Name: bottom-up in vitro methods to assay the ultrastructural organization, membrane reshaping, and curvature sensitivity behavior of septins
Uploaded: 2022-08-17T13:10:00
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Agradecemos a Patricia Bassereau y Daniel Lévy por sus útiles consejos y discusiones. Este trabajo contó con el apoyo de la ANR (Agence Nationale de la Recherche) para financiar el proyecto "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, y el proyecto "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin está financiado por la Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" y la Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa fue apoyado por la Universidad de la Sorbona (AAP Emergence). G.H. Koenderink recibió el apoyo de la Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) a través del 'BaSyC-Building a Synthetic Cell'. Beca de gravitación (024.003.019). Agradecemos a Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) y Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Agradecemos al Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, miembro de la Infraestructura Nacional de Investigación de Francia-BioImaging (ANR10-INBS-04).

1. Determinación de la remodelación de la membrana utilizando vesículas unilamelares gigantes (GUV)
NOTA: En esta sección, los GUV se generan para imitar las deformaciones de la membrana posiblemente inducidas por las septinas en un contexto celular. De hecho, en las células, las septinas se encuentran con frecuencia en sitios con curvaturas micrométricas. Los GUV tienen tamaños que van desde unos pocos hasta decenas de micrómetros y pueden deformarse. Por lo tanto, son ...

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	<li>Finger, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reining+in+cytokinesis+with+a+septin+corral.">Reining in cytokinesis with a septin corral.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).</li><li>Barral, Y., Kinoshita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+shed+light+onto+septin+assemblies+and+function.">Structural insights shed light onto septin assemblies and function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).</li><li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+septin+diffusion+barrier+at+the+base+of+the+primary+cilium+maintains+ciliary+membrane+protein+distribution.">A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution.</a> Science. 329 (5990), 436-439 (2010).</li><li>Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+septin+family+in+spermiogenesis.">The role of the septin family in spermiogenesis.</a> Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).</li><li>Addi, C., Bai, J., Echard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+microtubule,+septin+and+ESCRT+filament+remodeling+during+late+steps+of+cytokinesis.">Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).</li><li>Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+microtubule-dependent+transport+by+septin+GTPases.">Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases.</a> Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).</li><li>Spiliotis, E. T., Nakos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+functions+of+actin-+and+microtubule-associated+septins.">Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins.</a> Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).</li><li>Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Po&#252;s, C., Baillet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+its+BORG2+and+BORG3+effectors+control+the+subcellular+localization+of+septins+between+actin+stress+fibers+and+microtubules.">Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules.</a> Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).</li><li>Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+septin-dependent+diffusion+barrier+at+dendritic+spine+necks.">A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks.</a> PloS One. 9 (12), 113916 (2014).</li><li>Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+surface+protein+of+guinea+pig+sperm+exhibits+free+diffusion+in+its+domain.">A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain.</a> The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).</li><li>Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-dependent+compartmentalization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+yeast+polarized+growth.">Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth.</a> The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).</li><li>Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+septin+cytoskeleton+facilitates+membrane+retraction+during+motility+and+blebbing.">The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing.</a> The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).</li><li>Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+functions+in+organ+system+physiology+and+pathology.">Septin functions in organ system physiology and pathology.</a> Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).</li><li>Angelis, D., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+mutations+in+human+cancers.">Septin mutations in human cancers.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).</li><li>Takehashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+3+gene+polymorphism+in+Alzheimer's+disease.">Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease.</a> Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).</li><li>Shuman, B., Momany, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septins+from+protists+to+people.">Septins from protists to people.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+septins:+supramolecular+organization+of+heterooligomers+and+the+mechanism+of+filament+assembly.">Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).</li><li>Iv, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+animal+septins+using+recombinant+human+septin+octamers+with+distinct+SEPT9+isoforms.">Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms.</a> Journal of cell science. 134 (15), (2021).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reshaping+by+micrometric+curvature+sensitive+septin+filaments.">Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments.</a> Nature communications. 10 (1), 420 (2019).</li><li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+plasma+membrane+curvature+is+recognized+by+the+septin+cytoskeleton.">Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton.</a> The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li><li>Patzig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin/anillin+filaments+scaffold+central+nervous+system+myelin+to+accelerate+nerve+conduction.">Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction.</a> eLife. 5, 17119 (2016).</li><li>Szuba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+binding+controls+ordered+self-assembly+of+animal+septins.">Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins.</a> eLife. 10, 63349 (2021).</li><li>Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-mediated+uniform+bracing+of+phospholipid+membranes.">Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes.</a> Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+promotes+budding+yeast+septin+filament+assembly+and+organization.">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization.</a> Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin-based+readout+of+PI(4,5)P2+incorporation+into+membranes+of+giant+unilamellar+vesicles.">Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles.</a> Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).</li><li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD.">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-100+nm+wrinkling+of+polydimethylsiloxane+by+double+frontal+oxidation.">Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation.</a> Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).</li><li>Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontal+vitrification+of+PDMS+using+air+plasma+and+consequences+for+surface+wrinkling.">Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling.</a> Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).</li><li>Franck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+plaques+and+associated+actin+anchor+intermediate+filaments+in+skeletal+muscle.">Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).</li><li>Elkhatib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+clathrin/AP-2+lattices+pinch+collagen+fibers+to+support+3D+cell+migration.">Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration.</a> Science. 356 (6343), (2017).</li><li>Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+thin+coatings+of+Au/Pd,+Pt+and+Cr+produced+by+magnetron+sputtering+for+FE-SEM.">A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM.</a> Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).</li></ol>

