Name: bottom-up in vitro methods to assay the ultrastructural organization, membrane reshaping, and curvature sensitivity behavior of septins
Uploaded: 2022-08-17T13:10:00
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Patricia Bassereau と Daniel Lévy の有益なアドバイスと議論に感謝します。この作業は、プロジェクト「SEPTIME」、ANR-13-JSV8-0002-01、ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014、およびプロジェクト「SEPTSCORT」(ANR-20-CE11-0014-01)に資金を提供するためのANR(Agence Nationale de la Recherche)の支援の恩恵を受けました。B. ショーヴァンは、エコール・ドクターラーレ「ED564: Physique en Ile de France」とFondation pour lea Recherche Médicaleから資金提供を受けています。中澤圭吾はソルボンヌ大学(AAP Emergence)の支援を受けた。G.H. Koenderinkは、Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek(NWO/OCW)の「BaSyC-Building a Synthetic Cell」を通じて支援を受けた。重力グラント(024.003.019).Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) と Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02) に感謝します。我々は、フランス国立研究インフラフランスバイオイメージング(ANR10-INBS-04)のメンバーである細胞組織イメージング(PICT-IBiSA)、Institut Curieに感謝します。

1. 巨大単層小胞(GUV)を用いた膜リフォーミングの決定
注:このセクションでは、GUVは、細胞の文脈でセプチンによって誘発される可能性のある膜変形を模倣するために生成されます。実際、細胞では、セプチンはマイクロメートルの曲率を有する部位で頻繁に見出される。GUVのサイズは数マイクロメートルから数十マイクロメートルで、変形することができま?...

<ol>
	<li>Finger, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reining+in+cytokinesis+with+a+septin+corral.">Reining in cytokinesis with a septin corral.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).</li><li>Barral, Y., Kinoshita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+shed+light+onto+septin+assemblies+and+function.">Structural insights shed light onto septin assemblies and function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).</li><li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+septin+diffusion+barrier+at+the+base+of+the+primary+cilium+maintains+ciliary+membrane+protein+distribution.">A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution.</a> Science. 329 (5990), 436-439 (2010).</li><li>Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+septin+family+in+spermiogenesis.">The role of the septin family in spermiogenesis.</a> Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).</li><li>Addi, C., Bai, J., Echard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+microtubule,+septin+and+ESCRT+filament+remodeling+during+late+steps+of+cytokinesis.">Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).</li><li>Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+microtubule-dependent+transport+by+septin+GTPases.">Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases.</a> Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).</li><li>Spiliotis, E. T., Nakos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+functions+of+actin-+and+microtubule-associated+septins.">Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins.</a> Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).</li><li>Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Po&#252;s, C., Baillet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+its+BORG2+and+BORG3+effectors+control+the+subcellular+localization+of+septins+between+actin+stress+fibers+and+microtubules.">Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules.</a> Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).</li><li>Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+septin-dependent+diffusion+barrier+at+dendritic+spine+necks.">A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks.</a> PloS One. 9 (12), 113916 (2014).</li><li>Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+surface+protein+of+guinea+pig+sperm+exhibits+free+diffusion+in+its+domain.">A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain.</a> The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).</li><li>Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-dependent+compartmentalization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+yeast+polarized+growth.">Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth.</a> The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).</li><li>Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+septin+cytoskeleton+facilitates+membrane+retraction+during+motility+and+blebbing.">The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing.</a> The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).</li><li>Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+functions+in+organ+system+physiology+and+pathology.">Septin functions in organ system physiology and pathology.</a> Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).</li><li>Angelis, D., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+mutations+in+human+cancers.">Septin mutations in human cancers.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).</li><li>Takehashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+3+gene+polymorphism+in+Alzheimer's+disease.">Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease.</a> Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).</li><li>Shuman, B., Momany, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+from+protists+to+people.">Septins from protists to people.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+septins:+supramolecular+organization+of+heterooligomers+and+the+mechanism+of+filament+assembly.">Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).</li><li>Iv, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+animal+septins+using+recombinant+human+septin+octamers+with+distinct+SEPT9+isoforms.">Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms.</a> Journal of cell science. 134 (15), (2021).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reshaping+by+micrometric+curvature+sensitive+septin+filaments.">Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments.</a> Nature communications. 10 (1), 420 (2019).</li><li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+plasma+membrane+curvature+is+recognized+by+the+septin+cytoskeleton.">Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton.</a> The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li><li>Patzig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin/anillin+filaments+scaffold+central+nervous+system+myelin+to+accelerate+nerve+conduction.">Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction.</a> eLife. 5, 17119 (2016).</li><li>Szuba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+binding+controls+ordered+self-assembly+of+animal+septins.">Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins.</a> eLife. 10, 63349 (2021).</li><li>Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-mediated+uniform+bracing+of+phospholipid+membranes.">Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes.</a> Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+promotes+budding+yeast+septin+filament+assembly+and+organization.">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization.</a> Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-based+readout+of+PI(4,5)P2+incorporation+into+membranes+of+giant+unilamellar+vesicles.">Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles.</a> Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD.">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-100+nm+wrinkling+of+polydimethylsiloxane+by+double+frontal+oxidation.">Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation.</a> Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).</li><li>Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontal+vitrification+of+PDMS+using+air+plasma+and+consequences+for+surface+wrinkling.">Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling.</a> Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).</li><li>Franck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+plaques+and+associated+actin+anchor+intermediate+filaments+in+skeletal+muscle.">Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).</li><li>Elkhatib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+clathrin/AP-2+lattices+pinch+collagen+fibers+to+support+3D+cell+migration.">Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration.</a> Science. 356 (6343), (2017).</li><li>Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+thin+coatings+of+Au/Pd,+Pt+and+Cr+produced+by+magnetron+sputtering+for+FE-SEM.">A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM.</a> Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).</li></ol>

