Name: bottom-up in vitro methods to assay the ultrastructural organization, membrane reshaping, and curvature sensitivity behavior of septins
Uploaded: 2022-08-17T13:10:00
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Nous remercions Patricia Bassereau et Daniel Lévy pour leurs précieux conseils et discussions. Ces travaux ont bénéficié du soutien de l’ANR (Agence Nationale de la Recherche) pour le financement du projet « SEPTIME », ANR-13-JSV8-0002-01, de l’ANR septimorf ANR-17-CE13-0014, et du projet « SEPTSCORT », ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin est financé par l’Ecole Doctorale « ED564: Physique en Ile de France » et la Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa a été soutenu par Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink a été soutenu par la Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) par le biais du « BaSyC-Building a Synthetic Cell ». Subvention de gravitation (024.003.019). Nous remercions le Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) et Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Nous remercions l’Imagerie Cellulaire et Tissulaire (PICT-IBiSA), Institut Curie, membre de l’Infrastructure Nationale de Recherche Français France-BioImagerie (ANR10-INBS-04).

1. Détermination du remodelage de la membrane à l’aide de vésicules unilamellaires géantes (GUV)
REMARQUE: Dans cette section, les GUV sont générés pour imiter les déformations membranaires éventuellement induites par les septines dans un contexte cellulaire. En effet, dans les cellules, les septines se retrouvent fréquemment sur des sites à courbures micrométriques. Les GUV ont des tailles allant de quelques à quelques dizaines de micromètres et peuvent être d?...

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	<li>Finger, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reining+in+cytokinesis+with+a+septin+corral.">Reining in cytokinesis with a septin corral.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).</li><li>Barral, Y., Kinoshita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+shed+light+onto+septin+assemblies+and+function.">Structural insights shed light onto septin assemblies and function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).</li><li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+septin+diffusion+barrier+at+the+base+of+the+primary+cilium+maintains+ciliary+membrane+protein+distribution.">A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution.</a> Science. 329 (5990), 436-439 (2010).</li><li>Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+septin+family+in+spermiogenesis.">The role of the septin family in spermiogenesis.</a> Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).</li><li>Addi, C., Bai, J., Echard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+microtubule,+septin+and+ESCRT+filament+remodeling+during+late+steps+of+cytokinesis.">Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).</li><li>Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+microtubule-dependent+transport+by+septin+GTPases.">Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases.</a> Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).</li><li>Spiliotis, E. T., Nakos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+functions+of+actin-+and+microtubule-associated+septins.">Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins.</a> Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).</li><li>Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Po&#252;s, C., Baillet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+its+BORG2+and+BORG3+effectors+control+the+subcellular+localization+of+septins+between+actin+stress+fibers+and+microtubules.">Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules.</a> Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).</li><li>Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+septin-dependent+diffusion+barrier+at+dendritic+spine+necks.">A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks.</a> PloS One. 9 (12), 113916 (2014).</li><li>Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+surface+protein+of+guinea+pig+sperm+exhibits+free+diffusion+in+its+domain.">A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain.</a> The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).</li><li>Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-dependent+compartmentalization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+yeast+polarized+growth.">Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth.</a> The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).</li><li>Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+septin+cytoskeleton+facilitates+membrane+retraction+during+motility+and+blebbing.">The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing.</a> The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).</li><li>Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+functions+in+organ+system+physiology+and+pathology.">Septin functions in organ system physiology and pathology.</a> Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).</li><li>Angelis, D., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+mutations+in+human+cancers.">Septin mutations in human cancers.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).</li><li>Takehashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+3+gene+polymorphism+in+Alzheimer's+disease.">Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease.</a> Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).</li><li>Shuman, B., Momany, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+from+protists+to+people.">Septins from protists to people.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+septins:+supramolecular+organization+of+heterooligomers+and+the+mechanism+of+filament+assembly.">Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).</li><li>Iv, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+animal+septins+using+recombinant+human+septin+octamers+with+distinct+SEPT9+isoforms.">Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms.</a> Journal of cell science. 134 (15), (2021).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reshaping+by+micrometric+curvature+sensitive+septin+filaments.">Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments.</a> Nature communications. 10 (1), 420 (2019).</li><li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+plasma+membrane+curvature+is+recognized+by+the+septin+cytoskeleton.">Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton.</a> The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li><li>Patzig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin/anillin+filaments+scaffold+central+nervous+system+myelin+to+accelerate+nerve+conduction.">Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction.</a> eLife. 5, 17119 (2016).</li><li>Szuba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+binding+controls+ordered+self-assembly+of+animal+septins.">Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins.</a> eLife. 10, 63349 (2021).</li><li>Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-mediated+uniform+bracing+of+phospholipid+membranes.">Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes.</a> Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+promotes+budding+yeast+septin+filament+assembly+and+organization.">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization.</a> Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-based+readout+of+PI(4,5)P2+incorporation+into+membranes+of+giant+unilamellar+vesicles.">Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles.</a> Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD.">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-100+nm+wrinkling+of+polydimethylsiloxane+by+double+frontal+oxidation.">Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation.</a> Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).</li><li>Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontal+vitrification+of+PDMS+using+air+plasma+and+consequences+for+surface+wrinkling.">Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling.</a> Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).</li><li>Franck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+plaques+and+associated+actin+anchor+intermediate+filaments+in+skeletal+muscle.">Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).</li><li>Elkhatib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+clathrin/AP-2+lattices+pinch+collagen+fibers+to+support+3D+cell+migration.">Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration.</a> Science. 356 (6343), (2017).</li><li>Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+thin+coatings+of+Au/Pd,+Pt+and+Cr+produced+by+magnetron+sputtering+for+FE-SEM.">A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM.</a> Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).</li></ol>