Como se indicó anteriormente, se ha utilizado una mezcla lipídica que mejora la incorporación de PI(4,5)P2 dentro de la bicapa lipídica y, por lo tanto, facilita las interacciones septina-membrana. De hecho, hemos demostrado en otra parte25 que las septinas de levadura en ciernes interactúan con las vesículas de una manera específica de PI(4,5)P2. Esta composición lipídica se ajustó empíricamente a partir del cribado de múltiples composiciones y ahora es ampliamen...

Las septinas son proteínas formadoras de filamentos citoesqueléticos que interactúan con las membranas lipídicas. Las septinas son ubicuas en los eucariotas y esenciales para numerosas funciones celulares. Han sido identificados como los principales reguladores de la división celular en levaduras y mamíferos en ciernes 1,2. Están involucrados en eventos de remodelación de membrana, ciliogénesis3 y espermiogénesis4. Dentro de las células de mamíferos, las septinas también pueden interactuar con actina y microtúbulos 5,6,7 de manera dependiente de Rho GTPasas (BORG) 8. En diversos tejidos (neuronas9, cilios3, espermatozoides10), las septinas han sido identificadas como reguladores de barreras de difusión para componentes unidos a la membrana11. También se ha demostrado que las septinas regulan el blebbing de la membrana y la formación de protrusión12. Las septinas, al ser proteínas multitarea, están implicadas en la aparición de diversas enfermedades prevalentes13. Su mala regulación está asociada con la aparición de cánceres14 y enfermedades neurodegenerativas15.
Dependiendo del organismo, varias subunidades de septina (dos en Caenorhabditis elegans a 13 en humanos) se ensamblan para formar complejos cuya organización varía de manera dependiente del tejido16. El bloque de construcción básico de septina reúne de dos a cuatro subunidades, presentes en dos copias y autoensambladas de una manera palindrómica similar a una varilla. En la levadura en ciernes, las septinas son octaméricas17,18. In situ, las septinas a menudo se localizan en sitios con curvatura micrométrica; Se encuentran en sitios de constricción de división, en la base de cilios y dendritas, y en el anillo de los espermatozoides19,20. En la membrana, el papel de las septinas parece ser dual: están implicadas en la remodelación de la bicapa lipídica y en el mantenimiento de la integridad de la membrana21. Por lo tanto, investigar las propiedades biofísicas de las proteínas formadoras de filamentos de septina y / o subunidades en la membrana es crucial para comprender su papel. Para diseccionar las propiedades específicas de las septinas en un ambiente bien controlado, los enfoques in vitro de abajo hacia arriba son apropiados. Hasta ahora, sólo unos pocos grupos han descrito las propiedades biofísicas de las septinas in vitro20,22,23. Por lo tanto, en comparación con otros filamentos citoesqueléticos, el conocimiento actual sobre el comportamiento de las septinas in vitro sigue siendo limitado.
Este protocolo describe cómo se puede analizar la organización de los filamentos de septina, la remodelación de la membrana y la sensibilidad a la curvatura19. Con este fin, se ha utilizado una combinación de métodos de microscopía óptica y electrónica (microscopía de fluorescencia, microscopía crioelectrónica [cryo-EM] y microscopía electrónica de barrido [SEM]). La remodelación de la membrana de vesículas unilamelares gigantes (GUV) de tamaño micrométrico se visualiza utilizando microscopía óptica de fluorescencia. El análisis de la disposición y ultraestructura de los filamentos de septina unidos a vesículas lipídicas se realiza mediante crio-EM. El análisis de la sensibilidad a la curvatura de septina se lleva a cabo mediante SEM, mediante el estudio del comportamiento de los filamentos de septina unidos a bicapas lipídicas sólidas depositadas sobre sustratos ondulados de curvaturas variables, lo que permite el análisis de la sensibilidad a la curvatura tanto para curvaturas positivas como negativas. En comparación con el análisis anterior20,24, aquí proponemos utilizar una combinación de métodos para analizar a fondo cómo las septinas pueden autoensamblarse, deformar sinérgicamente la membrana y ser sensibles a la curvatura. Se cree que este protocolo es útil y adaptable a cualquier proteína filamentosa que muestre una afinidad por las membranas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td></td>