上記のように、脂質二重層内のPI(4,5)P2 の取り込みを増強し、したがってセプチン - 膜相互作用を促進する脂質混合物が使用されている。実際、我々は、出芽酵母セプチンがPI(4,5 )P 2特異的な様式で小胞と相互作用することを他の25で示した。この脂質組成物は、複数の組成物をスクリーニングすることから経験的に調整され、現在、著者らによって広く使用?...

セプチンは、脂質膜と相互作用する細胞骨格フィラメント形成タンパク質である。セプチンは真核生物に遍在しており、多数の細胞機能に不可欠です。それらは、出芽酵母および哺乳動物における細胞分裂の主要な調節因子として同定されている1,2。それらは、膜再形成事象、繊毛形成3、および精子形成4に関与している。哺乳動物細胞内では、セプチンはまた、Rho GTPases(BORG)依存的に結合剤であるアクチンおよび微小管5、6、7と相互作用し得る8。様々な組織(ニューロン9、繊毛3、精子10)において、セプチンは、膜結合成分11に対する拡散障壁の調節因子として同定されている。セプチンはまた、膜ブレビングおよび突出形成12を調節することが示されている。セプチンはマルチタスクタンパク質であり、様々な流行疾患の出現に関与している13。それらの誤った調節は、癌14および神経変性疾患15の出現と関連している。
生物に応じて、いくつかのセプチンサブユニット(Caenorhabditis elegansでは2つ、ヒトでは13個)が集合して複合体を形成し、その組織は組織依存的に変化する16。基本的なセプチンビルディングブロックは、2〜4つのサブユニットを収集し、2つのコピーで存在し、棒状の回文様式で自己組織化する。出芽酵母において、セプチンは八量体17,18である。その場で、セプチンはしばしばマイクロメートル曲率を有する部位に局在する。それらは分裂狭窄部位、繊毛および樹状突起の基部、および精子の環状で見出される19,20。膜では、セプチンの役割は二重であるように思われる:それらは脂質二重層を再形成し、膜の完全性を維持することに関与している21。したがって、膜におけるセプチンフィラメント形成タンパク質および/またはサブユニットの生物物理学的特性を調査することは、それらの役割を理解するために極めて重要である。十分に制御された環境におけるセプチンの特定の特性を解剖するためには、ボトムアップのインビトロアプローチが適切である。これまでのところ、インビトロでのセプチンの生物物理学的特性を記載しているのはごく少数のグループのみである20、22、23。したがって、他の細胞骨格フィラメントと比較して、インビトロでのセプチンの挙動に関する現在の知識は限られたままである。
このプロトコルは、セプチンフィラメントの組織化、膜の再形成、および曲率感度を分析する方法を説明しています19。この目的のために、光学および電子顕微鏡法(蛍光顕微鏡法、クライオ電子顕微鏡[クライオEM]、および走査型電子顕微鏡[SEM])の組み合わせが使用されてきた。マイクロメートルサイズの巨大な単層小胞(GUV)の膜再形成は、蛍光光学顕微鏡を用いて可視化される。脂質小胞に結合したセプチンフィラメントの配置および超構造の解析は、クライオEMを用いて行われる。セピン曲率感度の解析はSEMを用いて行われ、可変曲率の波状基板上に堆積した固体支持脂質二重層に結合したセプチンフィラメントの挙動を研究することにより、正と負の両方の曲率感度の解析が可能になります。以前の解析20,24と比較して、ここでは、セプチンがどのように自己集合し、相乗的に膜を変形し、曲率に敏感であるかを徹底的に分析するために、これらの方法の組み合わせを使用することを提案します。このプロトコールは、膜に対して親和性を示す任意の糸状タンパク質に有用かつ適応可能であると考えられている。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td></td>
			<td>Elmasonic S10H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bodipy-TR-Ceramide</td>
			<td>invitrogen, Thermo Fischer scientific</td>
			<td>11504726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>nikon</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk or confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>CPD300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water generator</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td>F1CA38083B</td>
			<td>MilliQ integral 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg L-&#945;-phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field Emission Gun SEM (FESEM)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Gemini SEM500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>50-262-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum grease, Dow corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD software</td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td></td>
			<td>software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids</td>
			<td>Eloise</td>
			<td>01883-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal evaporator</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>EM ACE600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA71, NOA81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxyde 4%</td>
			<td>delta microscopies</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>L&#246;ser</td>
			<td></td>
			<td>15 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td></td>
			<td>pascal 2005 SD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma generator</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing equipment</td>
			<td>leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>EMGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td></td>
			<td>Tecnai G2 200 kV, LaB6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>22451</td>
			<td>this product is not available for purchase any longer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax plates, Vitrex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up in vitro methods to assay the ultrastructural organization, membrane reshaping, and curvature sensitivity behavior of septins

