Name: bottom-up in vitro methods to assay the ultrastructural organization, membrane reshaping, and curvature sensitivity behavior of septins
Uploaded: 2022-08-17T13:10:00
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Ringraziamo Patricia Bassereau e Daniel Lévy per i loro utili consigli e discussioni. Questo lavoro ha beneficiato del sostegno dell'ANR (Agence Nationale de la Recherche) per il finanziamento del progetto "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, e del progetto "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin è finanziato dall'Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" e dalla Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa è stato sostenuto dalla Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink è stato sostenuto dalla Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) attraverso il "BaSyC-Building a Synthetic Cell". Sovvenzione per gravitazione (024.003.019). Si ringraziano Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) e Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Ringraziamo il Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, membro dell'Infrastruttura Nazionale di Ricerca France-BioImaging (ANR10-INBS-04).

1. Determinazione del rimodellamento della membrana mediante vescicole unilamellari giganti (GUV)
NOTA: In questa sezione, i GUV sono generati per imitare le deformazioni della membrana eventualmente indotte dalle settine in un contesto cellulare. Infatti, nelle cellule, le settine si trovano frequentemente in siti con curvature micrometriche. I GUV hanno dimensioni che vanno da pochi a decine di micrometri e possono essere deformati. Sono quindi appropriati per dosare qualsiasi...

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	<li>Finger, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reining+in+cytokinesis+with+a+septin+corral.">Reining in cytokinesis with a septin corral.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).</li><li>Barral, Y., Kinoshita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+shed+light+onto+septin+assemblies+and+function.">Structural insights shed light onto septin assemblies and function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).</li><li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+septin+diffusion+barrier+at+the+base+of+the+primary+cilium+maintains+ciliary+membrane+protein+distribution.">A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution.</a> Science. 329 (5990), 436-439 (2010).</li><li>Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+septin+family+in+spermiogenesis.">The role of the septin family in spermiogenesis.</a> Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).</li><li>Addi, C., Bai, J., Echard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+microtubule,+septin+and+ESCRT+filament+remodeling+during+late+steps+of+cytokinesis.">Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).</li><li>Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+microtubule-dependent+transport+by+septin+GTPases.">Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases.</a> Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).</li><li>Spiliotis, E. T., Nakos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+functions+of+actin-+and+microtubule-associated+septins.">Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins.</a> Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).</li><li>Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Po&#252;s, C., Baillet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+its+BORG2+and+BORG3+effectors+control+the+subcellular+localization+of+septins+between+actin+stress+fibers+and+microtubules.">Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules.</a> Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).</li><li>Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+septin-dependent+diffusion+barrier+at+dendritic+spine+necks.">A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks.</a> PloS One. 9 (12), 113916 (2014).</li><li>Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+surface+protein+of+guinea+pig+sperm+exhibits+free+diffusion+in+its+domain.">A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain.</a> The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).</li><li>Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-dependent+compartmentalization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+yeast+polarized+growth.">Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth.</a> The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).</li><li>Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+septin+cytoskeleton+facilitates+membrane+retraction+during+motility+and+blebbing.">The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing.</a> The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).</li><li>Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+functions+in+organ+system+physiology+and+pathology.">Septin functions in organ system physiology and pathology.</a> Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).</li><li>Angelis, D., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+mutations+in+human+cancers.">Septin mutations in human cancers.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).</li><li>Takehashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+3+gene+polymorphism+in+Alzheimer's+disease.">Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease.</a> Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).</li><li>Shuman, B., Momany, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+from+protists+to+people.">Septins from protists to people.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+septins:+supramolecular+organization+of+heterooligomers+and+the+mechanism+of+filament+assembly.">Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).</li><li>Iv, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+animal+septins+using+recombinant+human+septin+octamers+with+distinct+SEPT9+isoforms.">Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms.</a> Journal of cell science. 134 (15), (2021).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reshaping+by+micrometric+curvature+sensitive+septin+filaments.">Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments.</a> Nature communications. 10 (1), 420 (2019).</li><li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+plasma+membrane+curvature+is+recognized+by+the+septin+cytoskeleton.">Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton.</a> The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li><li>Patzig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin/anillin+filaments+scaffold+central+nervous+system+myelin+to+accelerate+nerve+conduction.">Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction.</a> eLife. 5, 17119 (2016).</li><li>Szuba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+binding+controls+ordered+self-assembly+of+animal+septins.">Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins.</a> eLife. 10, 63349 (2021).</li><li>Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-mediated+uniform+bracing+of+phospholipid+membranes.">Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes.</a> Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+promotes+budding+yeast+septin+filament+assembly+and+organization.">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization.</a> Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-based+readout+of+PI(4,5)P2+incorporation+into+membranes+of+giant+unilamellar+vesicles.">Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles.</a> Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD.">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-100+nm+wrinkling+of+polydimethylsiloxane+by+double+frontal+oxidation.">Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation.</a> Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).</li><li>Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontal+vitrification+of+PDMS+using+air+plasma+and+consequences+for+surface+wrinkling.">Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling.</a> Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).</li><li>Franck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+plaques+and+associated+actin+anchor+intermediate+filaments+in+skeletal+muscle.">Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).</li><li>Elkhatib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+clathrin/AP-2+lattices+pinch+collagen+fibers+to+support+3D+cell+migration.">Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration.</a> Science. 356 (6343), (2017).</li><li>Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+thin+coatings+of+Au/Pd,+Pt+and+Cr+produced+by+magnetron+sputtering+for+FE-SEM.">A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM.</a> Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).</li></ol>