			<td>Elmasonic S10H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bodipy-TR-Ceramide</td>
			<td>invitrogen, Thermo Fischer scientific</td>
			<td>11504726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>nikon</td>
			<td></td>
			<td>spinning disk or confocal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>CPD300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water generator</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td>F1CA38083B</td>
			<td>MilliQ integral 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg L-&#945;-phosphatidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field Emission Gun SEM (FESEM)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Gemini SEM500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>50-262-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum grease, Dow corning</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD software</td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td></td>
			<td>software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids</td>
			<td>Eloise</td>
			<td>01883-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal evaporator</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>EM ACE600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA71, NOA81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxyde 4%</td>
			<td>delta microscopies</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>L&#246;ser</td>
			<td></td>
			<td>15 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td></td>
			<td>pascal 2005 SD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma generator</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing equipment</td>
			<td>leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>EMGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Thermofischer</td>
			<td></td>
			<td>Tecnai G2 200 kV, LaB6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>22451</td>
			<td>this product is not available for purchase any longer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax plates, Vitrex</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up in vitro methods to assay the ultrastructural organization, membrane reshaping, and curvature sensitivity behavior of septins

La remodelación de la membrana ocurre constantemente en la membrana plasmática y dentro de los orgánulos celulares. Para diseccionar completamente el papel del medio ambiente (condiciones iónicas, composiciones de proteínas y lípidos, curvatura de membrana) y los diferentes socios asociados con procesos específicos de remodelación de membranas, emprendemos enfoques ascendentes in vitro . En los últimos años, ha habido un gran interés en revelar el papel de las proteínas septina asociadas con las principales enfermedades. Las septinas son proteínas citoesqueléticas esenciales y ubicuas que interactúan con la membrana plasmática. Están implicados en la división celular, la motilidad celular, la neuromorfogénesis y la espermiogénesis, entre otras funciones. Por lo tanto, es importante comprender cómo las septinas interactúan y se organizan en las membranas para inducir posteriormente deformaciones de la membrana y cómo pueden ser sensibles a curvaturas específicas de la membrana. Este artículo tiene como objetivo descifrar la interacción entre la ultraestructura de las septinas a nivel molecular y la remodelación de la membrana que se produce a escala micrométrica. Con este fin, la levadura en ciernes y los complejos de septina de mamíferos se expresaron y purificaron recombinantemente. Luego se utilizó una combinación de ensayos in vitro para analizar el autoensamblaje de septinas en la membrana. Se utilizaron bicapas lipídicas soportadas (SLB), vesículas unilamelares gigantes (GUV), vesículas unilamelares grandes (LUV) y sustratos ondulados para estudiar la interacción entre el autoensamblaje de septinas, la remodelación de la membrana y la curvatura de la membrana.