Comme indiqué ci-dessus, un mélange lipidique a été utilisé qui améliore l’incorporation de PI(4,5)P2 dans la bicouche lipidique et facilite ainsi les interactions septine-membrane. En effet, nous avons montré ailleurs25 que les septines de levure bourgeonnantes interagissent avec les vésicules de manière spécifique à PI(4,5)P2. Cette composition lipidique a été ajustée empiriquement à partir du criblage de plusieurs compositions et est maintenant largement u...

Les septines sont des protéines formant des filaments cytosquelettiques qui interagissent avec les membranes lipidiques. Les septines sont omniprésentes chez les eucaryotes et essentielles à de nombreuses fonctions cellulaires. Ils ont été identifiés comme les principaux régulateurs de la division cellulaire chez les levures bourgeonnantes et les mammifères 1,2. Ils sont impliqués dans les événements de remodelage membranaire, la ciliogenèse3 et la spermiogenèse4. Dans les cellules de mammifères, les septines peuvent également interagir avec l’actine et les microtubules 5,6,7 dans un liant de Rho GTPases (BORG) de manière 8. Dans divers tissus (neurones9, cils3, spermatozoïdes10), les septines ont été identifiées comme régulateurs des barrières de diffusion pour les composants liés à la membrane11. Il a également été démontré que les septines régulent le blebbing de la membrane et la formation de saillies12. Les septines, étant des protéines multitâches, sont impliquées dans l’émergence de diverses maladies répandues13. Leur mauvaise régulation est associée à l’émergence de cancers14 et de maladies neurodégénératives15.
Selon l’organisme, plusieurs sous-unités septines (deux chez Caenorhabditis elegans à 13 chez l’homme) s’assemblent pour former des complexes dont l’organisation varie de façon tissulaire16. Le bloc de construction septine de base rassemble deux à quatre sous-unités, présentes en deux exemplaires et auto-assemblées de manière palindromique en forme de tige. Dans la levure bourgeonnante, les septines sont octamériques17,18. In situ, les septines sont souvent localisées sur des sites à courbure micrométrique; On les trouve aux sites de constriction de division, à la base des cils et des dendrites, et à l’anneau des spermatozoïdes19,20. Au niveau de la membrane, le rôle des septines semble être double : elles sont impliquées dans le remodelage de la bicouche lipidique et dans le maintien de l’intégrité de la membrane21. Par conséquent, l’étude des propriétés biophysiques des protéines formant des filaments de septine et / ou des sous-unités à la membrane est cruciale pour comprendre leur rôle. Pour disséquer les propriétés spécifiques des septines dans un environnement bien contrôlé, des approches in vitro ascendantes sont appropriées. Jusqu’à présent, seuls quelques groupes ont décrit les propriétés biophysiques des septines in vitro20,22,23. Par conséquent, par rapport à d’autres filaments cytosquelettiques, les connaissances actuelles sur le comportement des septines in vitro restent limitées.
Ce protocole décrit comment l’organisation des filaments de septine, le remodelage de la membrane et la sensibilité à la courbure peuvent être analysés19. À cette fin, une combinaison de méthodes de microscopie optique et électronique (microscopie à fluorescence, cryo-microscopie électronique [cryo-EM] et microscopie électronique à balayage [MEB]) a été utilisée. Le remodelage membranaire de vésicules unilamellaires géantes (GUV) de taille micrométrique est visualisé à l’aide de la microscopie optique à fluorescence. L’analyse de l’arrangement et de l’ultrastructure des filaments de septine liés aux vésicules lipidiques est réalisée à l’aide de cryo-EM. L’analyse de la sensibilité à la courbure de la septine est réalisée à l’aide de MEB, en étudiant le comportement des filaments de septine liés aux bicouches lipidiques soutenues par des solides déposés sur des substrats ondulés de courbures variables, ce qui permet d’analyser la sensibilité à la courbure pour les courbures positives et négatives. Par rapport à l’analyse précédente20,24, nous proposons ici d’utiliser une combinaison de méthodes pour analyser en profondeur comment les septines peuvent s’auto-assembler, déformer la membrane de manière synergique et être sensibles à la courbure. Ce protocole est considéré comme utile et adaptable à toute protéine filamenteuse qui présente une affinité pour les membranes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td></td>
