Name: bottom-up in vitro methods to assay the ultrastructural organization, membrane reshaping, and curvature sensitivity behavior of septins
Uploaded: 2022-08-17T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins at JoVE.com

אנו מודים לפטרישיה בסראו ודניאל לוי על העצות והדיונים המועילים שלהם. עבודה זו נהנתה מתמיכת ANR (הסוכנות הלאומית דה לה רשרש) למימון הפרויקט "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, והפרויקט "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin ממומן על ידי אקול דוקטורלה "ED564: Physique en Ile de France" ו- Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa נתמך על ידי אוניברסיטת סורבון (AAP Emergence). G.H. Koenderink נתמך על ידי ארגון Nederlandse voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) באמצעות 'BaSyC-בניית תא סינתטי'. מענק כבידה (024.003.019). אנו מודים לסולם התאים של Labex (n) (ANR-11-LABX0038) ולפריז Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). אנו מודים להדמיית תאים ורקמות (PICT-IBiSA), מכון קירי, חבר בתשתית המחקר הלאומית הצרפתית צרפת-ביו-דימות (ANR10-INBS-04).

1. קביעת עיצוב מחדש של הממברנה באמצעות שלפוחיות חד-עיניות ענקיות (GUVs)
הערה: בחלק זה, GUVs נוצרים כדי לחקות את עיוותי הממברנה שעשויים להיות מושרים על ידי ספטינים בהקשר תאי. ואכן, בתאים, ספטינים נמצאים לעתים קרובות באתרים עם עקמומיות מיקרומטר. לרכבי GUV יש גדלים הנעים בין כמ...

<ol>
	<li>Finger, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reining+in+cytokinesis+with+a+septin+corral.">Reining in cytokinesis with a septin corral.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).</li><li>Barral, Y., Kinoshita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+shed+light+onto+septin+assemblies+and+function.">Structural insights shed light onto septin assemblies and function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).</li><li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+septin+diffusion+barrier+at+the+base+of+the+primary+cilium+maintains+ciliary+membrane+protein+distribution.">A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution.</a> Science. 329 (5990), 436-439 (2010).</li><li>Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+septin+family+in+spermiogenesis.">The role of the septin family in spermiogenesis.</a> Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).</li><li>Addi, C., Bai, J., Echard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+microtubule,+septin+and+ESCRT+filament+remodeling+during+late+steps+of+cytokinesis.">Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).</li><li>Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+microtubule-dependent+transport+by+septin+GTPases.">Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases.</a> Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).</li><li>Spiliotis, E. T., Nakos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+functions+of+actin-+and+microtubule-associated+septins.">Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins.</a> Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).</li><li>Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Po&#252;s, C., Baillet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+its+BORG2+and+BORG3+effectors+control+the+subcellular+localization+of+septins+between+actin+stress+fibers+and+microtubules.">Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules.</a> Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).</li><li>Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+septin-dependent+diffusion+barrier+at+dendritic+spine+necks.">A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks.</a> PloS One. 9 (12), 113916 (2014).</li><li>Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+surface+protein+of+guinea+pig+sperm+exhibits+free+diffusion+in+its+domain.">A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain.</a> The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).</li><li>Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-dependent+compartmentalization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+yeast+polarized+growth.">Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth.</a> The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).</li><li>Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+septin+cytoskeleton+facilitates+membrane+retraction+during+motility+and+blebbing.">The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing.</a> The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).</li><li>Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+functions+in+organ+system+physiology+and+pathology.">Septin functions in organ system physiology and pathology.</a> Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).</li><li>Angelis, D., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+mutations+in+human+cancers.">Septin mutations in human cancers.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).</li><li>Takehashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+3+gene+polymorphism+in+Alzheimer's+disease.">Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease.</a> Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).</li><li>Shuman, B., Momany, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+from+protists+to+people.">Septins from protists to people.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+septins:+supramolecular+organization+of+heterooligomers+and+the+mechanism+of+filament+assembly.">Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).</li><li>Iv, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+animal+septins+using+recombinant+human+septin+octamers+with+distinct+SEPT9+isoforms.">Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms.</a> Journal of cell science. 134 (15), (2021).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reshaping+by+micrometric+curvature+sensitive+septin+filaments.">Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments.</a> Nature communications. 10 (1), 420 (2019).</li><li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+plasma+membrane+curvature+is+recognized+by+the+septin+cytoskeleton.">Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton.</a> The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li><li>Patzig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin/anillin+filaments+scaffold+central+nervous+system+myelin+to+accelerate+nerve+conduction.">Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction.</a> eLife. 5, 17119 (2016).</li><li>Szuba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+binding+controls+ordered+self-assembly+of+animal+septins.">Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins.</a> eLife. 10, 63349 (2021).</li><li>Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-mediated+uniform+bracing+of+phospholipid+membranes.">Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes.</a> Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+promotes+budding+yeast+septin+filament+assembly+and+organization.">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization.</a> Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-based+readout+of+PI(4,5)P2+incorporation+into+membranes+of+giant+unilamellar+vesicles.">Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles.</a> Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD.">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-100+nm+wrinkling+of+polydimethylsiloxane+by+double+frontal+oxidation.">Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation.</a> Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).</li><li>Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontal+vitrification+of+PDMS+using+air+plasma+and+consequences+for+surface+wrinkling.">Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling.</a> Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).</li><li>Franck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+plaques+and+associated+actin+anchor+intermediate+filaments+in+skeletal+muscle.">Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).</li><li>Elkhatib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+clathrin/AP-2+lattices+pinch+collagen+fibers+to+support+3D+cell+migration.">Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration.</a> Science. 356 (6343), (2017).</li><li>Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+thin+coatings+of+Au/Pd,+Pt+and+Cr+produced+by+magnetron+sputtering+for+FE-SEM.">A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM.</a> Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).</li></ol>