膜リモデリングは、原形質膜および細胞小器官内で絶えず起こる。環境(イオン条件、タンパク質および脂質組成、膜曲率)と特定の膜再形成プロセスに関連するさまざまなパートナーの役割を完全に解剖するために、in vitro ボトムアップアプローチを実施します。近年、主要な疾患に関連するセプチンタンパク質の役割を明らかにすることに強い関心が寄せられている。セプチンは、原形質膜と相互作用する必須かつ遍在する細胞骨格タンパク質である。それらは、細胞分裂、細胞運動性、神経形態形成、および精子形成、他の機能の中でも特に関与している。したがって、セプチンが膜でどのように相互作用し、組織化してその後膜変形を誘発するか、およびセプチンが特定の膜曲率にどのように敏感であるかを理解することが重要です。本稿は、分子レベルでのセプチンの超構造とミクロンスケールで起こる膜リモデリングとの相互作用を解読することを目的としている。この目的のために、出芽酵母、および哺乳動物セプチン複合体を組換え発現および精製した。次いで、 インビトロ アッセイの組み合わせを用いて、膜におけるセプチンの自己組織化を分析した。支持脂質二重層(SLB)、巨大な単層小胞(GUV)、大きな単層小胞(LUV)、および波状基質を用いて、セプチン自己組織化、膜再形成、および膜曲率の間の相互作用を研究した。

ギューブの変形 セプチンと共にインキュベートされた後に再形成されたGUVの典型的な共焦点蛍光画像は、セプチンが重合する条件下で、 図3に示されている。裸のGUV(図3A)は完全に球形であった。50nM以上の出芽酵母セプチンフィラメントとのインキュベーションにより、小胞は変形して現れた。100nMの出芽酵母セプチン八量体の濃度?...

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Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

セプチンは細胞骨格タンパク質である。それらは脂質膜と相互作用し、ミクロンスケールで膜曲率を感知するだけでなく生成することもできる。このプロトコルでは、膜変形、曲率に敏感なセプチン結合、およびセプチンフィラメントの超構造を分析するためのボトムアップ インビトロ 方法論について説明します。

セプチンの超微細構造組織、膜再形成、および曲率感度挙動をアッセイするためのボトムアップ インビトロ 法

Membrane remodeling occurs constantly at the plasma membrane and within cellular organelles. To fully dissect the role of the environment (ionic ...