			<td>Elmasonic S10H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bodipy-TR-Ceramide</td>
			<td>invitrogen, Thermo Fischer scientific</td>
			<td>11504726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>nikon</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk or confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>CPD300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water generator</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td>F1CA38083B</td>
			<td>MilliQ integral 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg L-&#945;-phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field Emission Gun SEM (FESEM)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Gemini SEM500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>50-262-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum grease, Dow corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD software</td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td></td>
			<td>software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids</td>
			<td>Eloise</td>
			<td>01883-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal evaporator</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>EM ACE600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA71, NOA81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxyde 4%</td>
			<td>delta microscopies</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>L&#246;ser</td>
			<td></td>
			<td>15 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td></td>
			<td>pascal 2005 SD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma generator</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing equipment</td>
			<td>leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>EMGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td></td>
			<td>Tecnai G2 200 kV, LaB6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>22451</td>
			<td>this product is not available for purchase any longer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax plates, Vitrex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up in vitro methods to assay the ultrastructural organization, membrane reshaping, and curvature sensitivity behavior of septins

Le remodelage membranaire se produit constamment au niveau de la membrane plasmique et dans les organites cellulaires. Pour décortiquer complètement le rôle de l’environnement (conditions ioniques, compositions protéiques et lipidiques, courbure membranaire) et des différents partenaires associés à des processus spécifiques de remodelage membranaire, nous entreprenons des approches ascendantes in vitro . Ces dernières années, on a manifesté un vif intérêt pour révéler le rôle des protéines septines associées aux principales maladies. Les septines sont des protéines cytosquelettiques essentielles et omniprésentes qui interagissent avec la membrane plasmique. Ils sont impliqués dans la division cellulaire, la motilité cellulaire, la neuro-morphogenèse et la spermiogenèse, entre autres fonctions. Il est donc important de comprendre comment les septines interagissent et s’organisent au niveau des membranes pour induire ensuite des déformations membranaires et comment elles peuvent être sensibles à des courbures membranaires spécifiques. Cet article vise à déchiffrer l’interaction entre l’ultra-structure des septines au niveau moléculaire et le remodelage membranaire se produisant à l’échelle du micron. À cette fin, des complexes de levure bourgeonnante et de septine de mammifères ont été exprimés et purifiés de manière recombinante. Une combinaison de tests in vitro a ensuite été utilisée pour analyser l’auto-assemblage des septines au niveau de la membrane. Des bicouches lipidiques soutenues (SLB), des vésicules unilamellaires géantes (GUV), de grandes vésicules unilamellaires (LUV) et des substrats ondulés ont été utilisés pour étudier l’interaction entre l’auto-assemblage de la septine, le remodelage de la membrane et la courbure de la membrane.

