Name: bottom-up in vitro methods to assay the ultrastructural organization, membrane reshaping, and curvature sensitivity behavior of septins
Uploaded: 2022-08-17T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins at JoVE.com

Vi takker Patricia Bassereau og Daniel Lévy for nyttige råd og diskusjoner. Dette arbeidet dro nytte av støtte fra ANR (Agence Nationale de la Recherche) for finansiering av prosjektet "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, og prosjektet "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin er finansiert av Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" og Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa ble støttet av Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink ble støttet av Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) gjennom 'BaSyC-Building a Synthetic Cell'. Gravitasjonsstipend (024.003.019). Vi takker Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) og Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Vi takker Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, medlem av den franske nasjonale forskningsinfrastrukturen France-BioImaging (ANR10-INBS-04).

1. Bestemmelse av membranomforming ved hjelp av gigantiske unilamellære vesikler (GUV)
MERK: I denne delen genereres GUV for å etterligne membrandeformasjonene som muligens induseres av septiner i en cellulær sammenheng. Faktisk, i celler, er septiner ofte funnet på steder med mikrometer krumninger. GUV har størrelser fra noen få til titalls mikrometer og kan deformeres. De er derfor hensiktsmessige for å analysere eventuelle septininduserte deformasjoner i mikrometerskal...

<ol>
	<li>Finger, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reining+in+cytokinesis+with+a+septin+corral.">Reining in cytokinesis with a septin corral.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).</li><li>Barral, Y., Kinoshita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+shed+light+onto+septin+assemblies+and+function.">Structural insights shed light onto septin assemblies and function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).</li><li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+septin+diffusion+barrier+at+the+base+of+the+primary+cilium+maintains+ciliary+membrane+protein+distribution.">A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution.</a> Science. 329 (5990), 436-439 (2010).</li><li>Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+septin+family+in+spermiogenesis.">The role of the septin family in spermiogenesis.</a> Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).</li><li>Addi, C., Bai, J., Echard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+microtubule,+septin+and+ESCRT+filament+remodeling+during+late+steps+of+cytokinesis.">Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).</li><li>Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+microtubule-dependent+transport+by+septin+GTPases.">Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases.</a> Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).</li><li>Spiliotis, E. T., Nakos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+functions+of+actin-+and+microtubule-associated+septins.">Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins.</a> Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).</li><li>Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Po&#252;s, C., Baillet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+its+BORG2+and+BORG3+effectors+control+the+subcellular+localization+of+septins+between+actin+stress+fibers+and+microtubules.">Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules.</a> Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).</li><li>Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+septin-dependent+diffusion+barrier+at+dendritic+spine+necks.">A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks.</a> PloS One. 9 (12), 113916 (2014).</li><li>Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+surface+protein+of+guinea+pig+sperm+exhibits+free+diffusion+in+its+domain.">A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain.</a> The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).</li><li>Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-dependent+compartmentalization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+yeast+polarized+growth.">Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth.</a> The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).</li><li>Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+septin+cytoskeleton+facilitates+membrane+retraction+during+motility+and+blebbing.">The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing.</a> The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).</li><li>Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+functions+in+organ+system+physiology+and+pathology.">Septin functions in organ system physiology and pathology.</a> Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).</li><li>Angelis, D., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+mutations+in+human+cancers.">Septin mutations in human cancers.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).</li><li>Takehashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+3+gene+polymorphism+in+Alzheimer's+disease.">Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease.</a> Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).</li><li>Shuman, B., Momany, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+from+protists+to+people.">Septins from protists to people.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+septins:+supramolecular+organization+of+heterooligomers+and+the+mechanism+of+filament+assembly.">Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).</li><li>Iv, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+animal+septins+using+recombinant+human+septin+octamers+with+distinct+SEPT9+isoforms.">Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms.</a> Journal of cell science. 134 (15), (2021).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reshaping+by+micrometric+curvature+sensitive+septin+filaments.">Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments.</a> Nature communications. 10 (1), 420 (2019).</li><li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+plasma+membrane+curvature+is+recognized+by+the+septin+cytoskeleton.">Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton.</a> The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li><li>Patzig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin/anillin+filaments+scaffold+central+nervous+system+myelin+to+accelerate+nerve+conduction.">Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction.</a> eLife. 5, 17119 (2016).</li><li>Szuba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+binding+controls+ordered+self-assembly+of+animal+septins.">Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins.</a> eLife. 10, 63349 (2021).</li><li>Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-mediated+uniform+bracing+of+phospholipid+membranes.">Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes.</a> Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+promotes+budding+yeast+septin+filament+assembly+and+organization.">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization.</a> Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-based+readout+of+PI(4,5)P2+incorporation+into+membranes+of+giant+unilamellar+vesicles.">Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles.</a> Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD.">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-100+nm+wrinkling+of+polydimethylsiloxane+by+double+frontal+oxidation.">Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation.</a> Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).</li><li>Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontal+vitrification+of+PDMS+using+air+plasma+and+consequences+for+surface+wrinkling.">Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling.</a> Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).</li><li>Franck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+plaques+and+associated+actin+anchor+intermediate+filaments+in+skeletal+muscle.">Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).</li><li>Elkhatib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+clathrin/AP-2+lattices+pinch+collagen+fibers+to+support+3D+cell+migration.">Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration.</a> Science. 356 (6343), (2017).</li><li>Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+thin+coatings+of+Au/Pd,+Pt+and+Cr+produced+by+magnetron+sputtering+for+FE-SEM.">A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM.</a> Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).</li></ol>