このプロトコルを使用して、さまざまな曲率を示すパターン基板上の細胞骨格糸状タンパク質の構成を視覚化しました。曲率感度をテストできます。走査型電子顕微鏡画像の解像度は、ナノメートルスケールの組織を可視化するのに十分な高さです。固定に使用する方法は、タンパク質の構造内組織を維持するのに十分穏やかです。これは、細胞骨格フィラメントの挙動を理解するための基礎研究の範囲に残っています。まず、250ナノメートルの振幅と2マイクロメートルの横方向の周期性の波状のポリジメチルシロキサンのうねりパターンから、クリーンルーム環境で波状のノーランド光学接着剤(NOAレプリカ)を設計します。これを行うには、直径1センチメートルの円形ガラスカバースリップに5マイクロリットルの液体NOAを堆積させ、PDMSテンプレートをドロップに置きます。アセンブリを320ナノメートルのUV光で5分間処理して、液体NOAを光重合して薄いポリマーフィルムにします。完了したら、重合したばかりのNOAでカバースリップからPDMSテンプレートをそっと剥がします。エアプラズマクリーナーを使用してNOAフィルムを5分間処理し、表面を親水性にします。原稿に記載されているように、小さな単層小胞、またはSUVの溶液を調製し、溶液が透明になるまで5〜10分間浴超音波処理器で超音波処理下の観察バッファーに乾燥した脂質フィルムを再懸濁することによってSUVを得る。その後、NOAパターンを支持するカバースリップを細胞培養ボックスのウェル内に挿入し、新たに発光したNOAパターンを1ミリリットルあたり1ミリグラムの100マイクロリットルのSUV溶液で室温で30分間インキュベートして、支持された脂質二重層を生成します。融合していないSUVを取り除くには、2回の洗浄の間にサンプルを完全に乾燥させることなく、セプチン減塩バッファーで側面を6回完全にすすぎます。オクトマーセプチンストック溶液をセプチン低塩緩衝液で最終濃度(10〜100ナノモル、容量1ミリリットル)に希釈します。次に、スライド上のタンパク質溶液を室温で1時間インキュベートします。融合した担持脂質二重層を含むNOAスライドを洗浄し、タンパク質をセプチン低塩緩衝液でインキュベートします。セプチン低塩緩衝液を0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液中の2%グルタルアルデヒド固定液に置き換え、摂氏37度に予熱し、反応を15分間進行させ、固定サンプルを0.1モルのカコジル酸ナトリウムでそれぞれ5分間3回洗浄します。洗浄後、四酸化オスミウムの固定液中でサンプルをインキュベートし、次に濾過したタンニン酸、そして最後に濾過した酢酸ウラニルをそれぞれ10分間インキュベートする。すべての溶液の後に蒸留水でサンプルを3回洗浄します。サンプルをエタノール溶液中で50%から100%まで2〜3分間連続してインキュベートします。エタノールをあらかじめ充填した臨界点乾燥機内にスライドガラスを移し、製造元の指示に従って乾燥させます。乾燥したサンプルは吸水性が高いため、カバースリップをスタブに取り付けてすぐにコーティングしてください。次に、ペイントデグロメットを作成せずに、カバースリップの上面に銀色のペイントのストリップを追加します。スタブとの接続が適切であることを確認してください。サンプルが完全に蒸発したら、プラズママグネトロンスパッタリングヘッドと回転遊星ステージを備えた装置を使用し、メーカーが提供する標準プロトコルに従います。120ミリアンペアで60秒間プレスパッタリングを行い、表面の酸化物層を除去します。次に、1.5ナノメートルのタングステンを90ミリアンペア、作動距離50ミリリットルの膜厚モニターで堆積させます。その後、SEM分析まで、およびSEM分析全体を通して周囲空気から保護するために、サンプルを真空下に保管します。内陸検出器で二次電子を検出して高溶液イメージングを実現するには、加速電圧を3キロボルト、ビーム電流を20マイクロメートルの開口部に設定します。観測には、ピクセルあたり21.25ナノメートルからピクセルあたり1.224ナノメートルの範囲の解像度を使用します。データ分析には、ピクセルあたり 5.58 ナノメートルの解像度を使用します。作動距離は、高解像度の観察には1〜2ミリメートル、被写界深度を増やす必要がある場合は約3ミリメートルに設定します。スキャン速度とライン積分を継続的に調整して、画像あたり約30〜45秒の取得時間で一定の信号対雑音比を確保します。代表的な分析は、1.5ナノメートルの白金と1.5ナノメートルのタングステンを含む波状のPDMSパターンに対するセプチンフィラメントに堆積した材料の影響を示しています。裸の巨大な単層小胞、またはGUV、完全に球形であることが観察されました。セプチン誘発変形後、小胞はファセット状に見え、変形は静的なままであったため、変動しませんでした。より高い濃度のセプチンでは、小胞の周期的な変形が観察された。大きな単層小胞(LUV)に結合したセプチンフィラメントの自己組織化をクライオ電子顕微鏡画像で調べ、傾斜した系列から3D再構成が得られました。セプチンフィラメントの曲率依存配置を走査型電子顕微鏡によって視覚化した。低倍率では、負および正の曲率の周期性を有する波状のパターンが見えた。セプチンフィラメントの超微細構造組織は、より高い倍率で見られた。劣化を防ぐために、NOAはそっと剥がす必要があります。イメージング後、フィラメント間隔やフィラメントの向きなど、SCMによって視覚化された超構造の特徴を定量化するために、いくつかの画像解析を実行できます。この方法はセプチンに適用されていますが、他の細胞骨格タンパク質や長いフィラメントとして組織化して曲率に敏感なタンパク質にも使用できます。

Research

JoVE Journal

Biology

Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

生物学

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

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タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

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タンパク質アルギニンメチル化を研究するためのin vitroでメチル化アッセイで

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Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

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In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

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体外相撲 E3 リガーゼ活性を研究する sumo 化アッセイ

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セプチンの超微細構造組織、膜再形成、および曲率感度挙動をアッセイするためのボトムアップ インビトロ 法

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