Come detto sopra, è stata utilizzata una miscela lipidica che migliora l'incorporazione di PI(4,5)P2 all'interno del doppio strato lipidico e quindi facilita le interazioni settina-membrana. In effetti, abbiamo dimostrato altrove25 che le settine di lievito in erba interagiscono con le vescicole in modo PI(4,5)P2-specifico. Questa composizione lipidica è stata regolata empiricamente dallo screening di composizioni multiple ed è ora ampiamente utilizzata dagli autori. I lip...

Le settine sono proteine che formano filamenti citoscheletrici che interagiscono con le membrane lipidiche. Le settine sono onnipresenti negli eucarioti ed essenziali per numerose funzioni cellulari. Sono stati identificati come i principali regolatori della divisione cellulare nei lieviti in erba e nei mammiferi 1,2. Sono coinvolti negli eventi di rimodellamento della membrana, nella ciliogenesi3 e nella spermiogenesi4. All'interno delle cellule di mammifero, le settine possono anche interagire con actina e microtubuli 5,6,7 in un legante di Rho GTPasi (BORG)-dipendentemodo 8. In vari tessuti (neuroni9, ciglia3, spermatozoi10), le settine sono state identificate come regolatori delle barriere di diffusione per componenti legati alla membrana11. Le settine hanno anche dimostrato di regolare il blebbing della membrana e la formazione di protrusioni12. Le septine, essendo proteine multi-tasking, sono implicate nell'emergere di varie malattie prevalenti13. La loro errata regolazione è associata all'emergere di tumori14 e malattie neurodegenerative15.
A seconda dell'organismo, diverse subunità della settina (due in Caenorhabditis elegans a 13 nell'uomo) si assemblano per formare complessi la cui organizzazione varia in modo tessuto-dipendente16. Il blocco di base della settina raccoglie da due a quattro subunità, presenti in due copie e auto-assemblati in modo palindromico simile a un'asta. Nel lievito in erba, le settine sono ottameriche17,18. In situ, le settine sono spesso localizzate in siti con curvatura micrometrica; Si trovano nei siti di costrizione della divisione, alla base delle ciglia e dei dendriti e nell'anello degli spermatozoi19,20. Alla membrana, il ruolo delle settine sembra essere duplice: sono implicate nel rimodellamento del doppio strato lipidico e nel mantenimento dell'integrità della membrana21. Quindi, studiare le proprietà biofisiche delle proteine e/o delle subunità che formano filamenti di septina sulla membrana è cruciale per comprendere il loro ruolo. Per analizzare le proprietà specifiche delle settine in un ambiente ben controllato, sono appropriati approcci in vitro bottom-up. Finora, solo pochi gruppi hanno descritto le proprietà biofisiche delle settine in vitro20,22,23. Quindi, rispetto ad altri filamenti citoscheletrici, le attuali conoscenze sul comportamento delle settine in vitro rimangono limitate.
Questo protocollo descrive come l'organizzazione dei filamenti di settina, il rimodellamento della membrana e la sensibilità alla curvatura possono essere analizzati19. A tal fine, è stata utilizzata una combinazione di metodi di microscopia ottica ed elettronica (microscopia a fluorescenza, microscopia crioelettronica [cryo-EM] e microscopia elettronica a scansione [SEM]). Il rimodellamento della membrana delle vescicole unilamellari giganti (GUV) di dimensioni micrometriche viene visualizzato utilizzando la microscopia ottica a fluorescenza. L'analisi della disposizione e dell'ultrastruttura dei filamenti di settina legati alle vescicole lipidiche viene eseguita utilizzando la crio-EM. L'analisi della sensibilità alla curvatura della settina viene effettuata utilizzando SEM, studiando il comportamento dei filamenti di settina legati a doppi strati lipidici solidi, depositati su substrati ondulati di curvature variabili, che consente l'analisi della sensibilità alla curvatura sia per curvature positive che negative. Rispetto alla precedente analisi20,24, qui proponiamo di utilizzare una combinazione di metodi per analizzare a fondo come le settine possono auto-assemblarsi, deformare sinergicamente la membrana ed essere sensibili alla curvatura. Si ritiene che questo protocollo sia utile e adattabile a qualsiasi proteina filamentosa che mostri un'affinità per le membrane.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td></td>