כאמור, נעשה שימוש בתערובת שומנים המשפרת את שילוב PI(4,5)P2 בתוך דו-שכבת השומנים ובכך מקלה על אינטראקציות בין ממברנת ספטין. ואכן, הראינו במקומות אחרים25 כי מחיצות שמרים ניצנים אינטראקציה עם שלפוחית באופן ספציפי PI(4,5)P2. הרכב שומנים זה הותאם אמפירית מסינון יצירות מרובות וכ...

ספטינים הם חלבונים יוצרי חוטים ציטוסקטליים המקיימים אינטראקציה עם ממברנות שומנים. ספטינים נמצאים בכל מקום באאוקריוטים וחיוניים לתפקודים תאיים רבים. הם זוהו כמווסתים העיקריים של חלוקת תאים בשמרים ניצנים ויונקים 1,2. הם מעורבים באירועי עיצוב מחדש של הממברנות, ciliogenesis3, ו spermiogenesis4. בתוך תאי יונקים, ספטינים יכולים גם לקיים אינטראקציה עם אקטין ומיקרוטובולים 5,6,7 בקלסר של Rho GTPases (BORG) תלוי-אופן8. ברקמות שונות (נוירונים9, ריסונים3, זרעונים10), ספטינים זוהו כמווסתים של מחסומי דיפוזיה עבור רכיבים הקשורים לממברנה11. כמו כן, הודגם כי ספטינים מווסתים את התפוררות הממברנה ואת היווצרות הבליטה12. ספטינים, בהיותם חלבונים רב-משימתיים, מעורבים בהופעתן של מחלות שכיחות שונות13. הטעות שלהם קשורה להופעת סרטן14 ומחלות נוירודגנרטיביות15.
בהתאם לאורגניזם, כמה תת-יחידות ספטין (שתיים ב- Caenorhabditis elegans עד 13 בבני אדם) מתכנסות ליצירת קומפלקסים שארגונם משתנה באופן תלוי רקמות16. אבן הבניין הבסיסית של ספטין אוספת שתיים עד ארבע יחידות משנה, הקיימות בשני עותקים ומורכבות באופן פלינדרומי דמוי מוט. בשמרים ניצנים, ספטינים הם אוקטאמריים17,18. באתרו, מחיצות ממוקמות לעתים קרובות באתרים עם עקמומיות מיקרומטר; הם נמצאים באתרי התכווצות החטיבה, בבסיס הריסונים והדנדריטים, ובטבעות של זרעונים19,20. בממברנה, תפקידם של המחיצות נראה כפול: הם מעורבים בעיצוב מחדש של דו-שכבת השומנים ובשמירה על שלמות הממברנה21. לפיכך, חקירת התכונות הביופיזיות של חלבונים יוצרי נימה ספטין ו/או תת-יחידות בממברנה היא חיונית להבנת תפקידם. כדי לנתח תכונות ספציפיות של ספטינים בסביבה מבוקרת היטב, גישות מלמטה למעלה במבחנה מתאימות. עד כה, רק קבוצות מעטות תיארו את התכונות הביופיזיות של ספטינים במבחנה20,22,23. לפיכך, בהשוואה לחוטים ציטוסקטליים אחרים, הידע הנוכחי על התנהגות ספטינים במבחנה נותר מוגבל.
פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן לנתח את הארגון של חוטי ספטין, עיצוב מחדש של הממברנה ורגישות לעקמומיות19. לשם כך נעשה שימוש בשילוב של שיטות מיקרוסקופיה אופטית ומיקרוסקופיית אלקטרונים (מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים [cryo-EM], ומיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת [SEM]). עיצוב מחדש של הממברנה של שלפוחיות חד-מיות ענקיות בגודל מיקרומטר (GUVs) ממחיש באמצעות מיקרוסקופיה אופטית פלואורסצנטית. ניתוח הסידור והאולטרה-מבנה של חוטי ספטין הקשורים לשלפוחיות שומנים מבוצע באמצעות cryo-EM. ניתוח רגישות עקמומיות ספטין מתבצע באמצעות SEM, על ידי לימוד ההתנהגות של חוטי ספטין הקשורים לדו-שכבתיות שומנים נתמכות מוצקות המופקדות על מצעים