ondersteunde lipide bilayers (SLBs), gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs), grote unilamellaire blaasjes (LUVs) en golvende substraten werden gebruikt om het samenspel tussen septine zelfassemblage, membraanverandering en membraankromming te bestuderen.

GUVs vervormingen Typische confocale fluorescentiebeelden van GUVs die opnieuw zijn gevormd nadat ze zijn geïncubeerd met septines, worden weergegeven in figuur 3, in omstandigheden waarin septines polymeriseren. Kale GUVs (figuur 3A) waren perfect bolvormig. Bij incubatie met meer dan 50 nM ontluikende gist septineslamenten leken de blaasjes vervormd. Tot een concentratie van 100 nM ontluikende gistseptine-octameren leken de blaasjes geface...

Watch this Scientific Journal Video about Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins at JoVE.com

Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

Septines zijn cytoskeletale eiwitten. Ze interageren met lipidembranen en kunnen membraankromming op micronschaal waarnemen maar ook genereren. We beschrijven in dit protocol bottom-up in vitro methodologieën voor het analyseren van membraanvervormingen, krommingsgevoelige septinebinding en septinefilament ultrastructuur.

Bottom-up in vitro methoden om de ultrastructurele organisatie, membraanhervorming en krommingsgevoeligheidsgedrag van septines te testen

Membrane remodeling occurs constantly at the plasma membrane and within cellular organelles. To fully dissect the role of the environment (ionic ...