Som nevnt ovenfor har en lipidblanding blitt brukt som forbedrer PI (4,5) P 2-inkorporering i lipid-dobbeltlaget og dermed letter septinmembraninteraksjoner. Faktisk har vi vist andre steder25 at spirende gjærseptiner samhandler med vesikler på en PI (4,5) P2-spesifikk måte. Denne lipidsammensetningen ble justert empirisk fra screening av flere komposisjoner og er nå mye brukt av forfatterne. PI (4,5) P2 lipider må håndteres nøye. Stamløsninger må aliquote...

Septiner er cytoskeletale filamentdannende proteiner som interagerer med lipidmembraner. Septiner er allestedsnærværende i eukaryoter og essensielle for mange cellulære funksjoner. De har blitt identifisert som de viktigste regulatorene for celledeling i spirende gjær og pattedyr 1,2. De er involvert i membranomformingshendelser, ciliogenese3 og spermiogenese4. I pattedyrceller kan septiner også interagere med aktin og mikrotubuli 5,6,7 i et bindemiddel av Rho GTPases (BORG)-avhengig måte 8. I forskjellige vev (nevroner9, cilia3, spermatozoa10) har septiner blitt identifisert som regulatorer av diffusjonsbarrierer for membranbundne komponenter11. Septiner har også vist seg å regulere membran blebbing og fremspring dannelse12. Septiner, som er multi-tasking proteiner, er involvert i fremveksten av ulike utbredte sykdommer13. Deres feilregulering er forbundet med fremveksten av kreft14 og neurodegenerative sykdommer15.
Avhengig av organismen samles flere septin-underenheter (to i Caenorhabditis elegans til 13 hos mennesker) for å danne komplekser hvis organisasjon varierer på en vevavhengig måte16. Den grunnleggende septinbyggeblokken samler to til fire underenheter, til stede i to eksemplarer og selvmontert på en stanglignende palindromisk måte. I spirende gjær er septiner oktamere17,18. In situ er septiner ofte lokalisert på steder med mikrometerkrumning; De finnes på divisjonsinnsnevringssteder, ved foten av cilia og dendritter, og ved ringrommet til spermatozoa19,20. Ved membranen synes rollen som septiner å være dobbel: de er involvert i å omforme lipid dobbeltlaget og i å opprettholde membranintegritet21. Derfor er det avgjørende å undersøke de biofysiske egenskapene til septinfilamentdannende proteiner og / eller underenheter ved membranen for å forstå deres rolle. For å dissekere spesifikke egenskaper til septiner i et godt kontrollert miljø, er bottom-up in vitro tilnærminger hensiktsmessige. Så langt har bare noen få grupper beskrevet de biofysiske egenskapene til septiner in vitro20,22,23. Derfor, sammenlignet med andre cytoskeletale filamenter, er den nåværende kunnskapen om oppførselen til septiner in vitro fortsatt begrenset.
Denne protokollen beskriver hvordan organisering av septinfilamenter, membranomforming og krumningsfølsomhet kan analyseres19. Til dette formål har en kombinasjon av optiske og elektronmikroskopiske metoder (fluorescensmikroskopi, kryo-elektronmikroskopi [cryo-EM] og skanningelektronmikroskopi [SEM]) blitt brukt. Membranomformingen av mikrometerstore gigantiske unilamellære vesikler (GUV) visualiseres ved hjelp av fluorescens optisk mikroskopi. Analysen av arrangementet og ultrastrukturen av septinfilamenter bundet til lipidvesikler utføres ved bruk av kryo-EM. Analyse av septinkrumningsfølsomhet utføres ved bruk av SEM, ved å studere oppførselen til septinfilamenter bundet til solidstøttet lipid dobbeltlag avsatt på bølgete substrater av variable krumninger, noe som muliggjør analyse av krumningsfølsomhet for både positive og negative krumninger. Sammenlignet med tidligere analyse20,24, foreslår vi her å bruke en kombinasjon av metoder for å grundig analysere hvordan septiner kan selvmontere, synergistisk deformere membran og være krumningsfølsom. Denne protokollen antas å være nyttig og tilpasningsdyktig til ethvert filamentøst protein som viser en affinitet for membraner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td></td>
			<td>Elmasonic S10H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bodipy-TR-Ceramide</td>