			<td>Elmasonic S10H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bodipy-TR-Ceramide</td>
			<td>invitrogen, Thermo Fischer scientific</td>
			<td>11504726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>nikon</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk or confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>CPD300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water generator</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td>F1CA38083B</td>
			<td>MilliQ integral 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg L-&#945;-phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field Emission Gun SEM (FESEM)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Gemini SEM500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>50-262-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum grease, Dow corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD software</td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td></td>
			<td>software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids</td>
			<td>Eloise</td>
			<td>01883-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal evaporator</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>EM ACE600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA71, NOA81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxyde 4%</td>
			<td>delta microscopies</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>L&#246;ser</td>
			<td></td>
			<td>15 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td></td>
			<td>pascal 2005 SD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma generator</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing equipment</td>
			<td>leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>EMGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td></td>
			<td>Tecnai G2 200 kV, LaB6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>22451</td>
			<td>this product is not available for purchase any longer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax plates, Vitrex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up in vitro methods to assay the ultrastructural organization, membrane reshaping, and curvature sensitivity behavior of septins

Il rimodellamento della membrana avviene costantemente a livello della membrana plasmatica e all'interno degli organelli cellulari. Per analizzare completamente il ruolo dell'ambiente (condizioni ioniche, composizioni proteiche e lipidiche, curvatura della membrana) e dei diversi partner associati a specifici processi di rimodellamento della membrana, intraprendiamo approcci bottom-up in vitro . Negli ultimi anni, c'è stato un vivo interesse nel rivelare il ruolo delle proteine della settina associate alle principali malattie. Le settine sono proteine citoscheletriche essenziali e ubiquitarie che interagiscono con la membrana plasmatica. Sono implicati nella divisione cellulare, nella motilità cellulare, nella neuro-morfogenesi e nella spermiogenesi, tra le altre funzioni. È quindi importante capire come le settine interagiscono e si organizzano a livello delle membrane per indurre successivamente deformazioni di membrana e come possono essere sensibili a specifiche curvature di membrana. Questo articolo mira a decifrare l'interazione tra l'ultra-struttura delle settine a livello molecolare e il rimodellamento della membrana che avviene su scala micron. A tal fine, il lievito in erba e i complessi di septina dei mammiferi sono stati espressi e purificati in modo ricombinante. Una combinazione di saggi in vitro è stata quindi utilizzata per analizzare l'autoassemblaggio delle settine sulla membrana. Sono stati utilizzati doppi strati lipidici supportati (SLB), vescicole unilamellari giganti (GUV), grandi vescicole unilamellari (LUV) e substrati ondulati per studiare l'interazione tra auto-assemblaggio della settina, rimodellamento della membrana e curvatura della membrana.