Met behulp van dit protocol visualiseerden we de organisatie van cytoskeletale filamenteuze eiwitten op patroonsubstraten met verschillende krommingen. We kunnen de krommingsgevoeligheid testen. De resolutie van scanning elektronenmicroscoopbeelden is hoog genoeg zodat nanometerschaalorganisaties worden gevisualiseerd.De methoden die we gebruiken voor fixatie zijn mild genoeg om de intra-structurele organisatie van het eiwit te behouden. Dit blijft in het kader van fundamenteel onderzoek om het gedrag van cytoskeletale filamenten te begrijpen. Begin met het ontwerpen van een golvende Norland Optical Adhesive, of NOA-replica, in een cleanroom-omgeving van golvende polydimethylsiloxaan golvende patronen van 250 nanometer amplitude en twee micrometer laterale periodiciteit.Om dit te doen, deponeert u vijf microliter vloeibare NOA op een cirkelvormige glazen afdekslip met een diameter van één centimeter en plaatst u vervolgens de PDMS-sjabloon op de druppel. Behandel de assemblage met UV-licht op 320 nanometer gedurende vijf minuten om de vloeibare NOA te fotopolymeriseren tot een dunne polymeerfilm. Als u klaar bent, pelt u voorzichtig de PDMS-sjabloon van de afdekslip met de vers gepolymeriseerde NOA.Behandel de NOA-film met een luchtplasmareiniger gedurende vijf minuten om het oppervlak hydrofiel te maken. Bereid een oplossing van kleine unilamellaire blaasjes of SUV's, zoals beschreven in het manuscript, en verkrijg de SUV's door een gedroogde lipidefilm in de observatiebuffer onder de ultrasoonapparaat in een badsonicator gedurende vijf tot 10 minuten te resuspenderen totdat de oplossing transparant is. Plaats later de afdeksels die de NOA-patronen ondersteunen in de putten van celkweekdozen en incubeer de vers gloeiende NOA-patronen met 100 microliter van één milligram per milliliter SUV-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om een ondersteunde lipide bilayer te genereren.Om de ongefundeerde SUV te verwijderen, spoelt u de zijkanten zes keer grondig af met de septine lage zoutbuffer zonder het monster volledig te laten drogen tussen twee wasbeurten. Verdun de octomerische septine stockoplossing in een septine lage zoutbuffer tot eindconcentraties, variërend van 10 tot 100 nanomolaar en volumes van één milliliter. Incubeer vervolgens de eiwitoplossing op de dia's gedurende een uur bij kamertemperatuur.Was de NOA-dia's met gesmolten ondersteunde lipide bilayers en incubeer eiwit met septine lage zoutbuffer. Vervang septine lage zoutbuffer door 2% glutaaraldehyde fixatieve oplossing in 0,1 molaire natriumcacodylaatbuffer, voorgewarmd bij 37 graden Celsius, en laat de reactie gedurende 15 minuten doorgaan en was het vaste monster driemaal, elk vijf minuten met 0,1 molaire natriumcacroodylaat. Incubeer na het wassen het monster in de fixatieve oplossing van osmiumtetroxide, vervolgens het gefilterde looizuur en ten slotte het gefilterde uranylacetaat gedurende 10 minuten elk.Was het monster driemaal in gedestilleerd water na elke oplossing. Incubeer het monster serieel in ethanoloplossingen vanaf 50% tot 100% gedurende elk twee tot drie minuten. Breng de glasglaasjes over in de kritische puntdroger die is voorgevuld met ethanol en volg de instructies van de fabrikant voor het drogen.Omdat gedroogde monsters zeer hydroscopisch zijn, moet u ze onmiddellijk coaten door de afdekslip aan de stompen te bevestigen. Voeg vervolgens een strook zilververf toe aan de bovenkant van de afdekslip zonder verfdeglomeraties te creëren. Zorg ervoor dat de verbinding met de stomp bevredigend is.Wanneer het monster volledig verdampt, gebruikt u een apparaat dat is uitgerust met een plasma-magnetron sputterkop en een roterend planetaire fase en volgt u de standaardprotocollen van de fabrikant. Voer pre-sputtering uit op 120 milliamperes gedurende 60 seconden om de oxidelaag aan het oppervlak te verwijderen. Deponeer vervolgens 1,5 nanometer wolfraam met een filmdiktemonitor op 90 milliamperes en een werkafstand van 50 milliliter.Bewaar de monsters later onder een vacuüm om ze te beschermen tegen de omgevingslucht tot en met de SEM-analyses. Om hoge oplossingsbeeldvorming te bereiken door de secundaire elektronen met de binnenlandse detector te detecteren, stelt u de versnellende spanning in op drie kilovolt en de bundelstroom op een diafragma van 20 micrometer. Gebruik voor waarnemingen resoluties variërend van 21,25 nanometer per pixel tot 1,224 nanometer per pixel.Gebruik een resolutie van 5,58 nanometer per pixel voor data-analyse. Stel de werkafstand in tussen één en twee millimeter voor observatie met hoge resolutie en ongeveer drie millimeter als een grotere scherptediepte vereist is. Pas de scansnelheid en lijnintegratie continu aan om een constante signaal-ruisverhouding te garanderen met een acquisitietijd van ongeveer 30 tot 45 seconden per beeld.De representatieve analyse illustreert het effect van het materiaal dat op de septinefilamenten wordt afgezet op golvende PDMS-patronen met 1,5 nanometer platina en 1,5 nanometer wolfraam. Er werd waargenomen dat kale gigantische unilamellaire blaasjes, of GUVs, perfect bolvormig waren. Na de septine-geïnduceerde vervorming leken de blaasjes gefacetteerd en bleven de vervormingen statisch en fluctueerden dus niet.Bij hogere concentraties van de septines werden periodieke vervormingen in de blaasjes waargenomen. Zelfassemblage van de septinefilamenten gebonden aan grote unilamellaire blaasjes, of LUV's, werd onderzocht met een cryo-elektronenmicroscopiebeeld en 3D-reconstructie werd verkregen uit een gekantelde reeks. De krommingsafhankelijke rangschikking van de septinefilamenten werd gevisualiseerd door scanning elektronenmicroscopie.Bij lage vergroting was een golvend patroon met de periodiciteit van negatieve en positieve krommingen zichtbaar. De ultrastructurele organisatie van de septinefilamenten werd bekeken bij een hogere vergroting. De NOA moet voorzichtig worden afgepeld om degradatie te voorkomen.Na beeldvorming kan enige beeldanalyse worden uitgevoerd om de ultrastructuurkenmerken te kwantificeren die door SCM worden gevisualiseerd, zoals de afstand tussen filamenten en de oriëntatie van het filament. De huidige methode is toegepast op septines, maar het kan ook worden gebruikt voor andere cytoskeletale eiwitten of eiwitten die zich organiseren als lange filamenten en dus gevoelig zijn voor kromming.

Research

JoVE Journal

Biology

Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Bottom-up en Shotgun Proteomics een uitgebreide Cochlear Proteome Identificeer

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Who is Who? Non-invasive Methods to Individually Sex and Mark Altricial Chicks

Wie is wie? Niet-invasieve methoden om Individueel Sex en Mark Altricial Chicks

Many experiments require early determination of offspring's sex as well as early marking of newborns for individual recognition. According to animal ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylatietest Assay om Protein Arginine methylatie Bestudeer

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In vitro test te meten Fosfatidylethanolamine methyltransferase activiteit

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Methoden om Ontdek Alternatieve Promoter Gebruik en transcriptionele regulatie van Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Compleet Workflow voor Analyse van histon post-translationele modificaties Met behulp van Bottom-up Massaspectrometrie: Van Histon Extraction om Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay te studeren SUMO E3 Ligase activiteit

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...