Déformations des GUV Des images confocales typiques de fluorescence de GUV remodelés après avoir été incubés avec des septines sont présentées à la figure 3, dans des conditions où les septines polymérisent. Les GUV nus (Figure 3A) étaient parfaitement sphériques. Lors de l’incubation avec plus de 50 nM de filaments de septine de levure bourgeonnante, les vésicules sont apparues déformées. Jusqu’à une concentration de 100...

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Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

Les septines sont des protéines cytosquelettiques. Ils interagissent avec les membranes lipidiques et peuvent détecter mais aussi générer une courbure de membrane à l’échelle du micron. Nous décrivons dans ce protocole des méthodologies in vitro ascendantes pour l’analyse des déformations membranaires, la liaison de la septine sensible à la courbure et l’ultrastructure du filament de septine.

Méthodes in vitro ascendantes pour tester l’organisation ultrastructurale, le remodelage de la membrane et le comportement de sensibilité à la courbure des septines

Membrane remodeling occurs constantly at the plasma membrane and within cellular organelles. To fully dissect the role of the environment (ionic ...

À l’aide de ce protocole, nous avons visualisé l’organisation des protéines filamenteuses du cytosquelette sur des substrats de motifs présentant diverses courbures. Nous pouvons tester la sensibilité à la courbure. La résolution des images au microscope électronique à balayage est suffisamment élevée pour que les organisations à l’échelle nanométrique soient visualisées.Les méthodes que nous utilisons pour la fixation sont suffisamment douces pour préserver l’organisation intra-structurelle de la protéine. Cela reste dans le cadre de la recherche fondamentale pour comprendre le comportement des filaments cytosquelettiques. Commencez par concevoir un adhésif optique Norland ondulé, ou réplique NOA, dans un environnement de salle blanche à partir de motifs ondulés en polydiméthylsiloxane ondulé ondulés de 250 nanomètres d’amplitude et de deux micromètres de périodicité latérale.Pour ce faire, déposez cinq microlitres de NOA liquide sur un couvercle circulaire en verre d’un centimètre de diamètre, puis placez le gabarit PDMS sur la goutte. Traiter l’ensemble avec une lumière UV à 320 nanomètres pendant cinq minutes pour photopolymériser le NOA liquide en un film polymère mince. Une fois cela fait, retirez délicatement le gabarit PDMS du couvercle avec le NOA fraîchement polymérisé.Traiter le film NOA à l’aide d’un purificateur plasma d’air pendant cinq minutes pour rendre la surface hydrophile. Préparer une solution de petites vésicules unilamellaires, ou VUS, comme décrit dans le manuscrit, et obtenir les VUS en remettant en suspension un film lipidique séché dans le tampon d’observation sous la sonication dans un sonicateur de bain pendant cinq à 10 minutes jusqu’à ce que la solution soit transparente. Plus tard, insérez les bordereaux de couvercle soutenant les modèles de NOA dans les puits des boîtes de culture cellulaire et incuber les modèles NOA fraîchement déchargés avec 100 microlitres d’une solution SUV d’un milligramme par millilitre pendant 30 minutes à température ambiante pour générer une bicouche lipidique soutenue.Pour retirer le VUS non fusionné, rincez soigneusement les côtés six fois avec le tampon septine à faible teneur en sel sans laisser l’échantillon sécher complètement entre deux lavages. Diluer la solution mère de septine octocuma dans un tampon de septine à faible teneur en sel jusqu’à des concentrations finales, allant de 10 à 100 nanomolaires et des volumes d’un millilitre. Ensuite, incuber la solution protéique sur les lames pendant une heure à température ambiante.Lavez les lames d’ANO contenant des bicouches lipidiques supportées fusionnées et incuber les protéines avec un tampon de septine à faible teneur en sel. Remplacer le tampon septine à faible teneur en sel par une solution fixatrice de glutaraldéhyde à 2% dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 