גליים של עקמומיות משתנה, המאפשרת ניתוח רגישות לעקמומיות עבור עקמומיות חיובית ושלילית כאחד. בהשוואה לניתוח הקודם20,24, כאן, אנו מציעים להשתמש בשילוב של שיטות כדי לנתח ביסודיות כיצד ספטינים יכולים להרכיב את עצמם, לעוות באופן סינרגטי את הממברנה ולהיות רגישים לעקמומיות. פרוטוקול זה הוא האמין להיות שימושי וניתן להתאמה לכל חלבון נימה המציג זיקה לממברנות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td></td>
			<td>Elmasonic S10H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bodipy-TR-Ceramide</td>
			<td>invitrogen, Thermo Fischer scientific</td>
			<td>11504726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>nikon</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk or confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>CPD300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water generator</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td>F1CA38083B</td>
			<td>MilliQ integral 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg L-&#945;-phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field Emission Gun SEM (FESEM)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Gemini SEM500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>50-262-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum grease, Dow corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD software</td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td></td>
			<td>software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids</td>
			<td>Eloise</td>
			<td>01883-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal evaporator</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>EM ACE600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA71, NOA81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxyde 4%</td>
			<td>delta microscopies</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>L&#246;ser</td>
			<td></td>
			<td>15 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td></td>
			<td>pascal 2005 SD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma generator</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing equipment</td>
			<td>leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>EMGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td></td>
			<td>Tecnai G2 200 kV, LaB6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>22451</td>
			<td>this product is not available for purchase any longer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax plates, Vitrex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up in vitro methods to assay the ultrastructural organization, membrane reshaping, and curvature sensitivity behavior of septins