			<td>invitrogen, Thermo Fischer scientific</td>
			<td>11504726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>nikon</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk or confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>CPD300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water generator</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td>F1CA38083B</td>
			<td>MilliQ integral 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg L-&#945;-phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field Emission Gun SEM (FESEM)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Gemini SEM500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>50-262-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum grease, Dow corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD software</td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td></td>
			<td>software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids</td>
			<td>Eloise</td>
			<td>01883-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal evaporator</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>EM ACE600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA71, NOA81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxyde 4%</td>
			<td>delta microscopies</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>L&#246;ser</td>
			<td></td>
			<td>15 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td></td>
			<td>pascal 2005 SD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma generator</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing equipment</td>
			<td>leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>EMGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td></td>
			<td>Tecnai G2 200 kV, LaB6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>22451</td>
			<td>this product is not available for purchase any longer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax plates, Vitrex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up in vitro methods to assay the ultrastructural organization, membrane reshaping, and curvature sensitivity behavior of septins

Membranremodellering skjer konstant ved plasmamembranen og i cellulære organeller. For å fullstendig dissekere miljøets rolle (ioniske forhold, protein- og lipidsammensetninger, membrankrumning) og de forskjellige partnerne knyttet til spesifikke membranomformingsprosesser, foretar vi in vitro bottom-up-tilnærminger. I de senere år har det vært stor interesse for å avsløre rollen som septinproteiner assosiert med store sykdommer. Septiner er essensielle og allestedsnærværende cytoskeletale proteiner som interagerer med plasmamembranen. De er involvert i celledeling, cellemotilitet, nevromorfogenese og spermiogenese, blant andre funksjoner. Det er derfor viktig å forstå hvordan septiner interagerer og organiserer seg ved membraner for senere å indusere membrandeformasjoner og hvordan de kan være følsomme for spesifikke membrankrumninger. Denne artikkelen tar sikte på å dechiffrere samspillet mellom ultrastrukturen til septiner på molekylært nivå og membranremodellering som forekommer på mikronskala. Til dette formål ble spirende gjær og pattedyr septinkomplekser rekombinant uttrykt og renset. En kombinasjon av in vitro-analyser ble deretter brukt til å analysere selvmontering av septiner ved membranen. Støttede lipid dobbeltlag (SLBer), gigantiske unilamellære vesikler (GUV), store unilamellære vesikler (LUV) og bølgete substrater ble brukt til å studere samspillet mellom septin selvmontering, membranomforming og membrankrumning.

GUVs deformasjoner Typiske konfokale fluorescensbilder av GUV-er omformet etter å ha blitt inkubert med septiner vises i figur 3, under forhold der septiner polymeriseres. Bare GUVs (figur 3A) var perfekt sfæriske. Ved inkubasjon med mer enn 50 nM spirende gjærseptinfilamenter virket vesiklene deformerte. Opp til en konsentrasjon på 100 nM spirende gjærseptinoktamerer syntes vesiklene fasetterte, og deformasjonene forble statiske og svin...