Deformaciones de GUVs Las imágenes típicas de fluorescencia confocal de GUVs remodelados después de ser incubados con septinas se muestran en la Figura 3, en condiciones donde las septinas polimerizan. Los GUV desnudos (Figura 3A) eran perfectamente esféricos. Tras la incubación con más de 50 nM de filamentos de septina de levadura en ciernes, las vesículas parecían deformadas. Hasta una concentración de 100 nM de octámeros de septi...

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Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

Las septinas son proteínas citoesqueléticas. Interactúan con las membranas lipídicas y pueden sentir, pero también generar curvatura de la membrana a escala de micras. Describimos en este protocolo metodologías in vitro ascendentes para analizar deformaciones de membrana, unión de septina sensible a la curvatura y ultraestructura de filamentos de septina.

Métodos in vitro ascendentes para evaluar la organización ultraestructural, la remodelación de la membrana y el comportamiento de sensibilidad a la curvatura de las septinas

Membrane remodeling occurs constantly at the plasma membrane and within cellular organelles. To fully dissect the role of the environment (ionic ...

Usando este protocolo, visualizamos la organización de proteínas filamentosas citoesqueléticas en sustratos de patrón que muestran varias curvaturas. Podemos probar la sensibilidad de la curvatura. La resolución de las imágenes de microscopio electrónico de barrido es lo suficientemente alta como para que se visualicen las organizaciones a escala nanométrica.Los métodos que utilizamos para la fijación son lo suficientemente suaves como para preservar la organización intraestructural de la proteína. Esto permanece en el ámbito de la investigación fundamental para comprender el comportamiento de los filamentos citoesqueléticos. Comience diseñando un adhesivo óptico Norland ondulado, o réplica de NOA, en un entorno de sala limpia a partir de patrones ondulados de polidimetilsiloxano ondulado de 250 nanómetros de amplitud y periodicidad lateral de dos micrómetros.Para ello, deposite cinco microlitros de NOA líquido en un cubreobjetos de vidrio circular de un centímetro de diámetro y luego coloque la plantilla PDMS en la gota. Trate el conjunto con luz UV a 320 nanómetros durante cinco minutos para fotopolimerizar el NOA líquido en una película delgada de polímero. Una vez hecho esto, retire suavemente la plantilla PDMS de la cubierta con el NOA recién polimerizado.Trate la película de NOA con un filtro de plasma de aire durante cinco minutos para hacer que la superficie sea hidrófila. Prepare una solución de pequeñas vesículas unilamelares, o SUV, como se describe en el manuscrito, y obtenga los SUV resuspendiendo una película lipídica seca en el tampón de observación bajo la sonicación en un sonicador de baño durante cinco a 10 minutos hasta que la solución sea transparente. Más tarde, inserte los cubreobjetos que soportan los patrones de NOA dentro de los pocillos de las cajas de cultivo celular e incube los patrones de NOA recién descargados con 100 microlitros de una solución SUV de un miligramo por mililitro durante 30 minutos a temperatura ambiente para generar una bicapa lipídica soportada.Para retirar el SUV sin fusionar, enjuague bien los lados seis veces con el tampón de sepina baja en sal sin dejar que la muestra se seque completamente entre dos lavados. Diluir la solución madre de septina octomérica en un tampón de septina baja en sal hasta concentraciones finales, que van de 10 a 100 nanomolares y volúmenes de un mililitro. Luego, incubar la solución de proteína en los portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente.Lave los portaobjetos NOA que contienen bicapas lipídicas soportadas fusionadas e incube proteínas con tampón de septina baja en sal. Reemplace el tampón de septina baja en sal con solución fijadora de glutaraldehído al 2% en tampón de cacodilato de sodio molar de 0.1, precalentado a 37 grados centígrados, y deje que la reacción continúe durante 15 minutos, y lave la muestra fija tres veces, cinco