molaire, préchauffé à 37 degrés Celsius, et laisser la réaction se dérouler pendant 15 minutes, et laver l’échantillon fixe trois fois, cinq minutes chacun avec 0,1 molaire de cacodylate de sodium. Après lavage, incuber l’échantillon dans la solution fixatrice de tétroxyde d’osmium, puis l’acide tannique filtré, et enfin l’acétate d’uranyle filtré pendant 10 minutes chacun.Lavez l’échantillon trois fois dans de l’eau distillée après chaque solution. Incuber l’échantillon en série dans des solutions d’éthanol à partir de 50% à 100% pendant deux à trois minutes chacune. Transférez les lames de verre à l’intérieur du sécheur à point critique prérempli d’éthanol et suivez les instructions du fabricant pour le séchage.Comme les échantillons séchés sont très hydroscopiques, enduisez-les immédiatement en attachant le couvercle aux talons. Ajoutez ensuite une bande de peinture argentée sur la face supérieure du couvercle sans créer de déglomérats de peinture. Assurez-vous que la connexion avec le talon est satisfaisante.Lorsque l’échantillon s’évapore complètement, utiliser un appareil équipé d’une tête de pulvérisation cathodique à plasma magnétron et d’un étage planétaire rotatif, et suivre les protocoles standard fournis par le fabricant. Effectuer une pré-pulvérisation cathodique à 120 milliampères pendant 60 secondes pour enlever la couche d’oxyde à la surface. Déposez ensuite 1,5 nanomètre de tungstène avec un moniteur d’épaisseur de film à 90 milliampères et une distance de travail de 50 millilitres.Plus tard, stockez les échantillons sous vide pour les protéger de l’air ambiant jusqu’à et tout au long des analyses SEM. Pour obtenir une imagerie de solution élevée en détectant les électrons secondaires avec le détecteur intérieur, réglez la tension d’accélération à trois kilovolts et le courant du faisceau à une ouverture de 20 micromètres. Pour les observations, utilisez des résolutions allant de 21,25 nanomètres par pixel à 1,224 nanomètres par pixel.Utilisez une résolution de 5,58 nanomètres par pixel pour l’analyse des données. Réglez la distance de travail entre un et deux millimètres pour une observation à haute résolution et environ trois millimètres si une profondeur de champ accrue est nécessaire. Ajustez la vitesse de numérisation et l’intégration de la ligne en continu pour garantir un rapport signal sur bruit constant avec un temps d’acquisition d’environ 30 à 45 secondes par image.L’analyse représentative illustre l’effet du matériau déposé sur les filaments de septine sur des motifs PDMS ondulés avec 1,5 nanomètre de platine et 1,5 nanomètre de tungstène. Il a été observé que les vésicules unilamellaires géantes nues, ou GUV, étaient parfaitement sphériques. Après la déformation induite par la septine, les vésicules sont apparues facettées et les déformations sont restées statiques, et n’ont donc pas fluctué.À des concentrations plus élevées de septines, des déformations périodiques des vésicules ont été observées. L’auto-assemblage des filaments de septine liés à de grandes vésicules unilamellaires, ou LUV, a été examiné avec une image de cryomicroscopie électronique et la reconstruction 3D a été obtenue à partir d’une série inclinée. L’arrangement dépendant de la courbure des filaments de septine a été visualisé par microscopie électronique à balayage.À faible grossissement, un motif ondulé avec la périodicité des courbures négatives et positives était visible. L’organisation ultra-structurale des filaments de septine a été vue à un grossissement plus élevé. Le NOA doit être délicatement décollé pour éviter la dégradation.Après l’imagerie, une analyse d’image peut être effectuée pour quantifier les caractéristiques d’ultrastructure visualisées par SCM, telles que l’espacement du filament et l’orientation du filament. La méthode actuelle a été appliquée aux septines, mais elle pourrait également être utilisée pour d’autres protéines du cytosquelette ou des protéines qui s’organisent en longs filaments et sont donc sensibles à la courbure.

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