Watch this Scientific Journal Video about Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins at JoVE.com

Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

Septiner er cytoskeletale proteiner. De samhandler med lipidmembraner og kan fornemme, men også generere membrankrumning på mikronskalaen. Vi beskriver i denne protokollen bottom-up in vitro metoder for analyse av membrandeformasjoner, krumningsfølsom septinbinding og septinfilament ultrastruktur.

Bottom-Up In Vitro-metoder for å analysere den ultrastrukturelle organisasjonen, membranomformingen og krumningsfølsomhetsoppførselen til septiner

Membrane remodeling occurs constantly at the plasma membrane and within cellular organelles. To fully dissect the role of the environment (ionic ...

Ved hjelp av denne protokollen visualiserte vi organiseringen av cytoskeletale filamentøse proteiner på mønstersubstrater som viser forskjellige krumninger. Vi kan teste krumningsfølsomheten. Oppløsningen av skanning elektronmikroskop bilder er høy nok til at nanometer skala organisasjoner er visualisert.Metodene vi bruker for fiksering er milde nok til å bevare den intrastrukturelle organisasjonen av proteinet. Dette forblir i omfanget av grunnleggende forskning for å forstå oppførselen til cytoskeletale filamenter. Begynn med å designe en bølget Norland Optical Adhesive, eller NOA kopi, i et rent rom miljø fra bølgete polydimetylsiloksan bølget mønstre av 250 nanometer amplitude og to mikrometer lateral periodicitet.For å gjøre det, deponer fem mikroliter flytende NOA på en sirkulær glassdeksel med en centimeter diameter og plasser deretter PDMS-malen på dråpen. Behandle forsamlingen med UV-lys ved 320 nanometer i fem minutter for å fotopolymerisere flytende NOA til en tynn polymerfilm. Når du er ferdig, skrell forsiktig av PDMS-malen fra dekselet med den nypolymeriserte NOA.Behandle NOA-filmen med en luftplasmarenser i fem minutter for å gjøre overflaten hydrofil. Forbered en løsning av små unilamellære vesikler, eller SUVer, som beskrevet i manuskriptet, og oppnå SUVene ved å resuspendere en tørket lipidfilm i observasjonsbufferen under sonikering i en badsonikator i fem til 10 minutter til løsningen er gjennomsiktig. Senere setter du inn dekselslippene som støtter NOA-mønstrene i brønnene i cellekulturbokser og inkuberer de nyglødede NOA-mønstrene med 100 mikroliter en milligram per milliliter SUV-løsning i 30 minutter ved romtemperatur for å generere et støttet lipid-dobbeltlag.For å fjerne den ubrukte SUV-en, skyll sidene grundig seks ganger med septin lav saltbuffer uten å la prøven tørke helt mellom to vasker. Fortynn den octomeriske septinoppløsningen i en septin lav saltbuffer til endelige konsentrasjoner, alt fra 10 til 100 nanomolar og volumer på en milliliter. Deretter inkuberer du proteinoppløsningen på lysbildene i en time ved romtemperatur.Vask NOA-lysbildene som inneholder smeltet støttet lipid dobbeltlag og inkuber protein med septin lav saltbuffer. Erstatt septin lav saltbuffer med 2% glutaraldehydfiksativ løsning i 0,1 molar natriumkakodylatbuffer, forvarmet ved 37 grader Celsius, og la reaksjonen fortsette i 15 minutter, og vask den faste prøven tre ganger, fem minutter hver med 0,1 molar natriumkakodylat. Etter vask, inkuber prøven i den fiksative løsningen av osmiumtetroksid, deretter den filtrerte garvesyren og til slutt det filtrerte uranylacetatet i 10 minutter hver.Vask prøven tre ganger i destillert vann etter hver løsning. Inkuber prøven serielt i etanolløsninger fra 50% til 100% i to til tre minutter hver. Overfør glassglassene inne i tørketrommelen som er ferdigfylt med etanol, og følg produsentens instruksjoner for tørking.Siden tørkede prøver er svært hydroskopiske, belegg dem umiddelbart ved å feste dekselet til stubbene. Legg deretter en stripe sølvmaling på forsiden av dekselet uten å lage maling deglomerater. Forsikre deg om at forbindelsen med stubben er tilfredsstillende.Når prøven fordamper helt, bruk et