minutos cada uno con cacodilato de sodio 0.1 molar. Después del lavado, incube la muestra en la solución fijadora de tetróxido de osmio, luego el ácido tánico filtrado y finalmente el acetato de uranilo filtrado durante 10 minutos cada uno.Lave la muestra tres veces en agua destilada después de cada solución. Incubar la muestra en serie en soluciones de etanol a partir del 50% al 100% durante dos o tres minutos cada una. Transfiera los portaobjetos de vidrio dentro del secador de punto crítico precargado con etanol y siga las instrucciones del fabricante para el secado.Como las muestras secas son altamente hidroscópicas, cúbralas inmediatamente uniendo el cubreobjetos a los talones. Luego agregue una tira de pintura plateada a la cara superior del deslizamiento de la cubierta sin crear deglomerados de pintura. Asegúrese de que la conexión con el talón sea satisfactoria.Cuando la muestra se evapore por completo, utilice un aparato equipado con un cabezal de pulverización catódica de magnetrón de plasma y una etapa planetaria rotativa, y siga los protocolos estándar proporcionados por el fabricante. Realice la pulverización catódica a 120 miliamperios durante 60 segundos para eliminar la capa de óxido en la superficie. Luego deposite 1,5 nanómetros de tungsteno con un monitor de espesor de película a 90 miliamperios y una distancia de trabajo de 50 mililitros.Posteriormente, almacene las muestras al vacío para protegerlas del aire ambiente hasta y durante los análisis SEM. Para lograr una alta solución de imágenes mediante la detección de los electrones secundarios con el detector interior, ajuste el voltaje de aceleración a tres kilovoltios y la corriente del haz a una apertura de 20 micrómetros. Para las observaciones, use resoluciones que van desde 21.25 nanómetros por píxel hasta 1.224 nanómetros por píxel.Utilice una resolución de 5,58 nanómetros por píxel para el análisis de datos. Establezca la distancia de trabajo entre uno y dos milímetros para la observación de alta resolución y alrededor de tres milímetros si se requiere una mayor profundidad de campo. Ajuste la velocidad de escaneo y la integración de la línea continuamente para garantizar una relación señal / ruido constante con un tiempo de adquisición de alrededor de 30 a 45 segundos por imagen.El análisis representativo ilustra el efecto del material depositado sobre los filamentos de septina sobre patrones PDMS ondulados con 1,5 nanómetros de platino y 1,5 nanómetros de tungsteno. Se observó que las vesículas unilamelares gigantes desnudas, o GUV, eran perfectamente esféricas. Después de la deformación inducida por septina, las vesículas aparecieron facetadas y las deformaciones permanecieron estáticas, y por lo tanto no fluctuaron.A concentraciones más altas de las septinas, se observaron deformaciones periódicas en las vesículas. El autoensamblaje de los filamentos de septina unidos a grandes vesículas unilamelares, o LUV, se examinó con una imagen de microscopía crioelectrónica y se obtuvo la reconstrucción 3D a partir de una serie inclinada. La disposición dependiente de la curvatura de los filamentos de septina se visualizó mediante microscopía electrónica de barrido.A baja magnificación, un patrón ondulado con la periodicidad de curvaturas negativas y positivas era visible. La organización ultraestructural de los filamentos de septina se observó con mayor aumento. Los NOA deben despegarse suavemente para evitar la degradación.Después de la obtención de imágenes, se puede realizar un análisis de imágenes para cuantificar las características de la ultraestructura visualizadas por SCM, como el espaciado del filamento y la orientación del filamento. El presente método se ha aplicado a las septinas, pero también podría usarse para otras proteínas citoesqueléticas o proteínas que se organizan como filamentos largos y, por lo tanto, son sensibles a la curvatura.

Research

JoVE Journal

Biology

Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

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Investigación

Biología

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