שיפוץ ממברנה מתרחש כל הזמן בקרום הפלזמה ובתוך אברוני התאים. כדי לנתח באופן מלא את תפקיד הסביבה (תנאים יוניים, הרכבי חלבונים ושומנים, עקמומיות הממברנה) ואת השותפים השונים הקשורים לתהליכי עיצוב מחדש של ממברנה ספציפיים, אנו נוקטים בגישות מלמטה למעלה במבחנה . בשנים האחרונות יש עניין רב בחשיפת תפקידם של חלבוני ספטין הקשורים למחלות גדולות. ספטינים הם חלבונים ציטוסקטליים חיוניים הנמצאים בכל מקום ומקיימים אינטראקציה עם קרום הפלזמה. הם מעורבים בחלוקת תאים, תנועתיות תאים, נוירו-מורפוגנזה, וזרעונים, בין תפקידים אחרים. לכן, חשוב להבין כיצד ספטינים מתקשרים ומתארגנים בממברנות כדי לגרום לאחר מכן לעיוותים של הממברנות וכיצד הם יכולים להיות רגישים לעקמומיות ממברנה ספציפית. מאמר זה נועד לפענח את יחסי הגומלין בין המבנה האולטרה-מבנה של ספטינים ברמה המולקולרית לבין שיפוץ הממברנה המתרחש בקנה מידה מיקרוני. לשם כך, שמרים ניצנים, ומתחמי ספטין של יונקים באו לידי ביטוי וטוהרו באופן רקומביננטי. לאחר מכן נעשה שימוש בשילוב של בדיקות חוץ גופיות כדי לנתח את ההרכבה העצמית של מחיצות בממברנה. דו-שכבתי שומנים נתמכים (SLBs), שלפוחיות חד-לשוניות ענקיות (GUVs), שלפוחיות חד-לשוניות גדולות (LUVs) ומצעים גליים שימשו כדי לחקור את יחסי הגומלין בין הרכבה עצמית של ספטין, עיצוב מחדש של הממברנה ועקמומיות הממברנה.

עיוותים של רכבי שטח תמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות טיפוסיות של רכבי שטח שעוצבו מחדש לאחר דגירה באמצעות ספטינים מוצגות באיור 3, בתנאים שבהם ספטינים מתפלמרים. רכבי שטח חשופים (איור 3A) היו כדוריים לחלוטין. עם הדגירה עם יותר מ 50 nM ניצני שמרים חוטים se...

Watch this Scientific Journal Video about Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins at JoVE.com

Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

ספטינים הם חלבונים ציטוסקטליים. הם מתקשרים עם ממברנות שומנים ויכולים לחוש אך גם ליצור עקמומיות ממברנה בקנה מידה של מיקרון. אנו מתארים בפרוטוקול זה מתודולוגיות in vitro מלמטה למעלה לניתוח עיוותים של ממברנות, קשירת ספטין רגישה לעקמומיות ואולטרה-מבנה של נימה ספטין.

מלמטה למעלה בשיטות במבחנה כדי לבחון את הארגון האולטרה-סטרוקטורלי, עיצוב מחדש של הממברנה והתנהגות הרגישות לעקמומיות של מחיצות

Membrane remodeling occurs constantly at the plasma membrane and within cellular organelles. To fully dissect the role of the environment (ionic ...