apparat utstyrt med et plasmamagnetron sputtering hode og et roterende planetarisk stadium, og følg standardprotokoller levert av produsenten. Utfør pre-sputtering ved 120 milliampere i 60 sekunder for å fjerne oksidlaget på overflaten. Deretter deponerer 1, 5 nanometer wolfram med en filmtykkelsesmonitor ved 90 milliampere og en arbeidsavstand på 50 milliliter.Senere lagrer du prøvene under vakuum for å beskytte dem mot omgivelsesluften til og gjennom SEM-analysene. For å oppnå høy løsningsavbildning ved å oppdage sekundære elektroner med innlandsdetektoren, sett akselerasjonsspenningen til tre kilovolt og strålestrømmen til 20 mikrometer blenderåpning. For observasjoner, bruk oppløsninger fra 21,25 nanometer per piksel til 1,224 nanometer per piksel.Bruk en oppløsning på 5,58 nanometer per piksel for dataanalyse. Still inn arbeidsavstanden mellom en til to millimeter for høyoppløselig observasjon og rundt tre millimeter hvis en økt dybdeskarphet er nødvendig. Juster skannehastigheten og linjeintegrasjonen kontinuerlig for å sikre et konstant signal / støyforhold med en anskaffelsestid på rundt 30 til 45 sekunder per bilde.Den representative analysen illustrerer effekten av materialet som er avsatt på septinfilamentene på bølgete PDMS-mønstre med 1, 5 nanometer platina og 1, 5 nanometer wolfram. Det ble observert at nakne gigantiske unilamellære vesikler, eller GUV, var perfekt sfæriske. Etter den septininduserte deformasjonen syntes vesiklene fasetterte og deformasjonene forble statiske, og svingte dermed ikke.Ved høyere konsentrasjoner av septinene ble det observert periodiske deformasjoner i vesiklene. Selvmontering av septinfilamenter bundet til store unilamellære vesikler, eller LUV, ble undersøkt med et kryoelektronmikroskopibilde og 3D-rekonstruksjon ble oppnådd fra en vippet serie. Det krumningsavhengige arrangementet av septinfilamentene ble visualisert ved skanning av elektronmikroskopi.Ved lav forstørrelse var et bølget mønster med periodisiteten av negative og positive krumninger synlig. Den ultrastrukturelle organiseringen av septinfilamentene ble sett på ved høyere forstørrelse. NOA må skrelles forsiktig av for å forhindre nedbrytning.Etter avbildning kan noen bildeanalyse utføres for å kvantifisere ultrastrukturfunksjonene visualisert av SCM, for eksempel filamentavstand og orientering av filamentet. Den nåværende metoden har blitt brukt på septiner, men den kan også brukes til andre cytoskeletale proteiner eller proteiner som organiserer så lange filamenter og dermed er følsomme for krumning.

Research

JoVE Journal

Biology

Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Bottom-up og Shotgun Proteomikk å identifisere en omfattende Cochlea Proteome

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Who is Who? Non-invasive Methods to Individually Sex and Mark Altricial Chicks

Hvem er hvem? Ikke-invasive metoder for å Individuelt Sex og Mark altricial Chicks

Many experiments require early determination of offspring's sex as well as early marking of newborns for individual recognition. According to animal ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

In vitro Metylering analysen å studere Protein Arginin Metylering

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion Technique å etterforske Regulering av microvessel Permeabilitet i Rat mesenterium

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In vitro-analyse for å måle Fosfatidyletanolaminsyntese metyltransferase aktivitet

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Metoder for å finne alternative Arrangøren Bruk og transkripsjonsregulering av Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplett arbeidsflyt for analyse av Histone posttranslasjonelle modifikasjoner hjelp Bottom-up massespektrometri: Fra Histone Utvinning til dataanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation analysen å studere SUMO E3 Ligase aktivitet

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...