Deformazioni dei GUV Le tipiche immagini di fluorescenza confocale dei GUV rimodellati dopo essere stati incubati con settine sono visualizzate nella Figura 3, in condizioni in cui le settine polimerizzano. I GUV nudi (Figura 3A) erano perfettamente sferici. Dopo l'incubazione con più di 50 filamenti di settina di lievito in erba nM, le vescicole apparivano deformate. Fino a una concentrazione di ottameri settini di lievito in erba 100 nM, l...

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Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

Le settine sono proteine citoscheletriche. Interagiscono con le membrane lipidiche e possono percepire ma anche generare curvatura della membrana su scala micron. Descriviamo in questo protocollo metodologie bottom-up in vitro per l'analisi delle deformazioni della membrana, del legame della settina sensibile alla curvatura e dell'ultrastruttura del filamento di settino.

Metodi in vitro bottom-up per saggiare l'organizzazione ultrastrutturale, il rimodellamento della membrana e il comportamento di sensibilità alla curvatura delle settine

Membrane remodeling occurs constantly at the plasma membrane and within cellular organelles. To fully dissect the role of the environment (ionic ...

Utilizzando questo protocollo, abbiamo visualizzato l'organizzazione delle proteine filamentose citoscheletriche su substrati pattern che mostrano varie curvature. Possiamo testare la sensibilità della curvatura. La risoluzione delle immagini al microscopio elettronico a scansione è abbastanza alta da consentire la visualizzazione di organizzazioni su scala nanometrica.I metodi che usiamo per la fissazione sono abbastanza lievi da preservare l'organizzazione intra-strutturale della proteina. Questo rimane nell'ambito della ricerca fondamentale per comprendere il comportamento dei filamenti citoscheletrici. Inizia progettando un adesivo ottico Norland ondulato, o replica NOA, in un ambiente di camera bianca da modelli ondulati ondulati di polidimetilsilossano ondulati di 250 nanometri di ampiezza e periodicità laterale di due micrometri.Per fare ciò, depositare cinque microlitri di NOA liquido su un vetrino circolare di vetro di un centimetro di diametro e quindi posizionare il modello PDMS sulla goccia. Trattare l'assemblaggio con luce UV a 320 nanometri per cinque minuti per fotopolimerizzare il liquido NOA in un sottile film polimerico. Una volta fatto, staccare delicatamente la maschera PDMS dalla copertina con il NOA appena polimerizzato.Trattare il film NOA utilizzando un detergente al plasma ad aria per cinque minuti per rendere la superficie idrofila. Preparare una soluzione di piccole vescicole unilamellari, o SUV, come descritto nel manoscritto, e ottenere i SUV risospendendo un film lipidico essiccato nel tampone di osservazione sotto la sonicazione in un sonicatore da bagno per cinque a 10 minuti fino a quando la soluzione è trasparente. Successivamente, inserire i vetrini di copertura che supportano i modelli NOA all'interno dei pozzetti delle scatole di coltura cellulare e incubare i modelli NOA appena scaricati con 100 microlitri di una soluzione SUV da un milligrammo per millilitro per 30 minuti a temperatura ambiente per generare un doppio strato lipidico supportato.Per rimuovere il SUV non fuso, sciacquare accuratamente i lati sei volte con il tampone a basso contenuto di sale della settina senza lasciare asciugare completamente il campione tra due lavaggi. Diluire la soluzione madre di septina octomerica in un tampone di sale a basso contenuto di settino a concentrazioni finali, comprese tra 10 e 100 nanomolari e volumi di un millilitro. Quindi, incubare la soluzione proteica sui vetrini per un'ora a temperatura ambiente.Lavare i vetrini NOA contenenti doppi strati lipidici supportati fusi e incubare le proteine con tampone a basso contenuto di sale della settina. Sostituire il tampone a basso contenuto di sale della settina con una soluzione fissativa di glutaraldeide al 2% in tampone di cacodilato sodico molare 0,1, preriscaldato a 37 gradi Celsius, e lasciare che la reazione