באמצעות פרוטוקול זה, דמיינו את הארגון של חלבונים נימה ציטוסקטליים על מצעי תבנית המציגים עקמומיות שונות. אנו יכולים לבדוק את רגישות העקמומיות. הרזולוציה של תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורקות גבוהה מספיק כך שארגונים בקנה מידה ננומטרי מוצגים באופן חזותי.השיטות בהן אנו משתמשים לקיבוע הן מתונות מספיק כדי לשמר את הארגון התוך-מבני של החלבון. זה נשאר במסגרת מחקר בסיסי כדי להבין את ההתנהגות של חוטים cytoskeletal. התחילו בתכנון דבק אופטי גלי של נורלנד, או העתק NOA, בסביבת חדר נקי מדפוסים גליים של פולידימתילסילוקסן גלי של משרעת 250 ננומטר ומחזוריות רוחבית של שני מיקרומטרים.כדי לעשות זאת, הפקיד חמישה מיקרוליטרים של NOA נוזלי על כיסוי זכוכית עגול בקוטר של סנטימטר אחד ולאחר מכן הנח את תבנית PDMS על הטיפה. טפלו במכלול עם אור UV בגודל 320 ננומטר למשך חמש דקות כדי לבצע פוטופולימריזציה של ה-NOA הנוזלי לסרט פולימרי דק. לאחר שתסיימו, קלפו בעדינות את תבנית ה-PDMS ממחליק הכיסוי עם NOA הפולימרי הטרי.טפלו בסרט NOA באמצעות מנקה אוויר במשך חמש דקות כדי להפוך את פני השטח להידרופיליים. הכינו תמיסה של שלפוחיות חד-שנתיות קטנות, או רכבי שטח, כפי שמתואר בכתב היד, והשיגו את רכבי השטח על ידי החייאת סרט שומנים מיובש במאגר התצפית מתחת לסוניקציה בסוניק אמבטיה למשך חמש עד 10 דקות עד שהתמיסה תהיה שקופה. מאוחר יותר, הכנס את תלושי הכיסוי התומכים בתבניות NOA בתוך הבארות של תיבות תרביות תאים ודגר את תבניות ה- NOA הזוהרות שזה עתה השתחררו עם 100 מיקרוליטרים של מיליגרם אחד לתמיסת SUV של מיליליטר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור דו-שכבת שומנים נתמכת.כדי להסיר את רכב השטח הלא מזוהם, שטפו את הצדדים ביסודיות שש פעמים עם חיץ מלח נמוך ספטין מבלי לתת לדגימה להתייבש לחלוטין בין שתי שטיפות. יש לדלל את תמיסת מלאי המחיצות האוקטומריות במאגר מלח נמוך ספטין לריכוזים סופיים, הנעים בין 10 ל-100 ננומולר ונפחים של מיליליטר אחד. לאחר מכן, דגרו את תמיסת החלבון על השקופיות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.שטפו את שקופיות NOA המכילות דו-שכבתיות שומנים נתמכות שהתמזגו ודגרו חלבון עם חיץ מלח נמוך ספטין. החלף את חיץ המלח הנמוך של ספטין בתמיסה מתקבעת של 2% גלוטראלדהיד בחיץ נתרן קקודילאט טוחן 0.1, שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס, ותן לתגובה להמשיך במשך 15 דקות, ושטוף את הדגימה הקבועה שלוש פעמים, חמש דקות כל אחת עם 0.1 נתרן קקודילאט טוחן. לאחר הכביסה, לדגוגר את הדגימה בתמיסה המקובעת של אוסמיום טטרוקסיד, לאחר מכן את חומצה tannic מסונן, ולבסוף אורניל אצטט מסונן במשך 10 דקות כל אחד.שטפו את הדגימה שלוש פעמים במים מזוקקים לאחר כל תמיסה. דגירה של הדגימה באופן סדרתי בתמיסות אתנול החל מ-50% עד 100% למשך שתיים עד שלוש דקות כל אחת. העבירו את מגלשות הזכוכית בתוך מייבש הנקודות הקריטיות הממולא מראש באתנול ופעלו לפי הוראות היצרן לייבוש.מכיוון שדגימות יבשות הן הידרוסקופיות מאוד, מצפים אותן מיד על ידי הצמדת הכיסוי לשקעים. לאחר מכן הוסיפו רצועה של צבע כסוף לפנים העליונות של תלוש הכיסוי מבלי ליצור deglomerates צבע. ודא כי החיבור עם stub הוא משביע רצון.