proceda per 15 minuti, e lavare il campione fissato tre volte, cinque minuti ciascuna con cacodilato di sodio 0,1 molare. Dopo il lavaggio, incubare il campione nella soluzione fissativa di tetrossido di osmio, quindi l'acido tannico filtrato e infine l'acetato di uranile filtrato per 10 minuti ciascuno.Lavare il campione tre volte in acqua distillata dopo ogni soluzione. Incubare il campione in serie in soluzioni di etanolo a partire dal 50% al 100% per due o tre minuti ciascuna. Trasferire i vetrini all'interno dell'essiccatore a punti critici preriempito con etanolo e seguire le istruzioni del produttore per l'essiccazione.Poiché i campioni essiccati sono altamente idroscopici, rivestirli immediatamente attaccando il vetrino di copertura ai mozziconi. Quindi aggiungere una striscia di vernice argentata sulla faccia superiore del vetrino senza creare deglomerati di vernice. Assicurati che il collegamento con lo stub sia soddisfacente.Quando il campione evapora completamente, utilizzare un apparecchio dotato di una testa di sputtering magnetron al plasma e di uno stadio planetario rotante e seguire i protocolli standard forniti dal produttore. Eseguire il pre-sputtering a 120 milliampere per 60 secondi per rimuovere lo strato di ossido in superficie. Quindi depositare 1,5 nanometri di tungsteno con un monitor dello spessore del film a 90 milliampere e una distanza di lavoro di 50 millilitri.Successivamente, conservare i campioni sotto vuoto per proteggerli dall'aria ambiente fino e durante le analisi SEM. Per ottenere immagini ad alta soluzione rilevando gli elettroni secondari con il rilevatore interno, impostare la tensione di accelerazione a tre kilovolt e la corrente del fascio su un'apertura di 20 micrometri. Per le osservazioni, utilizzare risoluzioni che vanno da 21,25 nanometri per pixel a 1,224 nanometri per pixel.Utilizzare una risoluzione di 5,58 nanometri per pixel per l'analisi dei dati. Impostare la distanza di lavoro tra uno e due millimetri per l'osservazione ad alta risoluzione e circa tre millimetri se è richiesta una maggiore profondità di campo. Regolare continuamente la velocità di scansione e l'integrazione della linea per garantire un rapporto segnale/rumore costante con un tempo di acquisizione di circa 30-45 secondi per immagine.L'analisi rappresentativa illustra l'effetto del materiale depositato sui filamenti di settina su modelli PDMS ondulati con 1,5 nanometri di platino e 1,5 nanometri di tungsteno. È stato osservato che le vescicole unilamellari giganti nude, o GUV, erano perfettamente sferiche. Dopo la deformazione indotta dalla settina, le vescicole apparivano sfaccettate e le deformazioni rimanevano statiche, e quindi non fluttuavano.A concentrazioni più elevate delle settine sono state osservate deformazioni periodiche nelle vescicole. L'autoassemblaggio dei filamenti di settina legati a grandi vescicole unilamellari, o LUV, è stato esaminato con un'immagine al microscopio elettronico criogenico e la ricostruzione 3D è stata ottenuta da una serie inclinata. La disposizione dipendente dalla curvatura dei filamenti di settina è stata visualizzata mediante microscopia elettronica a scansione.A basso ingrandimento, era visibile un modello ondulato con la periodicità delle curvature negative e positive. L'organizzazione ultra-strutturale dei filamenti di settina è stata osservata a un ingrandimento più elevato. Il NOA deve essere rimosso delicatamente per evitare il degrado.Dopo l'imaging, è possibile eseguire alcune analisi delle immagini per quantificare le caratteristiche dell'ultrastruttura visualizzate da SCM, come la spaziatura dei filamenti e l'orientamento del filamento. Il presente metodo è stato applicato alle septine, ma potrebbe essere utilizzato anche per altre proteine citoscheletriche o proteine che si organizzano come filamenti lunghi e quindi sono sensibili alla curvatura.

Research

JoVE Journal

Biology

Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

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Ricerca

Biologia

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