כאשר הדגימה מתאדה לחלוטין, השתמש במנגנון המצויד בראש מפיץ מגנטרון פלזמה ובשלב פלנטרי סיבובי, ופעל לפי פרוטוקולים סטנדרטיים המסופקים על ידי היצרן. בצע התזת מקדים במהירות של 120 מיליאמפר למשך 60 שניות כדי להסיר את שכבת התחמוצת מפני השטח. לאחר מכן להפקיד 1.5 ננומטר של טונגסטן עם צג עובי הסרט ב 90 מיליאמפר ומרחק עבודה של 50 מיליליטר.מאוחר יותר, אחסן את הדגימות תחת ואקום כדי להגן עליהן מפני אוויר הסביבה עד ולאורך ניתוחי SEM. כדי להשיג הדמיית תמיסה גבוהה על ידי גילוי האלקטרונים המשניים עם הגלאי היבשתי, הגדר את מתח ההאצה לשלושה קילו-וולט ואת זרם הקרן ל-20 מיקרומטר צמצם. עבור תצפיות, השתמש ברזולוציות הנעות בין 21.25 ננומטר לפיקסל ל-1.224 ננומטר לפיקסל.השתמש ברזולוציה של 5.58 ננומטר לפיקסל לניתוח נתונים. הגדר את מרחק העבודה בין מילימטר לשני מילימטרים לתצפית ברזולוציה גבוהה וכשלושה מילימטרים אם נדרש עומק שדה מוגבר. כוונן את מהירות הסריקה ואת שילוב הקו באופן רציף כדי להבטיח יחס אות לרעש קבוע עם זמן רכישה של כ-30 עד 45 שניות לכל תמונה.הניתוח המייצג ממחיש את השפעת החומר שהופקד על חוטי ספטין על תבניות PDMS גליות עם 1.5 ננומטר של פלטינה ו-1.5 ננומטר של טונגסטן. נצפה כי שלפוחית חד-לשונית ענקית חשופה, או GUVs, היו כדוריות לחלוטין. לאחר העיוות שנגרם על ידי ספטין, הבועיות הופיעו פנים והעיוותים נשארו סטטיים, ולכן לא השתנו.בריכוזים גבוהים יותר של המחיצות נצפו עיוותים תקופתיים בשלפוחית. הרכבה עצמית של חוטי ספטין הקשורים לשלפוחיות חד-ממדיות גדולות, או LUVs, נבדקה באמצעות תמונת מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו ושחזור תלת-ממדי התקבל מסדרה מוטה. הסידור התלוי בעקמומיות של חוטי ספטין הודגם על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.בהגדלה נמוכה נראתה תבנית גלית עם מחזוריות של עקמומיות שלילית וחיובית. הארגון האולטרה-מבני של חוטי הספטין נצפה בהגדלה גבוהה יותר. יש לקלף את ה-NOA בעדינות כדי למנוע השפלה.לאחר ההדמיה, ניתן לבצע ניתוח תמונה מסוים כדי לכמת את תכונות המבנה האולטרה המוצגות על ידי SCM, כגון ריווח נימה, וכיוון החוט. השיטה הנוכחית יושמה על ספטינים, אך היא יכולה לשמש גם עבור חלבונים ציטוסקטליים אחרים או חלבונים המארגנים חוטים ארוכים ולכן רגישים לעקמומיות.

Research

JoVE Journal

Biology

Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

מלמטה למעלה ופרוטאומיקה Shotgun לזהות מקיף שבלול Proteome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Who is Who? Non-invasive Methods to Individually Sex and Mark Altricial Chicks

מי הוא מי? שיטות לא פולשנית בנפרד כדי סקס ואפרוחים חובשי קן מארק

Many experiments require early determination of offspring's sex as well as early marking of newborns for individual recognition. According to animal ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

שיטות לגלות אלטרנטיבי שימוש יזם ותקנת תעתיק של Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

במבחנה SUMOylation Assay ללמוד סומו E3 ליגאז פעילות

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...